活体梨叶片透明方法.pdf

中国果树ChinaFruits1998(2):47491998年5月实 验 技 术 与方法活体梨叶片透明方法*李保华赵美琦孙月海(中国农业大学植物病理系,北京 100094)活体叶片透明技术是研究病原菌侵染、扩展、发病过程及寄主组织病变的重要方法。流行病害的定量研究,尤其对于果树叶部流行病害的定量研究,若以叶片为试材,经透明处理后,不仅可检测病原菌孢子侵入率、菌丝扩展长度,达到定量研究的目的,而且克服了以苗木为试材的诸多弊端。以病原菌侵染、扩展为观察目的的梨树活体叶片透明和染色方法,以往未见报道。我们在梨黑星病的侵染、发病研究中,将用于小麦条锈病组织学观察的水合三氯乙醛煮沸透明 2和乳酚油透明液透明技术 1 3引入到梨黑星病的流行学定量研究中,并对这种透明方法的透明机理和各自应用范围作了进一步的研究。在组织透明的基础上,进一步探讨了表皮剥离方法,以获得对表皮表面结构和孢子侵染位点的清晰观察结果。1材料和方法材料为鸭梨不同叶龄(10180日龄)完整叶片和叶片的活体徒手切片,厚度为20100?m。1.1透明方法1.1.1饱和水合三氯乙醛溶液煮沸透明法透明液配制将水合三氯乙醛CCl3CH(OH)2和蒸馏水按5?2(W/V)的比例混合,待水合三氯乙醛完全溶解后,即配成饱和水合三氯乙醛透明液 2。透明将饱和水合三氯乙醛加热至沸腾,立即放入待透明材料,煮沸15分钟。1.1.2乳酚油透明液透明法透明液配制该透明液配制分两步,首先按苯酚20g?甘油40mL?乳酸20mL?蒸馏水20mL 的比例,将其配成乳酚油,待苯酚完全溶解,溶液混匀澄清后,按乳酚油200mL?无水乙醇132mL?三氯甲烷66mL的比例配成乳酚油透明液 1。透明将新鲜叶片直接浸入乳酚油透明液中,室温下处理48小时。透明叶片量不能超过透明液量的1/2。1.2染色与脱色染色液的配制称取溴酚蓝1g,溶入100mL 水合三氯乙醛溶液中,配成1%溴酚蓝染色液。溴酚蓝染色液可将梨黑星病菌的菌丝细胞壁染成蓝色,而叶组织细胞不被染色。脱色液为饱和水合三氯乙醛。染色和脱色经上述两种方法透明的叶片,浸入染色液中染色48小时。染色完毕,取出染色叶片,用自来水漂去叶片表面的染色液,转入饱和水合三氯乙醛溶液中脱色24小时。脱色后的叶片以甘油作浮载剂制成半永久玻片;脱色后的叶组织也可在饱和水合三氯乙醛溶液中保存。1.3表皮剥离表皮剥离液的配制将草酸和草酸铵分别配成0.8%和3.2%的水溶液,使用时再按1?1的比例混合即成 4。表皮剥离方法将透明或染色脱色的叶片直接浸入表皮剥离液中处理24小时。处理完毕,取出叶片并用清水冲掉表皮剥离液,用摄子撕取表皮,用毛笔刷去附着的叶肉细胞,即可以甘油作浮载剂制片观察。2结果本文于1998-01-18收到。*本研究为国家自然科学基金资助项目,资助号:39470475。本文承蒙曾士迈先生审阅,特致谢忱。472.1饱和水合三氯乙醛溶液煮沸透明法经饱和水合三氯乙醛透明的叶片,纵切片在显微镜下观察,仅能检查到叶组织细胞壁、细胞核和维管束的纤维素类物质,细胞膜和叶绿体、线粒体等细胞器均受到破坏,细胞内容物消失,这说明水合三氯乙醛主要通过破坏细胞膜、消解细胞质,来达到透明效果。如果煮沸时间过长,细胞壁也将被逐渐消解。图 A 为饱和水合三氯乙醛溶液煮沸透明后鸭梨叶片纵切片(104倍),图B为饱和水合三氯乙醛溶液煮沸透明后的叶肉细胞(1040倍)。饱和水合三氯乙醛溶液煮沸透明对梨各龄期叶片都能获得较好的透明效果,不同龄期叶片透明需要煮沸的时间有所差异,幼嫩叶片煮沸时间短,一般不超过3分钟;叶龄30日以上的叶片,煮沸时间可适当延长,透明过程中可随时检查透明效果,以叶片刚好完全透明为止。图 F为鸭梨35日龄叶片经饱和水合三氯乙醛溶液煮沸透明3分钟、溴酚蓝染色48小时和饱和水三氯乙醛脱色24小时的显微照片,照片中梨黑星病菌分生孢子接种4天后在角质层下形成的菌丝(1040倍)清晰可见。2.2乳酚油透明液透明法经乳酚油透明液透明的叶片,其纵切片在显微镜下观察细胞结构完整,与透明前相比,细胞质稠密,细胞质与细胞壁略有分离,叶绿体消解为多个微小的棕色颗粒,叶绿素消失。由此说明,该透明液主要通过分解叶绿素,破坏叶绿体达到透明的效果,对细胞膜和细胞质损伤不大。图C为该透明液透明的鸭梨叶片纵切片(1040倍),图 D 为叶肉细胞(1040倍)。乳酚油透明液透明鸭梨30日龄以内的幼叶和叶绿素已开始分解的衰老叶片(10月中旬以后),均能获得较好的透明效果。透明后的叶片呈淡黄色、透亮。图 G 是鸭梨25日龄叶片经乳酚油透明液透明48小时、溴酚蓝染色48小时、饱和水合三氯乙醛脱色24小时后的显微照片,从该照片可清楚看到叶片正面图活体梨叶片两种透明方法的透明机制及效果比较注:Co、Mc和St分别为梨黑星病菌的分生孢子、菌丝和子座,图版说明见正文。48角质层下的梨黑星病菌菌丝及子座(1020倍)。乳酚油透明液对叶绿素含量较高的成叶透明效果较差,透明后的材料呈黄褐色,光线透过率差。2.3表皮剥离组织透明有时仍不能获得清晰的观察效果,尤其对于叶片表面细微结构。为了获得表皮表面结构更理想的观察效果,需剥离表皮,利用相差显微镜观察。水合三氯乙醛溶液煮沸透明叶片,经草酸盐溶液处理后,剥取的表皮能获得较好的观察效果。乳酚油透明液透明叶片,再经草酸盐溶液处理,质壁分离严重,细胞皱缩变形,影响观察效果。图E是30日龄鸭梨叶片,经水合三氯乙醛透明后剥取的下表皮在相差显微镜下观察到的气孔结构(1040倍)。3结论水合三氯乙醛溶液煮沸透明主要通过消解细胞质使组织透明,它适于各龄期鸭梨叶片的透明,尤其适于质地厚、角质化程度高的叶片。乳酚油透明液透明法则主要是破坏叶绿体,它适于透明叶绿素含量较少的幼龄叶片和衰老叶片的透明,尤其适于展叶不久的幼嫩叶片透明。作者将上述方法用于梨黑星病菌分生孢子侵染、菌丝扩展、发病过程组织学观察和梨黑星病流行规律定量研究,并已取得了较满意的结果。主要参考文献1刘问林等小麦条锈菌(Puccinia striif ormis)在几个慢锈品种叶组织中的扩展.植物病理学报,1985,15(3):1291372肖悦岩等.小麦品种抗条锈菌小种专化性估测方法的研究.植物病理学报,1997,27(3):2012083 Mares D J.et al.T he interaction of yellowrust(Puccinia striif ormis)with winter wheat cultivarsshowing adult plant resistance:macrosopic and micro-scopic events associated with the resistant reactionPhysiol.Plant Pathol.1997,10?257-2744 Preece T F.A staining method for the study of applescab infection.Plant Pathol.1959,8?127-129实用技术熬制石硫合剂节省硫磺的方法石硫合剂是果树生产中常用农药,冬春季节是果农大量熬制时期,下面介绍一种熬制石硫合剂节省硫磺的方法。原料配比为2份石灰,2.5份硫磺,15份水。先将冷水烧到50左右,然后倒入硫磺糊(配硫磺糊时一定要用手将硫磺粉和成团,然后再逐步稀释成硫磺糊),边搅拌边加热,待硫磺液超过60时,从锅四周投入石灰块,并留下几块石灰备用,这时的火力一定要大,使锅内液体立即沸腾。浮在液面上的硫磺粉散开以后,再放入剩下的几块石灰(起引沸搅拌作用),盖上锅,并开始计时,约熬50分钟即成。注意盖锅前对锅内液体要搅拌2分钟,盖锅后要适当减火,火要小而匀,以能保持药液沸腾为宜。用此法熬制石硫合剂100kg,比用传统方法熬制省硫磺3kg,药液浓度能达26度,与传统方法熬制浓度基本相同。河北省卢龙县农业综合开发办公室(066400)李志高夏季注意银杏茎腐病的防治银杏茎腐病又叫苗枯病,在夏季高温炎热的地区发生。福建省夏季高温炎热,雨水较多,培育种植银杏苗木时,应注意做好茎腐病的防治工作。(1)发病症状与发病规律引起银杏苗木茎腐病的病原属半知菌类球壳孢目,此菌喜欢高温,病菌通常在土壤中营腐生生活,在适宜的条件下自伤口处侵入寄主。苗木受害的原因主要是夏季炎热,土壤温度过高,苗木茎基部受高温的损伤,造成病菌侵入。1年生幼苗的初期症状是茎基部变成褐色,叶片失去正常绿色,梢向下垂,直至全株枯死;2年生以上苗木在病害猖獗时也常感病,病苗地上部分枯死后,有的尚能于次年春自根颈处萌发新芽。(2)防治方法?培育健壮苗木,提高苗木的抗病力,施足基肥,适时灌溉和松土除草,松土除草时切勿碰伤苗木茎干。?遮荫降低地温,减少发病率。在夏季高温季节,苗木发病前搭设荫棚,降低土壤温度或在苗木茎部覆草降低地温,达到防病的目的。?发病期间喷施1%硫酸亚铁溶液。?喷施杀菌剂,喷多菌灵600倍液,甲基托布津800倍液均有效果。福建省顺昌县埔上镇经作站(353205)刘秋生49