细菌脂多糖免疫对结肠炎小鼠TNF-α-表达的影响-(2)汇总.doc

细菌脂多糖免疫对结肠炎小鼠TNF-α表达的影响

[摘要]目的：为了研究细菌脂多糖免疫对结肠炎小鼠TNF-α表达的影响并探讨炎症性肠炎的发生机制。方法：设计动物模型实验，将30只BALB/C小鼠随机分为三组：观察组10只（注射细菌脂多糖免疫后诱导小鼠溃疡性结肠炎模型）、模型组10只（注射生理盐水后诱导小鼠溃疡性结肠炎模型）和对照组10只（不做任何处理并注射生理盐水），4周后处死并取结肠组织标本检测，统计炎症介质TNF-α的表达情况并进行比较。结果：观察组血清TNF-αmRNA含量均值为（16.36±1.28）%，结肠TNF-α含量均值为（23.25±2.15）%，数据结果与其他两组差异具有统计学意义（P<0.05）。病理切片观察结果：观察组小鼠的溃疡点、靡烂点个数均较模型组明显减少，同时炎症细胞浸润和杯状细胞减少程度也明显较轻。结论：细菌脂多糖可降低小鼠结肠粘膜TNF-α及血清TNF-α的含量，在病理切片结果中可明显观察到经过LPS免疫小鼠的病理状态明显减轻，这可能为其对溃疡性结肠炎的治疗提供理论依据。
[关键词]细菌脂多糖；溃疡性结肠炎；肿瘤坏死因子

Effect of LSP on the expression of TNF- α immunity in mice with colitis
[Abstract] Objective: To study the influence of LSP on the expression of TNF- α immunological colitis in mice and to explore the mechanisms of IBD. Methods: the experiment animal model design, 30 male BALB/C mice were randomly divided into three groups: the observation group 10 (IBD models were induced by injection of LSP after immunization), 10 rats in model group (IBD mice models were induced by injection of saline) and 10 in control group (without any treatment and injection of physiological saline), 4 weeks after the colon tissue samples were taken for detection, and compared the expression of inflammatory mediators in TNF- α statistics. Results: in the observation group, serum TNF- α mRNA content was (16.36 ± 1.28)%, the mean content of TNF- α colon was (23.25 ± 2.15)%, with statistical significance of data and other differences between the two groups (P<0.05). Pathological observation: the number of the observation group mice ulcer, corrupt are compared with model group were significantly reduced, and the infiltration of inflammatory cells and goblet cells decreased significantly lighter.Conclusion: LSP can reduce the content of the colon mucosa of TNF- α and serum TNF- α, in pathological results can be clearly observed the pathological state of mice immunized with LPS significantly reduced, which may provide a theoretical basis for the treatment of ulcerative coliti
[Keywords]LSP; IBD; tumor necrosis factor

炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）是一类由多种不明病因引起的、异常免疫介导的肠道慢性及复发性炎症，有终身复发倾向，主要疾病类型有溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）和克罗恩病（Crohn disease,CD）。目前病因不明确，有学者认为环境、遗传、微生物感染和肠壁黏膜免疫异常，肠道黏膜损失等因素共同作用于IBD的发作[1]。以ELISA法检测IBD及其他胃肠道疾病患者抗结肠抗体时发现，溃疡性结肠炎患者抗结肠抗体出现率为36%，明显高于其他胃肠道疾病患者[2] 。细菌脂多糖（LPS）是革兰阴性菌的内毒素，在感染/炎症的发病机制中起着十分重要的作用。Toll蛋白家族在结构上有高度同源性,且均在天然免疫防御中起重要作用。目前有报道的TLR已达10种，其中TLR4多分布在巨噬细胞，B/T淋巴细胞及脾，肝，肺及胎盘等组织中，主要识别革兰氏阴性细菌表面的脂多糖（LPS），引起核转录因子NF-κB的活化及炎症因子的释放[3]。因此,笔者设计动物实验来研究实验性溃疡性结肠炎小鼠的血清和肠道的TNF-α表达情况，据此探讨炎症性肠病的发生机制，为炎症性肠病的预防与治疗提供理论依据。
1资料与方法
1.1实验资料 30只BALB/C雄性小鼠（SPF级）均由大连医科大学动物实验中心提供，体质量范围为22g-24g，平均为（23.2±1.1）g，均为7-8周龄，分组方法：30只小鼠按照随机数字表分为观察组、模型组和对照组三组，每组10只，观察组和模型组均首先通过三硝基苯磺酸(TNBS)／乙醇溶液灌肠诱导小鼠溃疡性结肠炎模型，观察组小鼠造模后注射细菌脂多糖免疫，模型组给予同等剂量的生理盐水，对照组小鼠不造模，正常饲养，与观察组和模型组小鼠同期给予等剂量的生理盐水。所有小鼠的在饲养过程中的环境条件符合中国国家标准《实验动物环境及设施》（GB14925-2001）对屏障动物实验设施的有关标准，对小鼠的饲养管理和实验操作符合《北京市实验动物管理条例》等法规的要求。
1.2给药方法：观察组小鼠使用细菌脂多糖进行免疫，具体方法为给予(LPS 1mg+NS 15 ml)+佐剂15ml,配制成终浓度0.03mg/ml(0.003mg/0.1ml)的试剂，用量为0.3mg/1000g,0.003mg/0.1ml/10g，小鼠腹腔注射（3ml+佐剂3ml），模型组小鼠与对照组小鼠分别给予适量的生理盐水+15 ml 完全弗氏佐剂,每次接种0.3mg/1000g，所有30只实验小鼠均每1周免疫1次，共4次，初次免疫加完全弗氏佐剂，以后免疫用不完全弗氏佐剂。
1.3造模方法[4] 观察组与模型组的实验小鼠均在末次免疫3周后禁食24小时，用5%水合氯醛0.15mL（或3%戊巴比妥）腹腔注射，使小鼠轻度麻醉，约25min以后用套接了涂有石蜡油的小号导尿管（直径1.5mm硅胶管）的1mL注射器抽吸TNBS乙醇溶液，从肛门将导尿管缓慢插入约3.5cm（3-4cm），然后将药液缓慢注入，停20s后抽出导尿管，再将小鼠倒悬约30s后放入盒中，自然清醒。
1.4标本采集 三组小鼠在同一时间范围内收集血清并制作标本，标本收集方法为：抓取小鼠，用镊子夹出眼球，放血至EP管，室温放置约1小时，3500rpm离心15分钟，收集血清至EP管，-200保存。标本制作方法为：处死小鼠，腹部消毒，无菌剖开腹部，分离结肠，留取距肛门4cm左右的结肠组织，沿肠系膜缘剪开肠腔，PBS冲洗粪便，H-E染色，其余标本锡箔包裹，液氮冷冻，-80℃保存，观察测量结肠的长度，拍照。
1.5 小鼠结肠组织病理学观察 无菌条件下摘取小鼠结肠，应用10％福尔马林固定24 h，脱水处理后石蜡包埋，每隔4 um连续切片，HE染色，光镜下观察小鼠结肠病理学特征。
1.6 ELISA法检测TNF-α在血清和结肠组织的表达：取血清及结肠组织样本严格按照小鼠放射免疫试剂盒说明书要求检测细胞因子TNF-α及结肠组织的表达情况。
1.7DAI评分标准 对各组小鼠按照以下表格进行DAI（溃疡性结肠炎疾病活动指数）评估[5]。

表1：DAI分值=（粪便粘稠度+体质量减轻率+血便）/3

1.7统计学处理 选择spss19.0统计学软件包进行分析，三组独立样本计量资料（平均值数据以均值加减标准差表示：）组间比较方法选择单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较方法选择LSD检验，独立样本计量资料组间比较方法选择t检验，均以0.05为差异具有统计学意义的标准，行双边检验。
2结果
2.1病理形态学的表现：在光镜下观察，对照组小鼠的结肠黏膜上皮完整、连续，腺体排列规则、结构清楚，无溃疡、无靡烂点及淋巴细胞浸润（见图1）。模型组小鼠结肠黏膜可见多个溃疡出现，靡烂点散在分布，黏膜淋B细胞浸渭严重t杯状细胞硪少明显（见图2）。观察组小鼠在溃疡点、靡烂点个数均较模型组明显减少，同时炎症细胞浸润和杯状细胞减少程度也明显较轻（见图3）。

图1：对照组小鼠病理典型代表图例

图2：模型组小鼠病理典型代表图例

图3：观察组小鼠病理典型代表图例
2.2 细菌脂多糖对溃疡性结肠炎血清TNF-α及结肠TNF-α含量的影响 观察组血清TNF-αmRNA含量均值为（16.36±1.28）%，结肠TNF-α含量均值为（23.25±2.15）%，F检验结果显示与其他两组实验小鼠数据不一致（P<0.05，拒绝H0假设，接受H1假设），LSD两两比较结果显示：观察组实验数据明显高于对照组（t=18.90，P<0.05），但明显低于模型组（t=8.94，P<0.05）,数据差异具有统计学意义，具体数据结果如下表2：

表2：三组小鼠实验数据统计结果表
组别
N
（只）
免疫剂量
血清TNF-αmRNA含量(%)
结肠TNF-α含量(%)
观察组
10
3ml+佐剂3ml
16.36±1.28
23.25±2.15
对照组
10
3mL生理盐水+佐剂3ml
15.50±1.01
16.42±1.87
模型组
10
3mL生理盐水+佐剂3ml
28.64±2.35
34.37±2.20
F值

25.58
16.71
P

<0.05
<0.05

2.3DAI评估结果 记录第五天到第十天时，观察组与模型组小鼠的出现明显的体质量降低和粘稠（糊状）血便表现，两组小鼠DAI评分结果差异无统计学意义[（3.5±0.2）分VS（3.4±0.3）分]（t=1.12，P>0.05），而正常对照组没有出现上述异常生理表现。从第十天开始，经过LSP免疫的模型组不再出现明显的体质量减轻现象，粪便逐渐成形，评分结果明显高于模型组DAI评分结果[（3.4±0.3）分VS（2.7±0.2）分]（t=7.85，P<0.05）。
3讨论
本研究通过动物实验观察细菌脂多糖免疫小鼠后诱导实验性炎症性肠病的炎症反应程度，检测炎症介质TNFα在血清和结肠组织的表达情况，首先通过病理形态观察结果进行定性分析：观察组小鼠在通过细菌脂多糖免疫后，溃疡点、靡烂点个数均较模型组明显减少，同时炎症细胞浸润和杯状细胞减少程度也明显较轻，结合对照组小鼠观察结果可以推断出细菌脂多糖可降低小鼠结肠粘膜TNF-α及血清TNF-α的含量。通过ELISA法检测TNF-α在血清和结肠组织的表达情况来进行定量分析，实验数据表明了结肠炎小鼠在经过细菌脂多糖免疫后，其血清TNF-αmRNA含量和结肠TNF-α含量均有明显的改善，与模型组数据结果相比，差异具有统计学意义，由此可以进一步得出结论：细菌脂多糖可降低小鼠结肠粘膜TNF-α及血清TNF-α的含量，这可能为其对溃疡性结肠炎的治疗提供理论依据。
革兰阴性菌细胞壁外膜的重要成分之一是细菌内毒素，它在细菌的感染机制中发挥着重要作用，也被认为是引起全身性炎症综合症的主要物质之一。LPS在人体内能够刺激巨噬细胞和单核细胞，促使细胞因子的分泌，进而引起病理生理的损伤。但是少量的LPS不但能够使单核巨噬细胞系统活化，而且能够加速内源性细胞因子的释放。通过动物实验我们发现[6-7]：短期内给予实验动物致死剂量的内毒素后，因为内毒素而产生的发热或者休克等生理表现消失，这种现象称为内毒素耐受。内毒素耐受在生物体内是一种保护性调节机制，是生物体在长期的进化过程中形成的，它能防止内毒素对机体持续的、过度的刺激，对增强机体的防御功能具有重要的意义。
实验中选择炎症介质TNF-α的表达情况作为判断溃疡性结肠炎病情的指标，主要是因为TNF-α炎症因子能够准确的反映出小鼠结肠炎情况，相关文献报道[8-9]，利用炎症介质TNF-α的抗体治疗结肠炎具有起效快、治疗预后效果好的特点，并且在用药2月后再给药，能够有效预防结肠炎的复发，这也近一步说明了TNF-α炎症因子是导致结肠炎发病的关键因子。从这一点出发，结合相关文献[10-13]探讨炎症性肠炎的发生机制如下：TNF炎症因子有两个亚型：TNF-α和TNF-β，均属于促炎细胞因子，主要由巨噬细胞和单核细胞分泌产生，能够参与细胞的免疫反应过程中，而参与体液免疫反应的抗炎性因子主要包括由免疫T细胞分泌产生的IL-4，IL-5，IL-10和IL-13等，这些抗炎细胞因子和促炎细胞因子之间的分泌代谢失衡，是引起结肠炎发病的重要作用机制之一，最后，关于炎症性肠炎的免疫学发病机制有一个被广泛认同的观点，即炎症性肠炎患者体内的肠道免疫系统对自身的抗原（或者外来抗原）出现异常反应而致病，但是自身免疫反应产生的方式和损伤机制还没有统一的定论，需要进行进一步的研究。
参考文献：
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