植物过氧化物酶提取及电泳.docx

菜心的花和叶的过氧化物酶的提取、
活性测定及同工酶的凝胶电泳分析

广州大学
生命科学学院
洪韬文
生物工程112
1114200044

摘要：
本实验分两部分，1：过氧化物酶的提取，:用考马斯亮蓝试剂进行酶液蛋白质浓度的测定，根据标准曲线的方程式，计算出样品的蛋白质含量；2：:通过过氧化物酶活性的测定（愈创木酚氧化比色法），测出的OD值计算出酶活性数值， 接着对同工酶的凝胶电泳分析，使它在胶柱上呈现同工酶谱，得出最终实验结果，通过数据记录和拍照记录最终结果。
关键字：
过氧化物酶 蛋白质 OD值 同工酶 凝胶电泳
前言：
本实验是在完成基础生物化学实验以后，学生综合运用已经学过的生物化学实验理论和已经掌握的生物化学实验技术进行的一项综合性设计性实验，也是对学生实验动手能力的一次较全面的检验。POD是一种由单一肽链与卟啉构成的血红素蛋白，脱辅基蛋白分子需与血红素结合才构成全酶。参与植物POD血红素的合成部位可能象动物一样是在线粒体上。POD是一种氧化还原酶，它是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶，POD广泛存在于植物体内，是一种活性较高的一种酶，它与植物的呼吸，光合作用以及生长起着很大的作用。
材料和方法：
材料：菜叶，菜花
方法：
1.植物POD的提取
分别称取菜心的花和叶各1~2克，然后剪碎，分别放入研钵，向研钵中加入少许石英砂和3ml KH2PO4，快速研磨，后分别加入离心管中进行离心，离心条件为8500rpm，时间为15分钟。离心完毕后取上清液，并定容至10ml（刻度试管），***此液即为POD提取液，取5ml冷冻保存，作为电泳的POD样品。
2.蛋白浓度的测定—考马斯亮蓝法
标准曲线的制定

制作标准曲线回归方程：Y(含量)=aX(OD595值) + b， 得出相关系数R2。

3.样品蛋白浓度的测定

根据标准曲线的方程式，计算出样品的蛋白质含量。

4. 过氧化物酶活性的测定（愈创木酚氧化比色法）
备好酶液，将分光光度计调到470nm，取光径1厘米的比色杯2只，向对照杯加反应混合液2.0 ml，KH2PO4 0.5ml，校零点。而样品管加入反应混合液2.0 ml，酶提取液0.5ml，立即计时，30秒或1分钟计1次，共计3分钟。最后通过测出来的OD值计算酶活力。
酶活力的计算公式为 每分钟OD变化值
酶活性（△470/min mg蛋白）＝--------------------------
mg蛋白（或鲜重）
5.过氧化物酶同工酶电泳
冰箱中拿出粗酶样品，正确安装电泳槽（二块玻璃、一把梳子，二个隔条），洗净、擦干，用胶带封好面，夹好。之后制作PAGE胶：每张胶20ml ，由 A、B、C及水四成份组成，比例为：A:B:C:水＝2.5 ml: 5ml:1ml: 11.5 ml;配好后，迅速注灌胶，之后插入梳子（一半深度），等待20-30min凝胶凝固后，去胶带，清洗碎胶，轻轻拨出梳子。安装电泳的样品：将制的胶安装到电泳槽，凹面朝内，再用四个夹子固定，将缓冲液（需稀释10倍）加入到电极上下槽。上样：酶样品与含溴酚蓝的50%蔗糖液混匀，比例为1 ml酶+1ml 溴酚蓝蔗糖液；上样量是厚胶（厚梳子）每孔40微升，薄胶（薄梳子）每孔20微升；电泳：200V，1.5-2小时，取出凝胶；染色：凝胶置于大培养皿染色，至斑带淡淡出现，马上停止染色；漂洗：脱色液少量多次，脱出背景，然后用水漂洗；最后照好照片。
实验结果分析和讨论：
数据：

蛋白质浓度 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
OD595值 0 0.151 0.276 0.402 0.517 0.641

对照组 菜叶 菜花 (样品稀释10倍)

0D595值 0 0.237 0.348

Y菜叶=0.3514
Y菜花=0.5265

酶活性
叶 0.083 0.156 0.221 0.281 0.339 0.389
花 0.077 0.138 0.205 0.252 0.301 0.339

质量 叶:2.27g 花:1.92g

每分钟OD变化值
叶 0.073 0.065 0.06 0.058 0.05
花 0.061 0.067 0.047 0.049 0.038

酶活力（△470/min mg蛋白）
菜花酶活性 0.413 0.367 0.339 0.328 0.283
菜叶酶活性 0.457 0.502 0.352 0.367 0.285

分析和讨论：
整个实验下来，遵从实验步骤，在做这个实验之前有好好的预习，所以没有犯什么错误，并且最终得出的结果比较准确。而误差应该是在用移液枪的时候，在管里面有气泡导致了一系列的数据不准确。而由于因为电泳槽出了些问题，导致电泳的时间不够，导致电泳出来的效果线没有这么下。
参考文献：
《基础生物化学实验》
《生物化学简明教程》
《百度百科-POD》
《百度百科-同工酶》
致谢：
赖梓豪，黎焯南