软骨细胞与瑞福纳米人工骨复合物的体外构建.pdf

中南大学学报(医学版)，C e m “面(d S c )2 o o 7，3 2(4)6 4l 软骨细胞与瑞福纳米人工骨复合物的体外构建 肖 涛，彭 程，罗远 明 ，林 绵辉，刘夏君(1 中南大学湘雅 二医院骨科创伤研 究室，长沙 4 1 0 0 1 1；2 上海市奉城 医院，上海 2 0 1 41 1：3，宝鸡市 中医院，山西 宝鸡 7 2 1 0 0 1)摘要 目的：评估瑞福 纳米人 工骨(胶 原基 纳米 骨，n a n o h y d mx y 印a t i e c o l l a g e n，n H A C)作 为软骨 组织X-程细胞 支架材料的可行性。方法：选择骨性关节 炎(O A)患者行 髋关节置换 手术后 外观 大致正常 的关节软骨，消化、分 离、体 外培 养扩 增后种植到 n H A C 中，复合物体外培养后进行 型胶原免疫组织化 学检 测和扫描 电镜观 察。结果：软骨 细胞可 以长入 n H A C支架材 料 中。同期 软 骨细胞 保持 了正 常的外 形且 可 分 泌 型胶 原。结论：n H A C 可 以作 为软 骨细 胞 的 栽 体。关键词 软 骨细胞；组织X-程；胶原基纳 米骨；支架材料；体外 中图分类号 R6 8 文献标识码 A 文章编号 1 6 7 2 7 3 4 7(2 0 0 7)0 4 0 6 41 0 5 Cu l t u r e o f c h o n dr o c y t e s u s i ng n a n o-h y dr o x y a pa t i t e c o l l a g e n i n v i t r o X I A O T a o，P E N G C h e n g，L U O Y u a n mi n g，L I N M i a n h u i，L I U X i a j u n (1 R e s e a r c h l r u t i t ut e o f T r a u m a t ic O r t h o p a e d i c s，S e c o n d X i a n g y a H o s p i t a l，C e n t r a l S o u t h U n iv e r s i ty，C h a n g s h a 41 O 0 1 1；2 F e n g c h e n g H p h d o f S h a n g h a i，S h a n g h a 2 0 1 4 1 1；3 e a o j i H o s p i o f T r a d it io n a l C h in e s e M e d i c i n e，S h a n g x i 7 2 1 0 0 1，C h i n a)A b s t r a c t：Ob j e c t i v e T o e v a l u a t e t h e v a l u e o f t h e n a n o h y d r o x y a p a t i t e c o l l a g e n(n H A C)a s a s c a f f o l d f o r c a ai l a g e t i s s u e e n g i n e e rin g M e t h o ds The n o r ma l c a r t i l a g e f r o m p a t i e n t s aft e r t o t al h i p a rth r o p l a s t y o f o s t e o a r t hr i t i s wa s s e l e c t e d，a n d t h e n c h o nd r o c y t e s we r e d i g e s t e d，s e p a r a t e d，a nd a mp l i fic a t e d i n v i t r oTh e c h o n d r o c y t e s we r e s e e de d o n t o t h e n HAC s c a ffo l d a n d we r e c u l t u r e d i n a 3一 d i me n s i o n a l e n v i r o n me n t for 5 a n d 1 0 d a y s Th e e f f e c t s o f t h e c o mp o s i t e s c aff o l d o n t he c e l l a d h e s i o n，p r o l i f e r a t i o n，mo r p h o l o g i c a l c h a ng e s，a n d s y n t h e s i s o f t he e x t r a c e l l u l a r ma t rix we r e o b s e r v e d b y s c a n n i n g e l e c t r o n i c mi c r o s c o p y a n d i mmu n o h i s t o c h e mi s t r y Re s ul t s The c h o n d r o c y t e s c o u l d a dh e r e t o t h e s u r f a c e o f t h e s c aff o l d s，p r o l i f e r a t e，a n d mi g r a t e i n t o t h e s c aff o l d s The y ma i n t a i n e d r o u nd a n d c o u l d s e c r e t e e x t r a c e l l u l a r ma t rix o n t h e p o r o us s c aff o l d Con c l us i o n Th e nHAC c a n b e u s e d a s t h e c a rti l a g e c e l l c a r r i e r Ke y wo r ds：c ho nd r o c y t e s；t i s s u e e ng i n e e ring；n a n o h y d r o x y a p a t i ec o l l a g e n；s c aff o l d；i n v i t r o J C e n t S o u t h U n i v(Me d S c i)，2 0 0 7，3 2(4)：0 6 4 1 0 5 目前 软 骨 组 织 工 程 中 应 用 的 支 架 材 料 较 多，较常用的细胞支 架材 料是 聚乳 酸和 聚 乙醇 酸，应 用此支架 培 养软 骨 细胞 已成 功地 再 生 出软 骨组 织，但是植 于体 内后可 以引 起非 特异性 无 菌性 炎 症 反应 ，甚 至 致 癌。国 外 已 陆 续 地 开 展 体 外 扩增 的软骨 细胞移植于体 内修 复软骨缺 损 的临床 实践，并 已取 得一定的临床经验和成果；但 国内这 方面的报道 较少，大部分还处于动物 实验 阶段，而 收稿 日期(Da t e o f r e c e p t i o n)2 0 0 6-0 9-0 6 作者简 介(B i o g r a p h y)肖涛(1 9 6 5 一)，男，湖南湘潭人，副教授，博士，主要从事外伤的研究。通讯 作者(Co r r e s p o n d i n g a u t h o r)肖涛，E-m a i l：x i a o t a o x y l 1 6 3 c o n 基金项目(F o u n d a t i o n i t e m)湖南 省科技厅课题(0 6 F J 3 1 7 6)T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y De p a rt me n t o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y o f Hu m a n P r o v i n c e o f P R C h i n a(0 6 F J 3 1 7 6)维普资讯 http:/ 中南大学学报(医学版)，2 0 0 7，3 2(4)且多使用幼 年 动物 的软骨 细胞，使 用成 人 关节 软 骨 细胞 的较 少。由于 种 子 细 胞 来 源、支 架 材 料、细 胞 因 子 等研 究 尚未 取 得 实 质 性 突 破，因此，大 规 模 地体外培养 软骨细胞并将之 移植于体 内修 复各 种 关 节 软 骨 的 缺 损 尚有 一 定 困 难，而 应 用 新 型 的 纳 米 骨材 料 作 为软 骨 细 胞 载 体 体 外 扩 增 成 人 关 节 软 骨 细胞 的研 究 较 少。本 研 究 通 过 体 外 构 建 软 骨 细 胞与瑞福纳 米 人工骨 复合 物，旨在 探讨 瑞福 纳 米 人 工 骨作 为 软 骨组 织 工 程 细 胞 支 架 材 料 的可行性。1 材 料 与 方 法 1 1 主要 仪 器与 试 剂D ME M F 1 2(1：1)培 养 基 和 胎 牛 血 清 系 美 国 S i g m a公 司 出 品，0 2 5 胰 蛋 白酶 和 S 一 1 0 0抗 体 系 美 国 G i b c o 公 司 出 品，S A B C 试剂盒 系 武 汉 博 士 德 生 物 工 程 有 限公 司 产 品，J S M5 6 0 0 一 L V型 扫 描 电镜 系 日本 J E O L电 子 株 式 会 社 生 产，C O，培 养 箱 系美 国 T h e r m o F o r m a公 司生 产，超 净 工 作 台 系 苏 州 净 化 设 备 有 限 公 司 生 产，临 界 点干燥仪系 日本 日立公 司产品，E i k o l B一 5型离子溅 射仪，倒置显微 镜 为 日本 O l i m p u s公 司产 品，胶 原 基 纳 米 骨 由 北 京 益 而 康 生 物 工 程 开 发 中 心 生 产 清华大学发 明，专 利号 Z L 0 1 1 2 9 6 4 4 2，生 产批 号：2 0 0 5 0 5 0 2 2 5 3，颗 粒 B：p(2 0 4)m m，商 品名：瑞 福 纳 米 人 工 骨 。1 2 成人 关节软 骨 细胞分 离培 养 采集 老 年 骨性关节 炎(O A)患 者行髋 关节 置换 手术 后外 观 大 致 正 常 的 关 节 软 骨，保 存 在 D H a n k S液 中(含 青霉素 1 0 0 U m L、链霉素 1 0 0 U m L)，离体后 2 h 内处 理。将 采 集 的 软 骨 组 织 放 入 培 养 皿，用 D H a n k S液 依 次 漂 洗 3次，去 除 附 带 的血 凝 块 及 软 骨下骨。然 后将 软 骨 剪 碎成 约 1 m m 1 m m 1 m m 大 小，用 0 2 5 胰 蛋 白酶 消 化 液 于 3 7 消 化 3 0 m i n，D H a n k S液 洗 涤 1次。再 用 0 2 胶 原 酶 室温 消化 过夜(1 01 2 h)，吸取 上 清(剩余 软 骨组 织 可 用 原 消 化 液 继 续 消 化 收 集 细 胞)，室 温1 0 0 0 r m i n离 心 1 0 m i n。用 体 积 分 数 为 1 5 F B S 的 D ME M F 1 2(1：1)重 悬 洗 涤 细 胞，室 温 1 0 0 0 r m i n 离心 1 0 m i n。弃上 清，再用含 1 5 F B S 的 D ME M F 1 2(青霉 素、链 霉 素各 1 0 0 U m L)重 悬 细 胞 团，将 细 胞 悬 液 按 照 21 0 m L接 种 到 2 5 c m 的 细胞 培 养 瓶，于 3 7，5 C O 培 养 箱 中 培 养。每 天在相差显微镜下观察 细胞生 长情况和细 胞 形 态，23 d换 液 1次。细 胞 长 满 瓶 底 8 0 后 弃 上 清 液，0 2 5 胰 酶 3 7 消化 23 m i n，待 细 胞 变 圆 时 加 入 含 1 5 F B S的 D M E M F 1 2(1：1)终 止 消化，吹 打、离 心(同上)后按 照 21 0 4 m L接种 到 2 5 c m 的细胞 培养瓶 传代，细胞 长满 瓶底 8 0 消 化 后 进 行试 验。1 3 胶 原 基 纳 米骨(n H A C)与软 骨 细胞 复 合 培 养 n H A C试 验 前 经 1 0 多 聚 赖 氨 酸 浸 泡 过 夜 备 用，干燥 后 用 含 1 5 F B S的 D ME M F 1 2浸 泡 4 h 以 上，然 后 再 干 燥，干 燥 后 开 始 加 细 胞。方 法：用 细滴 管 在瑞 福 纳 米 人 工 骨 上 滴 加 消 化 离 心 后 未 稀 释的细胞悬液，待其慢慢渗透 后再滴 加，以滴加 的 细胞 悬液刚 刚渗 出材料 为佳。1 h后再滴 加 细胞 悬 液，如 此 重 复 3次。将 2份 复 合 的 材 料 放 入 6 孔 培 养 板 中，同 时 将 2个 未 经 过 处 理 的瑞 福 纳 米 人 工 骨 颗 粒 放 入 6孔 培 养 板 的 另 外 2个 孔 中，放 入 小 玻 片(作 型 胶 原 免 疫 组 化 检 测)，用 4块 盖 玻片压住瑞福纳 米人 工骨颗 粒，加入 含 1 5 F B S 的 D M E M F 1 2进 行 培 养，培 养 液 不 浮 起 纳 米 人 工 骨颗粒为 佳。将 6孔 培 养 板 放 入 5 C O 浓 度，3 7 培 养 箱 中培 养，23 d换 液 1次。分 别 于接 种 后 5 d，1 0 d终 止 培 养，对 培 养 物 进 行 检 测。1 4 检 测 方 法 1 4 1 倒 置 显 微 镜 观 察 所 有 标 本 每 天 均 在 倒置显微镜下观察细胞状况及形态学改变。1 4 2 型 胶 原 检 测 采 用 免 疫 组 织 化 学 试 剂盒 对 不 同培 养 时期 的 软 骨 细 胞 进 行 型 胶 原 免 疫 组 化 检 测，观 察 型 胶 原 的 合 成 及 表 达 情 况。免 疫组 织 化 学 采 用 D A B显 色，苏 木 素 轻 度 复 染。1，4，3 扫描 电镜 观 察 分 别 将 5 d和 1 0 d培 养 的瑞 福 纳 米 人 工 骨 取 出，沿 中央 横 断 面 切 开，经 4 戊 二 醛 和 1 饿 酸 固 定，梯 度 丙 酮 脱 水，醋 酸 异戊酯梯度 置换，临界点 干燥，表面 喷镀 金膜，镜 下观察纳米人工骨表面和 中央横断 面孔 隙 中细胞 的生 长 情 况。2 结 果 2 1 体 外培 养 软 骨 细 胞 的 特 点 刚 分 离 的 软 骨 细 胞 为 球 形，具 有 折 光 性，2 4 h后 细 胞 开 始 贴 壁，逐 渐 伸 展 为 三 角 形 或 多 角 行，胞 核 大 而 圆，胞 浆 丰富，内含分 泌颗 粒(图 1)。细 胞保 持单 层 生 长，约 1 0 d后 铺满 培 养瓶，传 代 后增 殖 加 速，4 d 铺 满培 养 瓶(图 2)。2 2 与纳米人 工骨共 同培 养 的细胞 I I型胶 原免 维普资讯 http:/ 维普资讯 http:/ 维普资讯 http:/ 软骨细胞与瑞福纳米人工骨复合物的体外构 建 肖 涛，等 6 4 5 参 考 文 献：2 3 4 5 6 7 P e p p a s H A，L a n s e r RN e w c h a l l e n g e i n b i o ma t e r i a l s J S c i e n c e，1 9 9 4，2 6 3(4)：1 71 5-1 7 2 0 王 炜 整 形 外 科 学 M 杭 州：浙 江 科 学 技 术 出版 社，1 999：3 64-3 65 WA N G We i P l a s t i c s M Ha n g z h o u：S c i e n c e a n d T e c h n o l o g Y P r e s s o f Z h e j i a n g1 9 9 9：3 6 4-3 6 5 廖素三，崔福 斋，张伟组织工程 中胶 原基纳米 骨复合 材 料 的 研 制 J 中 国 医 学 科 学 院 学 报，2 0 0 3，2 5 (1)：3 6-3 8 L I AO S u s a n，CUI F u z a i，Z HANG W e i Mi n e r a l i z e d c o l l a g e n b a s e d c o mp o s i t e f o r b o n e t i s s u eJ A c t a A c a d e m i a e Me d i c i n a e S i n i c a e，2 0 0 3，2 5(1)：3 6-3 8 D u C，C u i F Z，F e n g Q L，e t a 1 T i s s u e r e s p o n s e t o n a n o。h y d r o x y a p a t i t e c o l l a g e n c o mp o s i t e i mp l a n t s i n ma o w c a v i t y J J B i o me d Ma t e r R e s，l 9 9 8，42(4)：5 4 0 5 4 8 Du C，Cu i F Z，Zh a n g W，e t a 1 F o r ma t i o n o f c a l c i u m p h o s p h a t e c o l l a g e n c o mp o s it e s t h r o u g h mi n e r a l i z a t i o n o f c o l l a g e n m a t ri x J J B i o me d M a t e r R e s，2 0 0 0，5 0(4)：5 l 8-5 27 L i a o S S，T a mu r a K，Zh u Y，e t a 1 Hu ma n n e u t r o p h i l s r e a c t i o n t o t h e b i o d e g r a d e n a n o-h y d mx y a p a t i t e c o l l a g e n a n d n a n o。h y d r o x y a p a t i t e c o l l a g e n p o l y(L-l a c t i c a c i d)c o m p o s i t e J B i o m e d Ma t e r R e s，2 0 0 6，7 6(4)：8 2 5 陈 鹏，毛 天 球，刘 冰，等，胶 原 基 纳 米 骨 的 遗 传 毒 性 及 对 体 外 培 养 的 细 胞 影 响 的 研 究 J 13腔 医 学 研 究，2 0 0 5，2l(4)：3 5 3-3 5 6 CHEN P e n g，MAO Ti a n q i u，L I U B i n g，e t a 1 Ge n e t o x i c i t y o f c o l l a g e n b a s e d c o mp o s i t e a n d i t s i n f l u e n c e o n c u l t u r e d c e l l i n v i t r o J J o u rna l o f O ral S c i e n c e R e s e a r c h，2 0 0 5，2l (4)：3 5 3 3 5 6 8 孙 皓 羟基 磷 灰 石修 复颌 骨 囊 肿 术 后 骨 腔 及 牙 周 骨 缺 损 J 口腔 医学 纵 横 杂 志，l 9 9 9，l 5(2)：l 2 3 S UN Ha o Hy d r o x y a p a t i t e i n t h e r e p a i r o f c a v i t y a n d p e rio d o n t a l b o n e d e f e c t s a f t e r t h e o p e r a t i o n o f j a w b o n e c y s t J J o u r-n a l o f O r a l S c i e n c e R e s e a r c h，1 9 9 9，1 5(2)：1 2 3 9L i a o S，Wa n g W，U o M，e t a 1 A t h r e e-l a y e r e d n a n o-c a r b o n a t e d h y d r o x y a p a t it e c o l l a g e n P L GA c o mp o s i t e me m-b r a n e for g u i d e d t i s s u e r e g e n e r a t i o n【J B i o ma t e r i a l s，2 0 0 5，2 6(3 6)：7 5 6 4-7 5 71 1 0 孙 伟，李 子 荣，张 岚，等纳 米 晶 胶 原 基 骨 与 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 复 合 培 养 对 表 型 影 响 J 中 国误 诊 学 杂 志，2 0 0 6，1 6(8)：1 41 9-1 4 21 S UN W e i，LI Z i r o n g，Z HANG L a n，e t a 1 Ef f e c t s o f n a n o-h y d r o x y a p a t i t e c o l l a g e n t o b o n e ma r r o w me s e n c h y ma l s t e m c e l l s o n p h e n o t y p e c h a n g e J C h i n e s e J o u rna l o f Mi s d i a g n o s t i c s，2 0 0 6，1 6(8)：1 41 9-1 4 2 1 1 1 朱 菲，王 影，吴 燕 丽，等 胶 原 基 纳 米 骨结 合胶 原 膜修 复 兔 下 颌 骨 缺 损 的研 究 J 现 代 13腔 医 学 杂 志，2 0 0 4，1 8(6)：5 0 3-5 0 6 ZHU F e i，WANG Yi n g，WU Ya n-l i，e t a 1 Ex p e ri me n t a l r e。s e a r c h o f mi n e r a l i z e d c o l l a g e n b a s e d c o mp o s i t e wi t h c o l l a g e n ic-m e m b r a n e i n r e p a i ri n g ma n d i b u l a r d e f e c t s i n r a b b i t sJ J Mo d e m S o ma t o l，2 0 0 4，l 8(6)：5 0 3 5 0 6(本 文 编辑 陈 丽 文)维普资讯 http:/