淀粉酶的生产与应用.pdf

生物技术4(3):1一5,1 994i Bo teehno lo gya一淀粉酶的生产与应用谷军(黑龙江省科学院应用微生物研究所,哈尔滨)。淀粉晦是一类用途十分广泛的晦,推食加 工、食品工业、酿造、发哮、纷织品工业 和 医药行业都 经常使用。-a沈粉畴(Ec.3.2.1.1)l作用淀粉时可从分子内部切开-a1、4健,而生成糊精和还原糖,产物的末 端残基碳原子构 型 为a构 型,故称a一沈粉晦。a一沈粉晦可由徽 生物 发酵 产 生,也可从植物和动物 中提取,目前工业生 产上都以微生物发哮法进行大规模生 产二沈粉畴。在19 08年和1 91 7年德国的B心记i n和-f Efro nl t z先后由细菌中生 产出-a沈粉晦,用于纷织 品脱浆。1937年日本的 福本阁获得了产生-a淀粉酶的枯草杆菌。第二 次世界大战后,由于杭生素的发明,使得徽 生物工业大步前进,19 49年-a淀粉晦开 始采用深层 通风培养法进行 生 产。1973年衬热性-a淀粉酶投入 了生产闭。随-a淀粉畴的用途日益扩大,产量日见增多,生 产水平也逐步提 高。近些年我们国家的畴制 荆行 业发展较快,从1 96 5年开始 应用解淀粉芽艳杆菌B F一7658生 产。淀粉酶,当时仅无锡酶制剂厂独家生产,近 年在国内生产晦制 剂 的厂家己发展到1 2。多个,其中 约有4 0%左右 的工厂生产-a沈拼酶,产品也由单一的常温 工业用a一淀粉酶,发展到现在有工业 用也 有食品级,既有常温也有衬热 的,荆型上有固体的也有液体二淀粉畴。晦制荆工业现已成 为近代工 业生 产 中不 可缺少的组成部门,它对社会的贡 献远远超过畴工业本身。一、-a淀粉酶的产生菌及酶的特性有实用价值的-a淀粉酶 的产生菌如下:枯草杆菌(B.二沉“访)闹、地衣芽抱杆菌(B一i l c俪汀汾二 i s)6、嗜 热脂肪芽抱 杆 菌(B.名绝“,oh te rm o神枷。),、凝聚 芽抱杆 菌(B一eo,g咖:s).、淀粉液 化芽抱 杆 菌(B.a二,勿z-卯a e lc蜘。)幻、嗜碱芽抱 杆 菌(B.aa l k勿两阮即尹.)。、米曲霉(滋.,卿e)“、黑曲 霉(月.,夕,)2、拟内抱 霉(瓜d o二夕c o尹廊介阮i g l,)l3.虽然这些微生物都能产生-a淀粉酶,但不同菌株产生的酶在耐热性,作用的最适pH,对淀粉的水解程度以及产物的性质均有差异。淀粉酶通常在pH5.5一8是稳定的,大多数。一淀粉酶的最适温度是5 0一6 0,最适温度最低的是尖镰抱a一淀粉酶的2 5,最高的 是地衣芽抱杆菌-a淀粉酶的9 0。-a淀粉酶 的分子量 范围是156 00一23 9 3 0 0,通常为45 0 00一6 0 0 0 0“.-a淀粉酶可分为耐热、耐酸5、耐 碱6及耐盐 酶1 7,其 中唯有耐热酶在工业上大规模使用,地衣芽抱杆菌、嗜热脂肪芽抱杆 菌和凝结芽抱杆菌产生的-a淀粉酶的耐热性较强。所有-a淀粉酶都是金属酶,每个酶分子至少含有一个钙离子,钙离子使酶分子保持适当的构象,从而维持其最大的活性和 稳定性1 8,许多添加物如钠、钾、硼砂、硼酸氢钠、琉基乙醇 也是-a淀粉酶良好的稳定剂,而最常用的还是钙离 子.乙二醇、甘油、山犁醇一些非酶底物的,本文于19 93年12月21日收到生物技术4卷3期糖类,可提高a一淀粉酶的热稳定性川。世界上许多国家都以枯草杆菌,地衣芽抱杆菌生产细菌淀粉酶和米曲霉生产的真菌淀粉酶为主要产品,在工业生产中使用的菌种,最初都是从 自然 中得到的,通过筛选和诱变育种工作,可改变菌种的特性,提高二淀粉酶的活力。ont t rup似地衣芽抱杆菌AT e e9798为出发菌株,用丫射线,NTG以及Uv反复7次诱变,使 其-a淀 粉酶的产量为原 菌株 的2 5倍。Ad ne rev a2 0 等将枯草杆菌抱子悬浮液经5 0加热处理3 0分钟,酶合成速度 提高了2一2.7倍,可见采用诱变育种是行之有效的方法,但也有一定的局限性和缺点,由于发生平顶效应使之育种效果降低,利用转化法改良菌种,在枯草杆菌二淀粉酶的生产菌上已取得可喜的结果。Ka zumas a2 1 3等采用转化和诱变结合的方法,使a一淀粉酶产量比亲株高1500一2 0 0。倍。近年来,随生物工程技术的发展,基因工程技术已应用 到菌种的改造方面。a Plva 2 2)等把解淀粉芽抱杆菌-a淀粉酶基因克隆到枯草芽抱杆菌中,其a一淀粉酶活 力比其 原始的野 生型菌株 高50 0倍。e Ha nh ca n2 3 又把地衣 芽抱杆 菌耐热-a淀粉酶基因克隆到枯草芽抱杆菌中,美国c Pc国际公司的Mof fe t研究 中心,已获得美国食品药品管理局(F DA)的批准,可用其研制的基因工程菌生产a一淀粉酶,这是第一个 由FDA批准用基因工程菌生产的酶制剂。我国 对二淀粉酶菌种的选育、研究和生产做了大量 的工作,1957年陈琦2 I 等报导 了产生a一淀粉酶能力强的枯草杆菌5 17和s s。,1965年 我国开始应 用解 淀 粉芽抱 杆 菌B F 765 8生产。淀酶,以前曾误称为枯草芽抱村菌B P7 6 5 8-a淀粉酶,王桂芬s z 证明了原称为枯草芽抱杆菌(a B瓜。、召.乙i lti。)B P76 5 8产生 的a一淀粉 酶与解淀粉芽抱杆菌的液化型a一淀粉 酶 完全 一样,建 议 将 枯 草杆 菌B F7658正名为解淀粉芽抱杆菌(Ba m殉之匆越e a j“)。用 固体培养法生产枯草杆菌D J一3 2-a淀粉酶也有报道。无锡酶制剂厂与中科院遗传所等单位合作z 6,以枯草杆菌0 6一n为出发株经热处理、Uv照射,亚硝基 肌处理 和6”c。、Y射线、诱变育种得菌株2 09。在1 0吨及2 0 吨罐扩试中,发酵单位提高一倍,产品稳 定在30OU/耐,最高可达40 0U/i l n。他们又 用营养缺陷型 回复 突变的方法分离到 1 0余株高活力菌株,最高增产幅度比出发株 2 09高1 5%以上。高定华等利用x一射线、Y射线及激光等物理因素诱变,获得B F 7658的变异株K:,酶活力由原来的260u/而 提高到500一6o0U/而,20 m,发酵罐酶活力达4 2OU/il n,余茂效筛选到一株抗噬菌体 的-a淀 粉酶 生 产 菌 株。何纪春 等从B7 F6 58的变异株 2 09出发,经紫外线和亚硝基肌复合处理,得到诱变株.85产酶活力提高1 7一3 5%,且 比原株生长快、产酶早,中型试验和生产规模试验,。淀粉酶活力平均分别达到 了52 9U/而和50 5U/m 1,经济效益显著.孔显良卿等选到一株米曲霉(s Ap.。二卿。)5037,在最 适条 件下,a一淀粉酶活力 达43 88叮而且酶系较纯,作用于淀 粉主要产物为糊精和低聚糖,与丹麦N OVo公司的真菌a一淀粉酶性质基本相同。乌肠显章s 0 等从BF7658变异株20 9出发,经硫酸二乙醋和5-氟尿咯 睫、亚硝基肌等诱变选育出79 6变异株,在麦芽糖培养基中可获得较高的-a淀粉酶活性,达47 7U/而,比原菌提高4 0.6%,而且所得发酵液能快速通过板框压滤机,过滤回收率达 9 5%。耐热-a淀粉酶 由于具有良好的热稳定性,在酒精、啤酒酿造、制糖、纺织工业生产中将产生较大的经济效益。自1 955年c am卜b e l l 川报导从凝结芽抱杆菌(B.c o a尸勿。)得到耐高温a一淀粉酶以来,人们对耐热a一淀粉酶进行广 泛的研究,1973年高温-a淀粉酶问世后,双酶糖化法生产葡萄糖才能真正在工业谷军:a一淀粉酶的生产与应用上得到应用,现在这种酶已在西欧、美国和日本大量生产,是重要的工业酶制剂之一。我国在筛选耐热型a一淀 粉酶方面也 做了不少工作,胡学智咖以地衣芽抱杆菌l B。出发株,用N T G、6,o C、丫射线,DES及紫外线反复诱变处理,获得 一株突变株A。,是一株抗代谢阻遏,无抱子突变株,带利福平抗性,甲硫氨酸与精氨 酸缺陷型标记,产 酶活力是原株的100一20 0倍,可达ZO0u/m l。我国在利用基因重组构建 耐热性-a淀粉 酶方面已取得一定的进展,何超刚3 3 等将脂肪 嗜热芽抱杆菌淀粉酶基因质粒带入大肠杆 菌,使后者具有生产高淀粉酶能力。任大明3 4 将带有淀粉酶基因的克隆片段,在枯草杆菌中得到表达。朱卫民将枯草杆菌-a淀 粉酶基因在大肠杆菌中的得表达。二、。淀粉酶的纯化和提取为了提高收率、降低成本,对酶回收所做努力不亚于改进发酵工艺。从发酵液作成酶制剂所用单元操作主要是固液分离、浓缩、沉淀以及干燥、粉碎。其中固液分离是个关键。由于发酵液固 型物呈胶质状,特别是细菌发酵液带阴电荷,固液分离困难,必须通过聚电解质絮凝剂处理,再在硅藻土等助滤剂存在下用板框压滤机过滤。工业酶制剂有液体和固体两种形态,液体酶是除菌浓 缩液加入稳定剂和防腐剂,再标准化而成。固体酶最简便方法是将浓缩酶液喷雾干燥,或者用盐析和溶剂沉淀的方法。我国 目前生产 的-a淀粉酶所用菌种均是B F76 58的变异种,如B F76 58一2 09、8a5、8 63 15、KZi;。目前国内工业用-a淀粉酶,是将发酵液加入硫酸铁,使-a淀粉酶连同菌丝体等一起析出,经过滤、干燥和粉碎即得工业用a一淀粉酶酶粉。也有将发酵液加稳定剂,直接喷雾干燥制成工业酶粉。后一方法 由于严重的污染环境,在市内已被禁止使用,近年来由于硫酸大 幅涨价,而每 吨淀粉酶 耗硫按2.5吨左右,仅硫按成本已达 5 0%左右,这迫使酶制剂行业不得不重视下游工程的研究.我国食品添加剂。淀粉酶国家标准规定,酶制剂中不得含有培养基、菌体等杂质,对细菌及重金属含量等都作了规定。食品工业用-a淀粉酶,国内采用工艺先是加絮凝剂,使菌体蛋白尽量沉淀,经板框过滤后,滤液经真空浓缩或超滤浓缩,下面分两条路线进行,一是浓缩液加吸附剂,二是浓缩液加酒精或丙酮进行溶析,然后经过滤、干燥磨粉均能得到食品工业用a一淀粉酶,但一般由于发酵液固液不易分离、板框过滤困难,都改为不去菌体,使国家标准难以执行。发酵液尤其是芽抱杆菌,固液分离非常困难,原因有三:(1)细菌 的细胞微小,仅0.7一0.5林mxZ一3协m,比重与水接近,仅1.0 3.(2)细胞蛋白的等电点2一3,在高等电点、P H环境中,细胞常带负电荷,微粒间相互排斥力强,胶体稳定。(3)在细胞表面的生物大分 子 多糖、蛋白质等的一Co oH、一NHZ、一oH的基团,通过 氢键 与水分子结成水化层,吸附培养基中微粒,形成更稳定难沉淀之胶体。要使胶体粒子沉降,必须使粒子增大并中和电荷。有效的办法是发酵液中添加无机或高分子絮凝剂。常用无毒的无机絮凝剂如硫酸铝、碱式氯化铝、氯化铁、锌盐、钙盐等在水溶液中可形成各种氢氧化物凝胶,具有很大的表面积,可吸附菌体、微粒和色素,其经基有很强电中和能力。许多大分子凝胶,也可絮凝细胞而 沉淀,一些离子型,天然或合成高分子物质曾用作絮凝剂,常用的甲基纤维素、CMC、轻甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚丙烯酞胺等。目前我国 对a一淀粉酶下游工程 的研究做了许多工作。王 玉华3 6 报导在发酵液中加硫酸铝0.4 7%,再加分子量20 0万的聚丙烯酸胺29 4m mo fl/絮凝,漏斗 中过 滤 可提 高2.9倍。刘叶青s l报导用磷酸钙凝胶絮凝-a淀粉酶发酵液,再辅以阴离子高分子 絮凝剂生物技术4卷3期进行.a淀粉酶絮凝提取是可行的。赵铭嘟等将发酵液用高分子絮凝剂处理,小型板框压馆机 过滤达15.gL/mZh,而不絮凝者无法过滤。无锡酶制剂厂、轻工部发酵所、无锡轻工学院、江苏食品发酵所等单位川协作研制食品级-a淀粉酶比较多种絮凝剂结果如表表I几种撰扭荆的栩扭效果效效砚剂剂用t(%)挂速(L/m:b)收率写写N N N a:H P。二氛化钙钙1 1 12 1.4 4 48 5。8 8 8海海燕暇钠钠0.5 5 5ZQ。2 1 1 191 1 1聚聚丙粉酞 胺胺0.4 4 422一24.6 6 6SOe e8 5 5 5产物具有较多的麦芽糖,可用以制造低DE值的糖类,而耐热性强的细菌-a淀粉酶,由于液化完全,用酶量少,操作较容易,适于淀粉液化及棉布退浆、酶法生产葡萄糖以及石油压裂。目前,-a淀粉酶已用在淀粉加工业、面包工业、发酵工业、饲料制造等。如表I所示。由于-a淀粉酶的用途广泛,在市场上二一定粉酶是产量最大的酶类之一农I。浪粉曲的主典用途工艺为发酵液加絮凝剂 压滤 超滤浓缩5一1 0加乙醇沉淀,6 0烘干6小时,-a淀 粉酶总收率6 5%,卫生指标符合国家标准.迟玉森l 0 t等将解淀粉芽抱杆菌变异株N一D Es一1 0培养于 豆饼水 解液、麦芽糖构成的培养基,用NaZH P04及c aC I:絮凝滤液真空浓缩到1/6,加1%淀粉,用2.2倍9 5%乙醇沉淀,5 0洪干酶收率7 5%左右。清华大学杨基础 l等用聚乙二醇/无机盐从发酵液中提取-a淀粉酶已取得初步成功。地衣芽抱杆菌高温-a淀粉酶的下游工程。上海市工业微生物研究所将发酵液用天然高分子絮凝剂壳聚糖处理,经超滤、蒸发浓缩1 0倍,收率为8 0%,加入防腐剂、稳定剂,其酶活与N压v o公司产品e Trma ny l一12 0 相当,产品用于怡糖、啤酒、葡萄糖生产,在9 0一11 5液 化淀粉,具有用酶量省(只及B F7 658淀粉酶的1/6)过滤快,滤液清的优点,其成本仅及NO-vo公司酶的16/。三、-a淀粉酶的用途及展望-a淀粉酶的用途极为 广泛,不同来源的*淀粉醉,具有不同的性质,不同性质的酶具有不同的用途。黑曲霉酸性-a淀粉酶适用于制造助消化的药物。米曲霉的-a淀粉酶耐热性较差,用于面包工业。糖化型细菌淀粉酶因用用途途说明明淀淀粉加工工制造有萄精浆浆制制制造怡籍籍制制制造有萄精精制制制造各种粉未栩精精制制制造各种浆糊、粘着剂剂酸酸造发醉业业啤酒原料 的液化化酒酒酒精原料 的液化及精化化告告告油、赔原料处理理纺纺织品工业业各种织物退浆浆面面包工业业改善质 t风味,缩短时间,节约用精精医医药工业业消化药药饲饲料工业业与其它醉 一起添加促进消化化其其他他香料加工、造纸、石油压裂、果汁制造造近年来我国酶制剂工业蓬勃发展,品种和产量也不断增加.但是同国外酶制剂行业比尚有一定的差距。国外-a淀粉酶发酵水平达90 0U/而,耐高温-a淀 粉酶 发酵 水平 为3 0OU/血。而 我国常温-a淀粉酶活 力为300一5 00U/ml,耐高温-a淀粉酶活力仅150U/而,并且我国-a淀 粉酶剂型、品种和生产菌株都很单一。由于我国淀粉资源 丰富,淀粉酶应用范围广泛,淀粉酶工业发展也必将促进我国其它工业的迅速发展。为适应国民经济发展需要,应进一步扩大-a淀粉酶的产量和品种,今后应加强以下几个方面的研究:1.-a淀粉酶下游工程的研究,研制不同等级酶制剂及不同剂型的酶制剂2.加强菌种的筛选和诱变育种工作.3.加强基础理论的研究,如菌种产酶的遗传基 因控制酶的形成,这将有助于提高醉谷军:a一淀粉酶的生 产与应用产量和开拓酶的途用。4.深 入 开 展酶分子的改造和修饰的研究,并在工业、医药等方面得到实际应用.参考文献1张树政等:酶制剂工业 科学出版社,1984幻陈陶声:近代工业微 生物上海科学技术出版社,3 1 5,19 82【3山田浩一:食品工 业七微生物.光琳书院 1 08一1 16.19 6 34M曰s en.0.B.e ti a:i Desta rke,25:304一30 8,197 35ehem,比.,7 8:15 6 422,1 9736outr up,Heral:IAMss:2 04,19 75仁7远藤滋俊:发醉工学杂志,1 2:35 3,1 9 5 3s特许公报,1 5,7 4 4,1 9729二B r认to n,M.Mmeretal:zndu str纽一Mi c r由1 010幻护,p.1 3610二B叮。r,E.W.etal.:J.加et.1 10:9 9 2,1 972仁12。em.bs.,77:60 0 6 9,1 97212Foga rty,W.M.:Pro ce s sBIO Chem.,9(6):1 1,1 9 7413Matsuta ni.E.:u.5.3,2 9 75 47,19 6 71 45.Ja nec ek,5.5山:F邵一et ter304(1)1一3,19 9 2仁15Y.m认曰aa ndK.yam“a:gr.Bi o一ehem.27:806,19 6 31 6jKH,众.hi:gr.Biol.ehem,35:178 3,1 9 7 1仁17二特许公报5 273,197518二Kulp,K.:Enzyme s认FO odpro c e 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