CD4+和CD8+T-淋巴细胞检测操作细则.docx

CD4+和CD8+T 淋巴细胞检测操作细则
1.目的
根据《全国艾滋病检测技术规范》(2009年修订版)，对CD4+和CD8+T 淋巴细胞检测(流式细胞仪FACSCalibur）的操作进行细化，以规范本中心CD4+和CD8+T 淋巴细胞检测工作，保证结果准确。
2.适用范围
本操作细则适用于本中心CD4+和CD8+T T淋巴细胞检测。
3.职责
3.1检测人员负责按本操作细则进行CD4+和CD8+T T淋巴细胞检测。
3.2复核人员负责对CD4+和CD8+T T淋巴细胞检测操作及结果进行复核。
3.3科室负责人负责对检测工作进行综合管理。
4.操作程序
4.1方法：流式细胞仪单平台法。
4.2设备：生物安全柜、振荡器、移液器、流式细胞仪FACSCalibur.
4.4试剂：经国家食品药品监督管理局注册批准，批批检合格，在有效期内的商用CD4+和CD8+的检测试剂。
4.5检测步骤
4.5.1标本制备：
4.5.1.1将试剂盒取出置于室温，平衡30分钟。然后按需要取出相应数目的绝对计数管TruCount Tube，按顺序依次编号。
4.5.1.2 用反向加样法在Tube中加入50ul充分混匀的抗凝全血，注意血不要碰到试管底部的微球（Beads）。
4.5.1.3 取20ul 荧光抗体加入到管中，注意：不要碰到血。涡旋混匀，室温避光放置15min。
4.5.1.4 取出加入450ul 1×FACS 溶血素，充分混匀，避光放置15min。
4.5.1.5 24小时内上机用MultiSET软件获取细胞进行检测，上机前应充分混匀。
4.5.2.FACSCalibur上机操作：
4.4.2.1 执行FACSCalibur开机程序，进入MultiTEST软件。
4.4.2.2 在出现的“Sign in”窗口中输入操作者姓名、单位、领导姓名等相关信息，计算机将保存这些信息，单击“Accept”。
4.4.2.3 进入“Set up”窗口：在“Data Source”对话框中选择“From Cytometer: Acquisition and Analysis”， 在“Entry Level File Name Prefix”中选择“Sample name”； 在“Automatic Saving Options”中选择“Data File”、“Laboratory Report”、“Physician Report”，软件会自动生成一个文件，文件的默认路径Facstation\BD file\ Multiset \DDMMYY文件夹；在“View Reports”中选择“Until ‘Next’Button Pressed”。
4.4.2.4 单击“Accept”，进入“FACSComp”窗口，单击“Skip FACSComp”。
4.4.2.5 进入“Test Prefs”窗口，在“Physician Report Choices”中，这一项可以是全选，运行了一种试剂，会自动报告相应的结果。在窗口的最下方点“Lot Ids”，跳出一窗口,点此窗口左侧的“Absolute Count Beads”,在此窗口右侧输入TruCount tube的批号和Beads总数（标在包装袋上），单击“Save”。单击“Accept”。
4.4.2.6 进入“Samples”窗口，在表格中输入相应的Patient Name、ID、Case Number，在Panel中选择CD4/8/3 Truc.
4.4.2.7 在窗口最上方的“Cytometer”的下拉菜单中，单击“Instrument Setting”，在出现的新对话框中单击“Open”；打开此路径下Facstation\BD file\ Instrument Setting\ Calibur.LNW文件。调用仪器各个参数的条件，选好后单击“Set”，“Done”.
4.4.2.8 单击“Run Tests”，上样，调整SSC电压和阈值后，单击“Acquire”。
4.4.2.9 获取完成后，可以人工调整各个门的大小，单击“Continue”；打印“Phys Report”。继续下一个实验，或单击“Quit”，“Don’t Save”，退出MultiTest软件。
4.4.2.10 执行FACSCalibur关机机程序后，依次关闭电脑、仪器、稳压器、变压器。
4.4.2.11 将仪器的压力阀打到减压位置。
4.5.4注意事项
4.5.4.1 样本使用EDTA抗凝全血，室温放置，24小时内处理，处理前充分混匀。
4.5.4.2 取血时要采用反向加样法，即加样枪吸取血样时，打到第二档，放时打到第一档，保证血量的准确，减少误差。
4.5.4.3 染色和溶血步骤应在室温避光进行，并充分混匀过程中，尽量防止血样的飞溅，以免血样留在管壁上。
4.5.4.4 本实验为免洗试剂，操作简单，减少细胞的丢失提高工作效率和计数精确度。
4.5.4.5 TruCOUNT管2-25°C保存，从冰箱取出后，应恢复室温再打开封条，保证TruCOUNT管包装袋密闭，袋内干燥剂变成粉红色时，TruCOUNT管应弃去不用.
4.5.4.6 遵守HIV实验管理规范和生物安全守则。
4.5.4.7 严格防止交叉感染，操作时必须戴手套，穿着工作衣。
4.5.4.8 所有样品，洗涤液和各种废物、弃物都按传染物处理。
4.5.4.9 4剩余样品及废弃物应经121℃高压20分钟或用次氯酸钠等消毒剂处理30分钟，方可带出实验室。
4.5.4.10 每次实验完毕，用消毒液清洁工作台。
5.支持性文件
5.1《全国艾滋病检测技术规范》（2009年修订版）。
5.2流式细胞仪FACSCalibur中文操作手册和试剂使用说明书。