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双染法检测细胞凋亡
(2011-11-16 20:38:42)
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教育

    今天用Annexin V-EGFP/PI双染法检测树突状细胞的凋亡情况，存有下面几个问题：
    1、对照组细胞体积太少，根本不够调试细胞团位置（FSC和SSC参数）、自身荧光和荧光补偿的。大约需要3mL的细胞悬液才能够进行调试。
    2、正式上样检测时应该从对照管开始，也就是说前面用作仪器条件调试的还要重新走样。这样在编辑模板时，应该按照实际需要检测的样品管数进行设置。
    原理：
    在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V 是一种分子量为35.8KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS 高亲和力特异性结合。本试剂盒采用重组人Annexin VEGFP融合蛋白作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidine Iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V 与PI 匹配使用，就可以将亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来(图)。

   注意：
1、Annexin V-EGFP和碘化丙啶染液应该避光存放和使用。
2、碘化丙啶有毒，应小心保存和使用，注意个人保护。   
样品着色
1. 离心收集悬浮细胞，微量离心机转速2000RPM，离心时间5min，弃培养基。（贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消  化收集，胰酶消化时间不易过长，以防引起假阳性）
2. 用冷PBS 洗涤细胞两次（2000RPM，离心时间5min收集细胞）。
3. 用400ul 1X Binding Buffer 悬浮细胞，浓度大约为1 X 106 cells/ml。
4. 在细胞悬浮液中加入5ul Annexin V-EGFP，轻轻混匀后于2-8°C 避光条件下孵育15分钟。
5. 加入10ul PI 后轻轻混匀于2-8°C 避光条件下孵育5分钟。
6. 在1 小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。

A、流式细胞仪分析
    流式细胞仪激发光波长采用Ex.= 488nm双波长激发，Em.= 510 nm检测EGFP荧光(FL1 channel)和>575 nm的发射检测PI。细胞应可分成三个亚群：活细胞仅有很低的荧光强度，凋亡细胞有较强的绿色荧光，坏死细胞（包括极晚期凋亡细胞）有绿色和红色荧光双重染色。
使用流式细胞仪正确分析Annexin V-EGFP/PI 双染的细胞前要求仪器的荧光补偿来去除两种染料激发光之间的叠加。因为荧光补偿设置与PMT 的电压直接相关，所以不同仪器之间的补偿不同。建议在实验开始阶段分析经Annexin V、PI 分别单染的细胞来调整荧光补偿去除光谱重叠。
    根据未处理细胞空白对照和经Annexin V、PI 分别细胞染色后的单染对照的分析设定十字门的位置。
1. 上样未经染色的细胞，在线性FS-SS 点图上显示细胞并设门圈出目标细胞群体。
2. 建立LogFL1-LogFL2（最好用FL3）双参数点图并分析以上光散射图中设门的细胞；保证>98%的细胞处于在X、Y 轴Log 1 为边界的左下象限中心区域。
3. 检测Annexin V-EGFP 单染的细胞并检查FL1-FL2（或FL3）散点图，保证在左上和右上象限内没有颗粒。如果有颗粒出现在上端象限则说明有荧光渗漏；此时FL1的荧光被FL2（或FL3）PMT检测到了。为了纠正这种现象，增加FL1 漏到FL2（或FL3）荧光的补偿%（这可能在1-5%之间）。如果这个调节没有有效地去除FL2 的阳性信号，此时要降低FL2（或FL3） PMT 的电压。
4. 检测PI 单染的细胞并检查FL1-FL2（或FL3）散点图，保证在右上和右下象限内没有颗粒。如果有颗粒出现在右侧象限则说明有荧光渗漏；此时PI 的荧光被FL1 PMT 检测到了。为了纠正这种现象，增加FL2（或FL3）漏到FL1 荧光的补偿%（这可能在15-25%之间）。如果这个调节没有有效地去除FL1 的阳性信号，此时要降低FL1 PMT 的电压。
    注：如果在以上调节补偿过程中更改了PMT 的电压，建议重复3、4 步骤，确保不引起过度荧光补偿。过度补偿可以从阳性细胞十分贴近从标这一现象观察出来。一个恰当的补偿应该是单阳性细胞荧光强度与落在左下Log 1 为边界象限中间阴性细胞的荧光强度一致。
5.设定十字门的位置，FL1 和FL2（或FL3）的划定方法如下：
5.1 设定FL1 标尺位置: 处于左下象限内的大群细胞是Annexin V 染色阴性的细胞（一般这些细胞会在FL1 轴方向上升至2 个对数坐标值）。将垂直的FL1 标尺设定在紧靠Annexin V 阴性群体右侧0.1-0.2Log 单位的地方。
5.2 设定FL2 （或FL3）标尺位置: 可以通过一定数据的双阳性细胞来区分PI+和PI-的细胞群体。在此条件下可能会识别出两群细胞，一是位于散点图的右下方（ANN+/PI-）还有就是右上方（ANN+/PI+）。水平线可以置于这两群细胞的中间。如果在分析的细胞群体中没有PI+细胞，区分PI+细胞最好是参照双阴性细胞群体，将水平线设在双阴性细胞以上0.1-0.3 Log单位的地方。
注：在阴性群体门以外的细胞可被识为Annexin V 或Annexin V 和PI 阳性的细胞。