半抗原_载体蛋白偶联物的三种电泳鉴定方法.pdf

中国农业科学 2010,43(3):565-570 Scientia Agricultura Sinica doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2010.03.017 收稿日期：2008-12-15；接受日期：2009-11-18 基金项目：国家自然科学基金项目（20877029，30700663）、广东科技计划（Zgzhzd0808，2009B040500002）、国家“十一五”科技支撑计划项目（2006BAD27B02-05）作者简介：雷红涛，副教授，博士。Tel：[phone]；E-mail：。通信作者孙远明，教授，博士。Tel：[phone]；Email： 半抗原-载体蛋白偶联物的三种电泳鉴定方法 雷红涛1，庞 杰1，2，贺丽苹3，杨金易1，孙远明1,秦毅兰1，梁明标1（1华南农业大学食品学院/广东省食品质量安全重点实验室，广州 510642；2福建农林大学食品科技学院，福州 350002；3华南农业大学分析测试中心，广州 510642）摘要：【目的】建立一种简单方便的半抗原-载体蛋白偶联物电泳鉴定方法。【方法】选用 SDS-PAGE、非变性琼脂糖凝胶电泳、高效毛细管区带电泳 3 种方法对载体蛋白、偶联剂变性的载体蛋白、半抗原-载体蛋白进行比较鉴定，同时与光谱法结果比较。【结果】对分子量差异较小的载体蛋白和半抗原-载体蛋白偶联物，SDS-PAGE 不能有效分辨；但偶联前后载体电荷有变化时，非变性琼脂糖凝胶电泳却能有效分辨游离的载体蛋白和半抗原-载体蛋白偶联物，相对 SDS-PAGE 表现出更高的分辨灵敏度；毛细管区带电泳能高效分辨载体和半抗原-载体蛋白偶联物，结果直观，但需较贵重的专用仪器。琼脂糖电泳和毛细管电泳法与可见-紫外光谱法鉴定结果一致。【结论】3 种电泳方法各有优缺点，非变性凝胶电泳简便、廉价、有效，较适合普通实验室使用。关键词：半抗原-载体蛋白偶联物；SDS-PAGE；非变性琼脂糖凝胶电泳；毛细管区带电泳 Identification of Hapten-Carrier Protein Conjugate by Three Electrophoresis Methods LEI Hong-tao1,PANG Jie1,2,HE Li-ping3,YANG Jin-yi1,SUN Yuan-ming1,QIN Yi-lan1,LIANG Ming-biao1（1Guangdong Key Laboratory of Food Quality and Safety/College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642;2College of Food Science and Technology,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002;3Instrumental Analysis and Research Center of South China Agricultural University,Guangzhou 510642）Abstract:【Objective】To establish a simple electrophoresis characterization method for hapten-carrier protein bioconjugate.【Method】SDS-PAGE,nondenaturing agarose gel electrophoresis and high performance capillary electrophoresis were employed and compared with spectrum method.【Result】The result showed that SDS-PAGE was not a sensitive candidate method to differentiate carrier protein from bioconjugate when both proteins have less molecular weight difference,but nondenaturing gel electrophoresis was a better alternative,which could discriminate the free carrier protein and bioconjugate protein with different net charge numbers.High performance capillary zone electrophoresis was another powerful approach for hapten-carrier protein bioconjugate characterization.The information obtained from three electrophoresis was in accordance with the one from ultraviolet-visible spectrum scanning.【Conclusion】Three electrophoresis methods had different advantages and disadvantages,cost-saving and simple nondenaturing electrophoresis seemed to have more availability in most laboratories.Key words:hapten-carrier protein bioconjugate;SDS-PAGE;nondenaturing agarose gel electrophoresis;capillary zone electrophoresis 0 引言【研究意义】半抗原（hapten）为小分子物质，分子量一般不超过 1 000 D，通常需要与大分子载体蛋白共价偶联形成“半抗原-载体蛋白”偶联物（hapten-protein bioconjugate）才具有免疫原性1。这种偶联物也称全抗原或人工抗原。半抗原-载体蛋白偶合物是否偶联成功决定着动物免疫后能否产生目标抗体，因此566 中 国 农 业 科 学 43 卷 半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定对与半抗原类物质抗体制备非常关键。【前人研究进展】半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定一直是免疫化学技术领域中一项很重要的工作，目前报道最多的鉴定方法是可见-紫外分光光度法2-4，该方法依据半抗原和载体蛋白具有不同的吸收特征，偶联成功后，偶联物往往会保留半抗原和载体各自光谱特征，或产生新的发色基团，如重氮化 法4，根据这些预期特征是否出现来判别半抗原-载体蛋白偶联物是否成功。但有时半抗原本身缺少发色基团，偶联也未能产生新的发色基团，此时偶联物则没有明显区别于载体的可见-紫外光谱特征，即使偶联成功，可见-紫外分光光度法也不能给出有效的判定信 息2；另外，示踪同位素法5、三硝基苯磺酸法（TNBS）6、电喷雾离子化质谱7、基质辅助激光解吸离子化质谱8等手段也被用于半抗原-载体蛋白偶联物鉴定。同位素示踪法因安全性问题，目前已较少使用；TNBS 法只在载体蛋白氨基有变化时才能应 用4；生物质谱方法比较准确，但操作繁琐，技术要求和成本较高，不方便一般实验室使用。【本研究切入点】电泳方法作为一种简单、方便的分离分析技术，在蛋白质分析领域有着很大的应用空间，但到目前为止，电泳方法的简便性和高分辨力尚未在半抗原-载体蛋白质鉴定中充分应用，相关研究很少。【拟解决的关键问题】本研究选取不同种类的载体及其衍生物，尝试采用一般实验室具备的常规聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和非变性琼脂糖凝胶电泳（nondenaturing agarose electrophoresis,NAGE）鉴定半抗原-载体蛋白偶联物，同时采用高效毛细管区带电泳（high performance capillary zone electrophoresis,HPCZE）进一步确证，进而验证电泳法与光谱法鉴定结果的一致性，为不同电泳方法应用于偶联物鉴定，进行有益尝试和比较。1 材料与方法 1.1 材料 水溶性碳二亚胺（EDC）、卵清蛋白（OVA）、牛血清蛋白（BSA）、-巯基乙醇，皆为 B.R.级，购自 Sigma 公司；磺胺二甲嘧啶（SM2），纯度大于 99%，购自 Sigma 公司；琼脂糖，B.R.级，购自 Serva 公司；低分子质量标准蛋白（电泳纯），购自广州威佳科技有限公司；JM-250 电泳仪（大连捷迈科贸有限公司）；DYCP-31D 水平式电泳槽、DYY-垂直板电泳槽（北京市六一仪器厂）；自制琼脂糖胶槽，材质为硬质塑料，槽内尺寸 120 mm60 mm10 mm；P/ACE MDQ毛细管电泳仪（美国 Beckman Coulter 公司）；熔融石英毛细管（河北永年锐沣色谱器件有限公司）。1.2 试验方法 选用未经处理的载体、偶联剂处理过的载体、半抗原-载体蛋白偶联物 3 种不同类型的蛋白或蛋白衍生物为对象，用不同方法进行电泳，处理方法如下：1.2.1 BSA、OVA 样品制备 电泳所用 OVA、BSA 样品皆用蒸馏水配置，浓度 16 mgmL-1，用前经 10 000 r/min 高速离心处理，取上清使用。1.2.2 BSA-EDC 制备 称取 50 mg EDC 和 44 mg BSA，溶解于 2.2 mL 0.1 molL-1、pH 7.2 的磷酸盐缓冲液（含 0.85%NaCl，PBS）中，室温避光搅拌反应24 h，用蒸馏水充分透析，离心去除沉淀，收集上清即得 BSA-EDC。1.2.3 BSA-SM2 制备 按参考文献方法进行9，有改进。将37.5 mg SM2溶于3 mL 1 molL-1的盐酸溶液中，加入 750 L 1 molL-1的亚硝酸钠溶液，冰浴搅拌反应30 min，得磺胺二甲嘧啶重氮盐，简写为 SM2-重氮盐；将 75 mg BSA 溶于 3 mL 0.15 molL-1、pH 9.7 的碳酸盐缓冲液中，取 1.2 mL SM2-重氮盐溶液、1.5 mL 1 molL-1的 NaOH 溶液，滴加到上述 BSA 溶液中，室温下搅拌反应 1 h，期间用 1 molL-1的 NaOH 溶液保持体系在 pH 9，反应结束后用蒸馏水于 4对产物充分透析 3 d，即得 BSA-SM2。1.2.4 琼脂糖凝胶电泳 按照 0.2%的胶浓度，将一定量琼脂糖加入 0.06 molL-1、pH 8.6 的巴比妥-巴比妥钠缓冲液中加热溶解，冷却至约 50 后倒入自制的琼脂糖胶槽中，在槽中央处插入梳子制备样品孔，胶凝后，用微量进样器给样品孔加入 12 L 样品，静置 10 min，将上样完毕的琼脂糖胶槽放入 DYCP-31D水平电泳槽内，在凝胶的两端用滤纸搭桥连接正负极缓冲液（0.06 molL-1的 pH 8.6 巴比妥-巴比妥钠缓冲液），盖上槽盖将 DYCP-31D 水平电泳槽置于 4冰箱，195 V 电压下电泳 30 min，小心移去滤纸，取出凝胶考马斯亮蓝溶液染色。1.2.5 SDS-PAGE 按照文献方法10进行。1.2.6 高效毛细管区带电泳 采用内径 50 m、总长60 cm、有效长度为 50 cm 的熔融石英毛细管；分离温度 25，分离电压 25 kV；压力进样 0.5 psi5.0 s；电泳运行缓冲液为 150 mmolL-1、pH 8.5 的硼酸盐缓冲液，缓冲液、样品液进样前均经 0.22 m 滤膜过滤，3 期 雷红涛等：半抗原-载体蛋白偶联物的三种电泳鉴定方法 567 电泳前毛细管依次用 0.2 molL-1的 NaOH 溶液、二次去离子水冲洗 2 min；两次运行之间用运行缓冲液冲洗 2 min；UV 检测器在 200 nm 处检测。2 结果 2.1 载体的 SDS-PAGE 和 NAGE 电泳 为了验证 SDS-PAGE 和 NAGE 电泳是否能够分辨分子量和净电荷不同的蛋白偶联物，首先以两种最常用的载体物质 BSA 和 OVA 为模型进行 SDS-PGE和 NAGE 电泳分析（图 1）。a:SDS-PAGE;b:NAGE.1:OVA;2:BSA;M:Marker 图 1 OVA 和 BSA 的凝胶电泳 Fig.1 Gel electrophoresis of OVA and BSA SDS-PAGE 依据分子量差异区分蛋白，分子量大的蛋白迁移距小，分子量小的则迁移距大。OVA（43 kD）分子量小于 BSA（66 kD），图 1-a 中 BSA 的SDS-PAGE 迁移距小于 OVA 迁移距，表明 SDS-PAGE可以清晰区分分子量差异达到22 kD 的两种载体蛋白。0.2%琼脂糖凝胶孔径很大，该浓度下的泳动速率只与蛋白上的净电荷有关；净电荷极性不同，迁移方向不同；相同极性，净电荷数大的迁移距大11。OVA、BSA 的等电点分别为 4.6、5.14，在其等电点以上的pH 8.6 巴比妥-巴比妥钠缓冲液中都带负电荷，在电场中都向正极迁移，但因为 BSA 游离羧酸数更多4，碱性条件下电离产生更多的负电荷，因此向正极迁移速度更快，在琼脂糖电泳中 BSA 的移距应该大于 OVA的迁移距。试验结果（图 1-b）与以上理论分析一致，表明 NAGE 电泳也可区分载体 OVA 和 BSA。同 时 也 表 明，无 论 是 基 于 分 子 量 差 异 的SDS-PAGE，还是基于净电荷差异的 NAGE，分辨率都足以区分载体蛋白 OVA 和 BSA。2.2 三种蛋白的 SDS-PAGE 和 NAGE 鉴定 为验证 SDS-PAGE 和 NAGE 对游离载体蛋白和半抗原-载体蛋白偶联物的区分能力，本研究以 BSA和 SM2-BSA 为对象，分别进行两种模式的电泳，同时选用偶联剂EDC处理过的载体蛋白BSA-EDC作为对照（图 2）。2.2.1 基于分子量差异的 SDS-PAGE 电泳 偶联剂EDC 主要作用于COOH 和NH2，形成肽键4，是一种较常用的偶联剂。BSA 经过 EDC 处理，理论上分子内及分子间的COOH 和NH2都可能发生缩合形成分子内缩合物、分子间缩合物、分子内和分子间具有的复杂缩合物。分子内缩合时，缩合产物与游离 BSA 相比，仅脱去数个 H2O 的分子量，对于分子量达到 67 kD 的大分子，游离COOH 和NH2的总数目并不多，并且COOH 和NH2的距离只有很接近或有机会接触才能发生脱水缩合，因此脱水有限，引起的分子量变化应该不大，SDS-PAGE 时，缩合产物和游离载体的迁移距应该没有明显差异。后两种缩合发生时，因为都存在分子间缩合，分子量应该约等于或大于 2 倍的 BSA 分子量。但从图2-a 可见，在 3 泳道上的 BSA-EDC 与 BSA 迁移距基本相当，这表明 BSA-EDC 主要是分子内缩合产物，至少分子间产物不多，推测可能是由于蛋白分子庞大的体积和空间位阻所致。SM2-BSA 因为在 BSA 上偶联了 SM2，分子量大于 BSA，但图 2-a 中 SM2-BSA 区带的迁移距和 BSA的迁移距基本相当，没有明显差异。说明 SDS-PAGE对有些载体和偶联物不能显著区分。2.2.2 基于电荷差异的 NAGE 电泳鉴定 从净电荷角度分析，BSA 发生分子内缩合时，会消耗等量的COOH 和NH2，所以 BSA-EDC 和 BSA 的净电荷极性相同，但净电荷数较 BSA 少，因此，在琼脂糖电泳中 BSA-EDC 迁移速率应较 BSA 小。图 2-b 的试验结果与此推论相符，相同时间内 BSA-EDC 迁移距明显小于 BSA 迁移距。BSA 发生分子间缩合时，缩合情形至少可能有 3种情况：（1）未发生分子内缩合，仅少量分子间缩合。这种情况下形成的肽键很少，偶联物羧酸基团多于游离载体 BSA，偶联物在碱性缓冲液电离后的净负电荷数应大于游离载体 BSA 的净负电荷数，迁移距应大于BSA；（2）未发生分子内缩合，大量分子间缩合。这种情况下消耗大量羧酸，偶联物羧酸数小于游离载体568 中 国 农 业 科 学 43 卷 BSA 羧酸数，偶联物在碱性缓冲液电离后净负电荷数小于 BSA 的净负电荷数，迁移距应小于 BSA。（3）同时发生分子内、分子间缩合。这种情况下偶联物的净负电荷数比较复杂，根据缩合程度不同，BSA-EDC迁移距理论上可能出现大于、小于、等于游离载体BSA 迁移距的 3 种情形。但试验结果（图 2-b）只出现了 BSA-EDC 迁移距小于 BSA 的情形，并未出现（1）、（3）情形。而上述SDS-PAGE电泳已经表明大量分子间偶联的情况并未发生，所以情形（2）也未发生，即分子间缩合情形不明显。这提示蛋白质空间体积庞大、结构复杂，空间位阻很大，可能较难发生分子间偶联或分子间偶联率很低，主要发生分子内COOH 和NH2缩合。另外，BSA 在 NAGE 中为一圆斑（图 2-b），而BSA-EDC 和 SM2-BSA 都表现为前后延伸的区带，这提示BSA-EDC和SM2-BSA可能都是净电荷数不均等的混合物，即经过偶联剂处理或者连接上半抗原后，半抗原-载体蛋白偶联物表面的净电荷密度不均一，从而可推断偶联物表面半抗原表位密度也不均一。a:SDS-PAGE;b:NAGE.M:Marker;1:BSA;2:BSA-EDC;3:SM2-BSA 图 2 偶联物的凝胶电泳 Fig.2 Gel electrophoresis of conjugates 2.3 高效毛细管区带电泳鉴定 为了验证以上两种常用电泳鉴定半抗原-载体蛋白偶联物方法的可靠性，随后采用高效毛细管区带电泳（HPCZE）分析 SM2-BSA 和 BSA。HPCZE 的分离基于各被测物净电荷与质量比存在差异。不同离子表面电荷密度的差异及离子半径的不同使其以不同的速度在电解质中移动，最后达到分离13。图 3 毛细管区带电泳图中 BSA 与 SM2-BSA 的迁移差异非常直观、清晰，BSA 迁移时间为 68 s，而 SM2-BSA 迁移时间为 79 s，表明毛细管电泳可准确分辨出 BSA 及其偶联物。同时可发现，BSA 峰较窄，而偶联物 SM2-BSA峰形较宽，再次提示偶联物的表面半抗原密度可能不均一。HPCZE 结果和 NAGE 结果一致，也证实了NAGE 的可靠性。图 3 BSA、SM2-BSA 毛细管区带电泳 Fig.3 Analysis of BSA and SM2-BSA conjugate by HPCZE 2.4 可见-紫外光谱法鉴定 SM2 被重氮化后，与 BSA 直接偶联的是 SM2 重氮盐。为了验证电泳方法和光谱方法的一致性，对载体 BSA、SM2 重氮化盐、SM2-BSA 进行可见-吸收扫描。从扫描结果（图 4）可见，SM2-BSA 的吸收特征 图 4 偶联物 SM2-BSA 的可见-紫外扫描 Fig.4 Visible-ultraviolet scanning spectrum of conjugate SM2-BSA 3 期 雷红涛等：半抗原-载体蛋白偶联物的三种电泳鉴定方法 569 明显不同于游离 BSA 的吸收特征，在 300 nm 以后，SM2-BSA 具有较强的吸收带，而 SM2 重氮盐在 300 nm 以后也具有强吸收。因此，可以推断，SM2 和 BSA偶联成功，紫外-可见光谱法鉴定结果和 NAGE 及HPCZE 鉴定结果一致，再次证实了电泳法的可靠性。3 讨论 Wetzel 等在 SDS-PAGE 中发现“多肽-鼠干扰素”迁移距明显不同于载体鼠干扰素，利用分子量差异成功确定多肽偶联于载体上12，与本研究中的现象不同。究其原因，Wetzel 所用半抗原为分子量较大的肽（924 个氨基酸），分子量是 SM2 的 3 倍以上，而所用载体分子量却较小（14.5 kD），约为本研究所用载体 BSA 分子量的 1/5，因此其半抗原连结到载体上后，分子量相对于其载体变化非常显著；而 SM2分子量较小，载体分子量（67 kD）却很大，偶联于载体 后 造 成 的 分 子 量 相 对 变 化 不 大，从 而 造 成SDS-PAGE 不能分辨出 SM2-BSA 和游离 BSA。由此推断，虽然 SDS-PAGE 对于一些分子量较大的半抗原偶联于小分子量蛋白是一种有效的鉴定方法，但对于分子量较小的半抗原偶联于较大分子量的蛋白时，SDS-PAGE 并不一定有明显效果。SM2-BSA是通过SM2重氮盐与BSA连接的，在pH 9，重氮盐主要和 BSA 上的酪氨酸上的酚残基反应4（图 5）。图 5 SM2 和载体蛋白的偶联方式 Fig.5 Coupling of SM2 and carrier protein 因为磺酰胺酸性很强，在碱性条件下的电离类似于羧酸，在pH 8.6的电泳缓冲液中，磺酰胺电离，产生一个负电荷。载体每连接一个 SM2 分子，其表面增加 1 个负电荷，而 BSA 有 19 个源于酪氨酸的酚残基，都有可能和重氮化后的 SM2 衍生物发生偶联，负电荷数增加，所以相对于未修饰的载体 BSA，向正极的迁移速率应较BSA大。图2-b的试验现象证明了这个推论。可见 NAGE 电泳能清楚分辨一些SDS-PAGE 无法分辨的半抗原-载体蛋白偶联物和载体。偶联反应常会消耗载体蛋白表面的氨基或羧 基2-4，无论是氨基或羧基减少，都会造成载体表面净电荷的变化，这种净电荷的变化相对于变性凝胶电泳的分子量变化，更易在非变性凝胶电泳中观察到。毛细管区带电泳能高效分辨载体和半抗原-载体偶联物，消耗样品少，分析速度快，结果直观，但需较贵重的专用仪器。3 种电泳方法各有优缺点和不同的适用范围，相对而言，非变性凝胶电泳，不需复杂昂贵的设备，对普通实验室鉴定半抗原-载体偶联物，显得更简便、有效，较易普及应用。4 结论 本文研究比较了 SDS-PAGE、非变性琼脂糖凝胶电泳、高效毛细管区带电泳 3 种不同电泳方法鉴定半抗原-载体蛋白偶联物，结论如下：（1）对分子量差异较小的载体蛋白和半抗原-载体蛋白偶联物，SDS-PAGE 有时不能有效分辨；偶联前后载体电荷有变化时，非变性凝胶电泳相对 SDS-质PAGE 表现出更高的分辨灵敏度，适合鉴定半抗原-载体蛋白偶联物；毛细管区带电泳能高效分辨载体和半抗原-载体蛋白偶联物，结果直观。（2）非变性凝胶电泳简便、廉价、有效，较适合普通实验室使用。References 1 Mercader J V,Pantaleon C S,Agullo C,Abad-Somovilla A,Abad-Fuentes A.Hapten synthesis and monoclonal antibody-based immunoassay development for detection of the fungicide trifloxystrobin.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56(8):2581-2588.2 刘燕婷,钟青萍,雷红涛,张 挺,余海虎,孙远明.基于不同载体免疫原制备河豚毒素抗体的研究.卫生研究,2008,37(3):234-236.Liu Y T,Zhong Q P,Lei H T,Zhang T,Yu H F,Sun Y M.Study on the antibody against tetrodotoxin made by the immunogen with different carrier proteins.Journal of Hygiene Research,2008,37(2):234-236.(in Chinese)3 Yang J Y,Wang H,Jiang Y M,Sun Y M,Pan K,Lei H T,Wu T,Shen Y D,Xiao Z L,Xu Z L.Development of the enzyme-linked immunoabsorbent analysis of the carbofuran residue.Molecules,2008,570 中 国 农 业 科 学 43 卷 13(3):871-881.4 Hermanson G T.Bioconjugate Techniques.New York:Academic Press,1996:161-177.5 Griffiths G L,Chang C H,McBride W J,Rossi E A,Sheerin A,Tejada G R,Karacay H,Sharkey R M,Horak I D,Hansen H J,Goldenberg D M.Reagents and methods for PET using bispecific antibody pretargeting and 68Ga-radiolabeled bivalent hapten-peptide-chelate conjugates.Journal of Nuclear Medicine,2004,45(1):30-39.6 Tominaga J,Noriho K,Masahiro G.An enzyme-labeled protein polymer bearing pendent haptens.Bioconjugate Chemistry,2007,18(3):860-865.7 Adamczyk M,Buko A,Chen Y Y,Fishpaugh J R,Gebler J C,Johnson D D.Characterization of protein-hapten conjugates.1.Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry of immuno BSA-hapten conjugates and comparison with other characterization methods.Bioconjugate Chemistry,1994,5(6):631-635.8 Adamczyk M,Gebler J C,Mattingly P G.Characterization of protein-hapten conjugates.2.Electrospray mass spectrometry of bovine serum albumin-hapten conjugates.Bioconjugate Chemistry,1996,7(4):475-481.9 Pastor-Navarro N,Morais S,Maquieira A,Puchades R.Synthesis of haptens and development of a sensitive immunoassay for tetracycline residues.Application to honey samples.Analytica Chimica Acta,2007,594(2):211-218.10 Alvarez-Rueda N,Beha,r G,Ferre V,Pugniere M,Roquet F,Gastinel L,Jacquot C,Aubry J,Baty D,Barbet J,Birkle S.Generation of llama single-domain antibodies against methotrexate,a prototypical hapten.Molecular Immunology,2007,44(7):1680-1690.11 郭尧君.蛋白质电泳实验技术.北京:科学出版社,1999:23-32.Guo Y J.Protein Electrophoresis Technique.Beijing:Science Press,1999:23-32.(in Chinese)12 Wetzel R,Halualani R,Stults J T,Quan C.A general method for highly selective cross-linking of unprotected polypeptides via pH-controlled modification of N-terminal a-amino groups.Bioconjugate Chemistry,1990,1(2):114-122.13 Jackowski M,Szeliga J,Klodzinska E,Buszewski B.Application of capillary zone electrophoresis(CZE)to the determination of pathogenic bacteria for medical diagnosis.Analytical and Bioanalytical Chemistry,2008,391(6):2153-2160.（责任编辑 曲来娥）