硝苯地平对牙龈成纤维细胞_型胶原合成的影响.pdf

第2 7卷第9期2 0 0 7年9月南京医科大学学报(自然科学版)A C T AU N I V E R S I T A T I SM E D I C I N A L I SN A N J I N G(N a t u r a l S c i e n c e)硝苯地平(n i f e d i p i n e,N I F)属于二氢吡啶类钙离子拮抗剂,用于冠心病、高血压的治疗。临床观察表明服用硝苯地平有导致牙龈增生的不良反应。但其引起牙龈增生的机制目前尚不清楚。一些研究发现硝苯地平导致药物性牙龈增生组织中胶原,特别是型胶原大量沉积。型胶原是牙龈结缔组织主要组成成分,也是重要的细胞外基质之一,其自身新陈代谢是健康的牙龈组织的重要保障。本实验目的是观察硝苯地平对体外原代培养的人牙龈成纤维细胞分泌型胶原水平的影响,以探讨硝苯地平导致牙龈增生的机制。1材料和方法1.1材料取材来自于本院口腔颌面外科阻生第三磨牙拔牙志愿者,年龄2 0 3 0岁。所有志愿者表现临床正常健康牙龈形态,未见组织增生,且未有服用致药物性牙龈增生相关药物史。拔牙后取牙龈组织。取适量硝苯地平粉末(南京第二制药厂提供),无水乙醇(S i g m a公司,美国)溶解后用D M E M培养液稀释,使硝苯地平的终浓度分别为1 0 8、3 6 0、12 0 0 g/L,无水乙醇的终浓度为0.0 1%。D M E M培养液中添加胶原合成所需的抗坏血酸(S i g m a公司,美国),其终浓度为5 0 g/m l。1.2方法硝苯地平对牙龈成纤维细胞型胶原合成的影响李蓓,孙卫斌*,王娟,徐艳(南京医科大学口腔医学研究所,南京医科大学附属口腔医院口腔内科,江苏 南京2 1 0 0 2 9)摘要 目的:探讨硝苯地平对人牙龈成纤维细胞型胶原合成的影响。方法:用含浓度为1 0 8、3 6 0、12 0 0 g/L硝苯地平的D M E M液作用体外原代培养人牙龈成纤维细胞;酶联免疫吸附试验检测细胞型胶原表达水平;细胞计数观察细胞增殖。结果:型胶原合成检测和细胞增殖试验的结果都显示在第5天,高浓度12 0 0 g/L、3 6 0 g/L组与低浓度1 0 8 g/L之间存在显著性差异。结论:高浓度硝苯地平有促进人牙龈成纤维细胞型胶原合成和细胞增殖的作用。关键词 成纤维细胞;龈增生;型胶原;硝苯地平 中图分类号R 7 8 1.4 文献标识码A 文章编号1 0 0 7-4 3 6 8(2 0 0 7)0 9-0 9 6 0-0 4T h ee f f e c t o f n i f e d i p i n eo nt h ee x p r e s s i o no f t y p eI c o l l a g e ni ng i n g i v a l f i b r o b l a s t sL I B e i,S U NWe i-b i n*,WA N GJ u a n,X UY a n(D e p a r t m e n to fO r a lM e d i c i n e,D e n t a lR e s e a r c hI n s t i t u t e,t h eA f f i l i a t e dS t o m a t o l o g i c a lH o s p i t a lo fN J M U,N a n j i n g 2 1 0 0 2 9,C h i n a)A b s t r a c tO b j e c t i v e:T oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t o f n i f e d i p i n e,ac a l c i u mc h a n n e l b l o c k e r,o nt h ee x p r e s s i o no f c o l l a g e ni ng i n g i v a lf i b r o b l a s t si nv i t r o.Me t h o d s:P r i m a r i l yg i n g i v a l f i b r o b l a s t sw e r ec u l t u r e da n di n c u b a t e dw i t hv a r i o u sc o n c e n t r a t i o n so f n i f e d i p i n e(1 0 8、3 6 0、12 0 0 g/L).E n z y m e-l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a yw a s u s e dt oe v a l u a t et h ea m o u n t o f t y p eI c o l l a g e n.C e l l p r o l i f e r a t i o nw a s m e a s u r e db yc e l l c o u n t i n g.R e s u l t s:T h ee x p r e s s i o n s o f c o l l a g e na n dc e l l p r o l i f e r a t i o nw e r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t a m o n gt h eh i g hc o n c e n t r a t i o ng r o u p s a n dt h eo t h e r s o n5t hd a y,e s p e c i a l l yh i g h e r i n3 6 0 g/La n d12 0 0 g/Lg r o u p.C o n c l u s i o n:N i f e d i p i n ec a ni n c r e a s e t h e e x p r e s s i o no f t y p e c o l l a g e ni ng i n g i v a l f i b r o b l a s t s a n dc e l l p r o l i f e r a t i o n.K e yw o r d sf i b r o b l a s t;g i n g i v a l h y p e r p l a s i a;t y p e I c o l l a g e n;n i f e d i p i n eA c t a U n i v M e dN a n j i n g,2 0 0 7,2 7(0 9):9 6 0-9 6 3 基金项目 江苏省自然科学基金资助(B J 9 9 0 6 8)*通讯作者,E-m a i l:w b s u n n j m u.e d u.c n9 6 0-1.2.1牙龈成纤维细胞原代培养人牙成纤维细胞原代培养按司徒镇强法1,组织块于添加1 0 0U/m l。青霉素、1 0 0 g/m l链霉素(G i b c o公司,美国)的磷酸盐缓冲液中清洗3次。用组织剪将组织块剪成1m m1m m1m m左右大小的小块,接种于细胞培养瓶中,均匀铺开。放置好后,将培养瓶轻轻翻转,加入适量的含1 0%F B S(四季青生物工程材料有限公司,杭州)的D M E M培养液(G i b c o公司,美国),放入C O2孵箱(H e r a e u s公司,德国)中。4h后翻瓶。培养2 0 2 5天,细胞从组织块中游出铺满瓶底9 0%左右后,0.2 5%胰酶(G i b c o公司,美国)消化传代。至第3代时细胞用液氮冻存备用。第5代到第8代的细胞用于后续实验。1.2.2牙龈成纤维细胞鉴定形态学观察倒置显微镜下对原代培养的牙龈成纤维细胞观察。免疫组化鉴定使用抗V i m e n t i n(博士德,武汉)和抗C y t o k e r a t i n(博士德,武汉)的S-A B C(博士德,武汉)法鉴定细胞。1.2.3细胞增殖实验将冻存的细胞复苏,传代,取第5代细胞用于实验。细胞接种于9 6孔板。接种浓度为31 04,每孔2 0 0 l。标准环境下,接种的细胞于含1 0%F B S的D M E M培养液中培养4h。4h后,弃去培养液,以剂距3 0%添加硝苯地平液,分别为:第1组:含硝苯地 平1 0 8 g/L;第2组:含硝苯地平3 6 0 g/L;第3组:含硝苯地平12 0 0 g/L;第4组:空白对照,仅为标准培养液。每组3孔。分别于加药后1、3、5天,0.2 5%胰酶消化细胞计数。1.2.4酶联免疫吸附试验(E L I S A)通过E L I S A方法检测细胞培养液中型胶原表达水平。于加药后1、3、5天,分别收集每孔细胞培养液上清。按抗人型胶原E L I S A试剂盒(中杉金桥生物技术有限公司,北京)说明书操作。取收集的每孔培养液上清1 0 0 l,加入已包被抗人型胶原单抗的9 6孔微孔板中,充分混匀后,3 7 1 2 0m i n。用洗涤液将反应板充分洗涤5次,滤纸印干。每孔加第一抗体工作液5 0 l,3 7 6 0m i n。洗涤液洗板5次,滤纸印干。每孔加酶标抗体工作液1 0 0 l,3 7 6 0m i n。洗涤液洗板5次,滤纸印干。每孔加入底物工作液1 0 0 l,3 7 暗处反应1 0m i n。每孔加入5 0 l终止液混匀。于酶标仪(B i o-T E K公司,美国)4 9 2n m处测吸光值。1.3统计学方法数据均以x s表示,使用S P S S软件进行组间单因素方差分析,P0.0 5为差异具有统计学意义。2结果2.1细胞培养及鉴定组织块原代培养,1 0天左右细胞游出。2 0 2 5天细胞铺满培养瓶底9 0%左右。原代细胞呈星形,传代稳定后,细胞伸展成长梭形,胞体丰满,胞核呈圆形,核仁清晰,细胞排列呈漩涡状。S-A B C染色后,在光镜下可见细胞波形蛋白染色阳性(图1,见彩页二)。胞浆棕黄色着色,阳性颗粒在胞浆中均匀分布。角蛋白染色阴性(图2,见彩页二)。2.2细胞增殖各组细胞在第1、3、5天内均有明显增殖,其中图3第5天倒置显微镜像可见,1 2 0 0 g/L、3 6 0 g/L组比1 0 8 g/L组和空白组细胞增殖明显。表1方差分析可见第1、3天内各组之间增殖无明显差异,第5天各组中表现出显著性差异。从表2两两比较分析P值表可见,差异出现在1 2 0 0 g/L、3 6 0 g/L组与1 0 8 g/L组、空白组之间。2.3 E L I S A胶原合成与细胞增殖结果相一致。第1、3、5天各组胶原合成都持续增加。方差分析可见第1、3天各组中合成无明显差异,第5天高浓度组12 0 0 g/L、3 6 0 g/L组较低浓度1 0 8 g/L和空白组差异明显(表3、4,图4,见彩页二)。1 0 8 g/L3 6 0 g/L12 0 0 g/L图3第5天牙龈成纤维细胞增殖(倒置显微镜像,1 0 0)F i g 3 M i c r o p h o t o g r a p h s o f c u l t u r e dg i n g i v a l f i b r o b l a s t s o n5t hd a y(1 0 0)李蓓等:硝苯地平对牙龈成纤维细胞型胶原合成的影响第2 7卷第9期2 0 0 7年9月9 6 1-第2 7卷第9期2 0 0 7年9月南京医科大学学报第2 7卷第9期2 0 0 7年9月南京医科大学学报3讨论硝苯地平2作用于血管和内皮细胞,选择性抑制钙离子通道,阻滞钙依赖性的A T P酶对A T P降解,降低胞内需氧量,维持细胞处于低能量消耗的状态。硝苯地平同时也抑制牙龈成纤维细胞对钙离子的摄取,影响成纤维细胞的合成代谢。自1 9 8 4年R a m o n等3首先报道服用硝苯地平并发牙龈增生以来,越来越多的临床报道4表明牙龈增生是服用硝苯地平的不良反应之一。硝苯地平导致牙龈增生的临床发病率约为2 0%8 3%5。过度增生的牙龈组织妨碍口腔卫生维护,导致病变局部菌斑堆积,并影响咀嚼功能和美观。硝苯地平导致药物性牙龈增生的机制目前仍不明确。一般认为可能和硝苯地平对牙龈成纤维细胞增殖的直接促进作用有关。有学者报道6-7同样是从药物性牙龈增生的患者中分离的组织对比正常的组织,体外培养时添加外源性的b F G F或I L-1,细胞增殖及D N A合成均明显增高。但S a l o等8并不支持细胞增殖的观点。他们以1 0 0 g/L和2 0 0 g/L浓度作用体外培养的正常牙龈成纤维细胞,结果显示硝苯地平对细胞增殖并无影响。而临床观察服用硝苯地平患者并不一定都会导致牙龈增生。E l l i s等9证实服用硝苯地平患者龈沟液中的药物浓度为0.9 2 9.3 0 g/m l,是血浆中浓度的1 5 9 0倍。据此认为导致药物性牙龈增生可能与于血浆药物浓度和龈沟液药物浓度有关。本实验使用的硝苯地平药物浓度按浓度梯度选择,分别为1 0 8、3 6 0、12 0 0 g/L3个浓度。实验浓度在上述报道的龈沟液N I F浓度之内,且单纯使用硝苯地平,不添加任何生长因子。以观察单纯硝苯地平作用于体外培养的正常牙龈成纤维细胞增殖影响。结果显示细胞增殖存在时间和剂量的依赖性,即长时间、高浓度硝苯地平对成纤维细胞具有明显的促进作用。这与前期研究结果一致1 0。但目前许多的研究并不支持硝苯地平导致细胞增殖这个观点,认为细胞增殖不明显而主要为结缔组织中胶原堆积。型胶原构成牙龈结缔组织固有层的大部分,也是结缔组织细胞外基质的重要组成部分,其自身稳定的新陈代谢是健康牙龈组织的重要保障。S p o l i d o r i o等1 1证明龈增生时内环境稳定紊乱,导致细胞外基质物大量沉积,特别是型胶原。硝苯地平导致的牙龈增生主要特征表现为结缔组织大量增生。K a t a o k a等1 2证明喂养硝苯地平导致牙龈增生的小鼠,免疫组化结果显示实验小鼠结缔组织中胶原含量明显高于正常小鼠,同时胶原表1硝苯地平对牙龈成纤维细胞增殖T a b1 A N O V Aa n a l y s i s o nf i b r o b l a s t s p r o l i f e r a t i o ni n4g r o u p s(1 04,x s)1234FP3.0 00.0 03.0 00.0 03.0 00.0 03.0 00.0 02.8 80.1 85.0 02.8 36.5 02.1 22.7 00.1 4 12.1 0 70.2 40 6.2 52.1 21 1.5 01.4 11 1.5 02.1 20 5.5 53.3 23.8 20.1 10 9.0 03.1 81 8.0 01.4 13 0.5 04.9 50 8.0 04.2 41 5.9 50.0 1组别第0天第1天第3天第5天表2第5天牙龈成纤维细胞增殖影响的两两比较分析P值表T a b2 P o s t H O Cc o mp a r i s i o n s o f f i b r o b l a s t s p r o l i f e r a t i o na mo n g4G r o u p s组别123第5天2340.0 2 90.0 0 40.0 0 40.0 6 50.0 4 90.7 9 9表3硝苯地平对牙龈成纤维细胞型胶原合成影响T a b3 A N O V A a n a l y s i so ne f f e c to fn i f e d i p i n eo nt h ee x p r e s s i o n o f t y p e c o l l a g e n i n 4 g r o u p s(吸光度均值,x s)组别第1天第3天第5天1234FP0.1 8 00.0 0 60.1 8 80.0 0 80.1 9 10.0 0 90.1 8 20.0 0 22.1 4 70.1 4 70.1 9 30.0 1 00.1 9 50.0 0 80.2 0 40.0 1 30.1 8 40.0 0 22.9 6 40.0 7 50.2 0 30.0 1 00.2 0 90.0 0 90.2 3 10.0 1 00.1 9 50.0 0 71 1.0 3 00.0 0 1表4第5天型胶原合成两两比较分析P值表T a b 4 P o s t H o c c o mp a r i s i o n s o n c o l l a g e n e x p r e s s i o n o n 5 t hd a y i n 4 g r o u p s组别123第5天2340.0 0 40.0 0 10.0 0 00.3 8 20.0 4 80.2 1 89 6 2-m R N A水平也高于对照小鼠。这些都提示硝苯地平抑制细胞外基质降解而导致病变组织中胶原沉积可能也是药物性牙龈增生的机制之一。本实验和细胞增殖实验中使用相同浓度梯度的硝苯地平液,通过E L I S A检测成纤维细胞分泌的型胶原表达水平。结果显示胶原表达水平和细胞增殖的结果相一致,且存在时间和剂量的依赖性。从本研究看,牙龈成纤维细胞在N I F作用下胶原分泌增加,也反证了组织学上牙龈结缔组织胶原堆积这一结论。正常组织胶原代谢是通过胶原合成和降解之间达到平衡来维持组织正常结构的。R o g e r等2证明硝苯地平作用于牙龈成纤维细胞或正常健康组织时,型胶原的表达均明显增加。但是S a k a g a m i等1 3证明硝苯地平单独作用或联合I L-1 作用正常人牙龈成纤维细胞时,型胶原m R N A表达不受影响。病变情况下,不论是合成增加或是降解降低,亦或是两者兼有之,都会导致胶原的沉积。型胶原的降解包括胞内和胞外两个途径。细胞内,通过成纤维细胞对胶原的内吞噬作用分解胶原;细胞外,通过酶类降解。金属基质蛋白酶(M M P s)在体内具有胶原酶和明胶酶的活性,通过蛋白水解细胞外基质,其中M M P-1主要在体内降解型胶原。组织基质蛋白酶抑制剂(T I M P-1)是M M P-1体内抑制剂。在生理状况下,M M P-1与T I M P-1达到平衡时对胶原的代谢十分重要。在环孢霉素导致药物性牙龈增生的实验中对于M M P-1与T I M P-1的研究均表明两者的比率比正常组织时有所改变。N i c o l e t t a等1 4表明环孢霉素导致药物性牙龈增生时,M M P-1表达下降、T I M P-1表达上调。而在硝苯地平研究中,S a ka g a m i等1 3证明硝苯地平与I L-1 联合作用于正常成纤维细胞时,M M P-1 m R N A和蛋白表达均增加,硝苯地平单独作用时,T I M P-1表达上调,且两者比率上升,这个结果目前无法解释。因此,其机制仍不明了。实验通过细胞增殖和E L I S A实验,表明高浓度的硝苯地平对于牙龈成纤维的型胶原的表达有明显的促进作用。但其分子机制,特别是N I F对牙龈成纤维细胞细胞外基质基因调控的影响尚待进一步研究。参考文献1 司徒镇强,吴军正.细胞培养M.西安:世界图书出版社,1 9 9 6:6 8-1 0 72J o h n s o n R B.S y n e r g i s t i ce n h a n c e m e n to fc o l l a g e n o u sp r o t e i ns y n t h e s i sb yh u m a ng i n g i v a l f i b r o b l a s t se x p o s e dt on i f e d i p i n ea n dT N F-a l p h ai nv i t r oJ.JO r a l P a t h o lM e d,2 0 0 3,3 2(7):4 0 8-4 1 33R a m o nY,B e h a r S,K i s h o nY,e t a l.G i n g i v a l h y p e r p l a s i ac a u s e db yn i f e d i p i n e-ap r e l i m i n a r yr e p o r tJ.I n tJC a r d i o l,1 9 8 4,5(2):1 9 5-2 0 64I k a w aK,I k a w aM,S h i m a u c h iH,e ta l.T r e a t m e n to fg i n g i v a l o v e r g r o w t hi n d u c e db y m a n i d i p i n ea d m i n i s t r a t i o nJ.J P e r i o d o n t o l,2 0 0 2,7 3(1):1 1 5-1 2 25E l l i sJ S,S e y m o u rR A,S t e e l eJ G,e ta l.P r e v a l e n c eo fg i n g i v a l o v e r g r o w t hi n d u c e db yc a l c i u mc h a n n e l b l o c k e r sJ.J P e r i o d o n t o l,1 9 9 9,7 0(1):6 3-6 76T a k e u c h iR,M a t s u m o t oH,F u j i iA,e ta l.D i f f e r e r c eo fc e l l g r o w t ha n dc e l l c y c l er e g u l a t o r si n d u c e db yb a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o rb e t w e e nn i f e d i p i n er e s p o n d e r sa n d n o n-r e s p o n d e r sJ.J P h a r m a c o l,2 0 0 7,1 0 3:1 6 8-1 7 47S a t oN,M a t s u m o t oH,F u j i i A,e t a l.T h ee f f e c t o f I L-1 a n dn i f e d i p i n e o nc e l l p r o l i f e r a t i o na n dD N As y n t h e s i s i nc u l t u r e dh u m a ng i n g i v a lf i b r o b l a s t sJ.JO r a lS c i,2 0 0 5,4 7(2):1 0 5-1 1 08S a l oT,O i k a r i n e nK S,O i k a r i n e nA I.E f f e c t o f p h e n y t o i na n dn i f e d i p i n eo nc o l l a g e ng e n ee x p r e s s i o ni nh u m a ng i n g i v a l f i b r o b l a s t sJ.JO r a l P a t hM e d,1 9 9 0,1 9(9):4 0 4-4 0 79E l l i sJ S,S e y m o u rR A,M o n k m a nS,e ta l.D i s p o s i t i o no fn i f e d i p i n ei np l a s m aa n dg i n g i v a lc r e v i c u l a rf l u i di nr e l a t i o n t o d r u g i n d u c e d g i n g i v a lo v e r g r o w t hJ.JP e r i o d o n t R e s,1 9 9 3,2 8:3 7 3-3 7 81 0 孙卫斌,蒋春梅,郑仕中.硝苯地平对牙龈成纤维细胞增殖和D N A合成的影响 J.中华口腔医学研究,2 0 0 1,3 6(3):1 8 0-1 8 21 1S p o l i d o r i oL C,S p o l i d o r i oD M,N e v e sK A,e ta l.M o r p h o l-o g i c a l e v a l u a t i o no f c o m b i n e de f f e c t s o f c y c l o s p o r i n ea n dn i f e d i p i n e o ng i n g i v a l o v e r g r o w t hi nr a t sJ.J P e r i o d o n t a lR e s,2 0 0 2(3),3 7:1 9 2-1 9 51 2K a t a o k a M,S h i m i z u Y,K u n i k i y o K,e ta l.N i f e d i p i n ei n d u c e s g i n g i v a l o v e r g r o w t hi nr a t s t h r o u g ha r e d u c t i o ni nc o l l a g e n p h a g o c y t o s i sb y g i n g i v a lf i b r o b l a s t sJ.JP e r i o d o n t o l,2 0 0 1,7 2(8):1 0 7 8-1 0 8 31 3S a k a g a m i G,S a t oE,S u g i t aY,e t a l.E f f e c t s o f n i f e d i p i n ea n d i n t e r l e u k i n-1 o n t h e e x p r e s s i o n o fc o l l a g e n,m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e-1,a n dt i s s u ei n h i b i t o ro fm e t a l l o p r o t e i n a s e-1i nh u m a ng i n g i v a l f i b r o b l a s t sJ.JP e r i o d o n t R e s,2 0 0 6,4 1(4):2 6 6-2 7 21 4G a g l i a n oN,M o s c h e n iC,D e l l a v i aC,e ta l.E f f e c to fc y c l o s p o r i n eA o nh u m a ng i n g i v a lf i b r o b l a s tc o l l a g e nt u r n o v e ri n r e l a t i o n t o t h e d e v e l o p m e n to fg i n g i v a lo v e r g r o w t hJ.B i o m e d i c i n e&P h a r m a c o t h e r a p y,2 0 0 4,5 8(4):2 3 1-2 3 8 收稿日期2 0 0 7-0 4-2 0李蓓等:硝苯地平对牙龈成纤维细胞型胶原合成的影响第2 7卷第9期2 0 0 7年9月9 6 3-