芒果畸形病的巢式PCR检测.pdf

1 6 2 芒果畸形病的巢式 P C R检测 广东农业科学2 0 1 2年第 2 2期 贾 静，蒲金基，吕延超，占 魏，王 芳。，谢 艺贤(1 海南大学环境与植物保护学院，海南 海 1：3 5 7 0 2 2 8；2 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南 儋州5 7 1 7 3 7)摘要：建立了检测芒果畸形病的有效方法。利用 F u s a r i u mp r o l if e r a t u m的钙调蛋白基因序列设计外侧引物 P R O 1 P R 0 2 和内 侧引物 0 1 0 2，采用引物 P R 0 1 P R O 2可以从芒果畸形病病原菌基因组中扩增出 5 2 7 b p的特异性基因片段，采用引物 0 1 0 2可获 得 4 7 7 b p的基因片段。巢式 P C R的检测灵敏度达 5 1 0 n g Ix L，是常规 P C R的 1 0 0倍。此法具有 良好的特异性和检测灵敏度，为 芒果畸形病的早期诊断和及时有效的防治提供技术方法和理论依据。关键词：芒果畸形病：巢式 P C R：检测 中图分 类号：$6 6 7 7 文 献标识 码：A 文章 编号：1 0 0 4 8 7 4 X(2 0 1 2)2 2 0 1 6 2 0 3 De t e c t i o n o f m a ng o m a l f o r ma t i o n d i s e a s e by ne s t e d-PCR J I A J i n g ，P U J i n-j i ，L V Y a n-c h a o ，Z HA N We i ，WAN G F a n g ，X I E Y i x i a n (1 E n v i r o n me n t a n d P l a n t P r o t e c t i o n C o l l e g e，Ha i n a n U n i v e r s i t y,Ha i k o u 5 7 0 2 2 8，C h i n a；2 E n v i r o n m e nt a n d P l a n t Pro t e c t i o n I n s t i t u t e，C h i n e s e A c a d e m y o f T r o p ic a l A g r ic u l t u r a l S c i e n c e s，D a n z h o u 5 7 1 7 3 7，C h i n a)Ab s t r a c t：T h e s t u d y w a s t o e s t a b l i s h a n e f f e c t i v e d e t e c t i o n t e c h n i q u e f o r man g o ma l f o r ma t i o n d i s e a s e T h e o u t e r p a i r o f p r i me r s P R O 1 P R O 2 and t h e i n n e r p a i r o f p r i m e r s O l O 2 w e r e d e s i g n e d，a c c o r d i n g t o t h e c a l m o d u l i n g e n e s e q u e n c e s o f F u s a r i u m p r o l if e r a t u m T he r e s u l t s s h o we d t h a t a 52 7一b p s pe c i fic g e n e fra g me n t wa s o b t ain e d b y PRO1 P RO2 a n d 4 7 7-b p wa s a mp l i fi e d b y O1 O2 Th e s e n s i t i v i t y o f n e s t e d-P CR wa s as h i g h a s t o t h e 5 x1 0 n g Lwh i c h wa s 1 0 0 t i me s h i g h e r t ha n t h e s e n s i t i v i t y o f r o u t i ne PCRNe s t e d-P C R W a S a h i gh s p e c i fi c i t y a n d s e n s i t i v i t y to t h e d i s e a s e，t h e t e c h n i q u e and t h e o r y w o u l d b e p r o v i d e d fo r e a r l y d i a g n o s i s a n d p r e v e n t i v e t r ea l【m e nt Ke y wo r d s：ma n g o ma l f o r ma t i o n；n e s t e d PCR；d e t e c t i o n 芒果 畸形病(m a n g o m a l f o r ma t i o n d i s e a s e)是世界 范 围 的芒果 重要病害。1 8 9 1 年 印度首 次发现芒果畸形病 1 ，目 前该病 害在世界各大芒果产 区均有发生。而在我 国，该病 主要发生 在云南 元谋、元江、华坪 和 四川 攀枝花，并 确定 发 生 在 我 国 的 芒 果 病 原 菌 的 F u s a r i u m p r o l if e r a t u m f Ma t s u s h i m a)N i r e n b e r g t2 1。根据受害部位不同，芒果畸形病 分为营养器官 畸形和花序畸形两种症状 3 。营养器官畸形 多发于幼苗，且成龄 树也常见，会 导致腋 芽或顶芽 大量丛 生呈束状生长。受感 染 的花序 整个 或部分 畸形膨 大甚 至 收稿 日期：2 0 1 2 1 0 1 8 基金项 目：国家公益性行业(农业)科研专项(2 0 1 2 0 3 0 9 2 2)作者简介：贾静(1 9 8 7-)，女，在读硕士生，E m a i 1：j i n g l 2 l 3 1 O 2 3 1 2 6 c o rn 通讯作者：谢艺贤(1 9 6 3-)，男，研究员，E m a i l：y i x i a n 8 1 1 2 6 C O B 呈现盘状，花数 明显增 多，花轴变短、变粗，小花 簇拥在 一 起，最后焦 枯死亡，且 不育花 数 目增 加，雄蕊 发育 能力 变 差。畸形的花序几乎不能坐果，即使结果，果实也不能正常 发育而败育。某些严重地 区因芒果畸形病所 致的经济损失 达 8 0 1 o 0。芒果畸形病从接种到发病表现症状 通常需 要长达半 年的时 间，且 这段时间接种植 株表 观似正 常植 株，一旦发病将 影响植 株的结果能力。而嫁接在该病 害传 播上起着 重要的作用。若 带菌接穗 引进到新果 园 中，芒 果 畸形病则在果园 中传播蔓延，会给芒 果产量 带来无法 预计 的经济损失。如广西地 区曾从 攀枝花引进接 穗而将 芒果畸 形病 引入嗍 由于发现及 时并采取 了严格 处理措 施而将 其 铲除。避免 了该病在本地区流行危 害。鉴于此，建立准确的 早期检测方法具有重要的理论 意义 和应用价值。本研 究根 据 F u s a r i u m p r o l if e r a t u m钙 调蛋 白基 因序 列，设 计 巢 式 j 业j j jk，j j 业j 业，蝴j 业j j 业 9 r 业j 搴 k-，9 业 业 j j j j 坐j 业 矗 j 夸 j 所占比例高达 8 7 4 1，仅 1 2 5 9 的E S T S S R重复次数在 1 0以 上。依照 S c h l O t t e r e r的观 点，在本 研 究 所 发掘 的 E S T S S R中，仅少部分具有多态性潜 能。而 X u等5 1认 为，等位基因重复序列的长度存 在 1 个 阈值 长度小于该 阈值 的 S S R倾向扩张，反之 S S R倾向收缩，大多数真核生物的 阈值为 2 0 b p。在 1 5 6 6 5 条黄瓜 E S T S S R中，8 2 6 4 的黄 瓜 E S T S S R长度在 2 0 b p以内，由此推测，大部分 黄瓜 E S T S S R位点 均具有 多态性 的潜力。参考 文献：1 1 K o n g Q，X i a n g C，Y u Z D e v e l o p m e n t o f E S T S S R s i n C u c u m i s s a t i v u s f r o m s e q u e n c e d a t a b ase J】M o l e c u l a r E c o l o g y No t e s，2 0 06，6：1 2 3 41 23 6 2】关媛，李效尊，潘俊松，等 黄瓜果实 E S T S S R标记的开发 J 分子 植物 育种，2 0 0 7(5)：7 2 5 7 2 8 【3】胡建斌，李建吾 黄瓜基因组 E S T S S R s 的分布规律及 E S T S S R 标记开发f J】西北植物学报，2 0 0 8，2 8(1 2)：2 4 2 9-2 4 3 5 4】S c h l o t t e r e r C E v o l u t i o n a r y d y n a m i c s o f m i c r o s a t e l l i t e D N A【J J Chr o mo s o ma，2 0 00，1 0 9：3 6 5-3 71 5 5 X u X，P e n g M，F a n g Z T h e d i r e c t i o n o f m i e r o s a t e l l i t e m u t a t i o n s i s d e p e n d e n t u p o n a l l e l e l e n g t h J N a t G e n e t，2 0 0 0，2 4：3 9 6-3 99 P C R引物，并对 其特异性 检测和灵 敏度进行 了研究，以期 获得芒果 畸形病 的分 子生物学检测方法。1 材 料与方法 1 1 菌株 及菌丝 D N A提取 芒果 畸形病 菌 株 MMD 1 及 芒果 其他 病原 菌菌 株 包 括胶孢炭疽菌(C o l l e t o t r i c h u m g l o e o p o r i o i d e s)、尖孢 炭疽菌(c a c u t a t u m)、黄单 胞杆 菌(X a n t h o m o n a s c a m p e s t r i s)、芒 果拟茎点霉菌(P h o m o p s i s m#f e r a e)、芒果痂 圆孢菌(h a c e l o m a m a n g if e r o)、芒 果 拟 盘 多 毛 孢 菌(P e s t a l o t i o p s i s m )、细 极 链 格 孢 菌 l t e r n a r i a t e n u i s s i m a)、粉红 聚端孢 菌(T r i c h o t h e c i u m r o s e u m)和尖孢 镰 刀 菌 o x y s p o r u m)，均 由中 国热带农 业科 学 院环境 与 植物保 护研究所 热带果蔬 病害课题组 提供。将 所需菌株 在 P D A培养基 培养 7 d 后，置于 P D B培养基 上于 2 8、1 4 0 r m i n、黑暗条件下培养 3 d，用滤纸过滤获得菌 丝。菌 丝 D N A提取采 用 F u n g a l D N A K i t(O M E G A B I O T E K公 司)，所 得 D N A存 于一 2 0 备用。1 2 待测 芒果样 品采集及植物组织总 DNA提取 待测芒果样品为 1 0株接种半年 的两年生芒果 苗和从 攀枝 花采集的从芒果枝条及花序样 品若 干。表 面消毒后，选取所 需组织如芽、花和 叶等进行提取，总 D N A提取采用 P l a n t G e n o mi c D N A K i t 试 剂盒(T I A N G E N公 司)。1 3引物设计与 合成 根 据 G e n B a n k提 供 的 F p r o l if e r a t u m 特 异 的钙 调蛋 白基因序列。利用 P r i m e r E x p r e s s 3 0和 P r i m e r 5 0 设计 引 物，由英骏生物技术有 限公司合成 1 对 巢式 P C R的外侧 引 物 P R O 1 P R O 2和1对 内 侧 引 物 O 1 O 2。P R O 1：5 一 TGCATCAC TCCACTCAAT GCAT 一3 ：PRO2：5-TGTCAGAC G 兀 CGACGTT GGTCAG一3 ；01：5 一 T CC，I f】广 I ACATCTCT GT CTATGCGAT _ _ 3 ；O2：5 -T AATCTCAAGCAACCCACAG一3 。1 4巢式 P CR反应 1 4-1 第 1 轮 反应P C R反应体 系：2 x T a gP C R M a s t e r Mi x (T I A N G E N公 司)1 2 5 L，P R O1(1 0 t x m o l L)和 P R O 2(1 O m o】L)各 0 5卜 L L，D N A 5 L，引物灭 菌双蒸水加 至 2 5 L。P C R反应条件：9 4 预变性 4 m i n：9 4 变性 5 0 s,6 0 退火 1 m i n、7 2 延伸 1 m i n，经 3 0 个循环；最后 7 2 _延伸 1 0 m i n。1 4 2第 2 轮反应P C R反应体 系：2 x T a g P C R M a s t e r Mi x 1 2 5 L，O1(1 0 I x mo l L)和 O 2(1 0 p m o l L)各 0 5 L，第 1 轮反 应产物 1 L，灭菌双 蒸水加至 2 5 L。P C R反应条 件：9 4 预变 性 4 ra i n；9 4 o C 变 性 3 0 S、6 2 o C 退 火 5 0 S、7 2 o C 延伸 5 0 S，经 3 0个循环；最后 7 2 延伸 7 m i n。1 5 PCR特异性和灵敏度测定 分别使用 常规 P C R(即巢式 P C R第 1轮反 应)和巢式 P C R反应检 测一 系列 发生在 国内 的芒果 常见病 害的病原 菌，包括将模 板 D N A经过 系列 1 O倍稀 释 以后 分别 进行 常规 P C R和巢式 P C R反应，反应条件 与 1 4相 同 P C R产 物 经琼 脂糖凝胶 电泳检测。1 6芒果样 品检测 1 1 接种芒果苗的检测 分别采取 1 0株接种菌株 MM D1 l 63 并生 长半 年 的芒 果苗 的顶 芽或腋 芽 提取其 总 D N A用于 P C R反应。1 6 2 攀枝花采集样品的检测分别选取典型症状、疑似 症状 和未显症 的芒 果枝条 和花序 的芽、花、叶等组织 提取 总 D N A进 行 P C R反应。2结果与分析 2 1 P CR特异性 和灵敏 度测定 P C R反 应所 用 P ROl P R O2引 物是 根 据钙 调 蛋 白基 因 序 列 设 计 的，扩 增 片 段 5 2 7 b p(G e n B a n k登 录 号：HM 0 5 7 1 5 8)而钙调 蛋 白基 因序列一 般具有很 好 的特异 性。为了进一步确定这对引物 的特异性 我们 以芒果畸形 病病原菌和其他几种芒果病害病原菌 的基 因组 D N A作为 模 板分别进行 了常规 P C R反应。琼脂糖凝胶 电泳结果显 示 只有芒果 畸形 病病原菌 P C R反应得 到了 1条清晰可 见、5 2 7 b p的条带，结果见 图 1。由此说明，该 P R O 1 P R O 2 引物对芒果畸形病菌具有特异性。Ma e r：D L 2 0 0 0；1 1 0：X a n t h o m o n a s c a m p e s t r i s，F i u m p r o l if e r a t u m,Co l l e t o t r i c hu m g l o e o po r i o i d e s，C o Ue t o t r i c h u m a c u t a t u m,Ph o mo ps i s m r 0 e，h a c e l o ma m叩l g r 淝，Pe s t a l o t io ps i s m棚t g r ，A he ma r i a t e n u i s s i ma,T r i c h o t h e c i u m r o s e u m,Fu s a r i u m o x y s po r u m 图 1 引物 P RO1 PR 02特异 性测 定 巢 式 P C R 的灵 敏度 检测 结 果如 图 2所 示。模 板 总 D N A样 品起 始浓 度为 5 0 n g L，经 1 0倍梯度 稀释至 5 1 0 n g Ix L。对其 采用 P R O1 P R O 2引 物进行 常规 P C R反 应，利用 P R O1 P R O 2作外侧 引物、Ol O 2作内侧引物进行 巢式 P C R反应。常规 P C R反应获得 5 2 7 b p的基 因片段，巢 式 P C R获得 4 7 7 b p的基因片段。常规 P C R可检测 的最 低 D N A浓度 为 5 1 0 q ri g IL L，而 巢式 P C R可检测浓度 为 5 x l O n g I x L，其灵敏 度是常规 P C R的 1 0 0倍。2 2样品检测结果分析 2 2 1 接 种 芒果苗 的 P C R 检测 结果通 过巢 式 P C R反 应 的 1 0组 目的条 带亮度 明显(图 3 B)可 以灵敏地检测 出 病原菌 D N A。而常规 P C R中 1 4泳道 能清晰地看到 目的 条 带，但 5 1 0泳道 的较 为模糊。这 可能 由组织 中病原菌 的含量存在差异所致 也不排 除 D N A提取 的效果有所不 同。2 2 2 攀枝 花芒果 样品的 P C R 检 测结果如 图 4所示 巢式 P C R在典 型症状、疑似症状 和未显症的芒果样 品中 均能检测 出芒果 畸形病。但是芒果 叶片的检测效果不佳，原 因可能是 叶片 中病原菌 的含量较少。因此建议 不要 以 叶片作为检测对象，尽量使用芽 或花作 为检测对象。