反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定丙酮酸发酵液中丙酮酸.pdf

第2 1 卷第1 期2 0 0 6 年3 月天津科技大学学报J o u r 衄lo fT i a n j i nU n i V e r s i 够o fS c i e n c e&T e c h l o g yV 0 1 2 1N 0 1M a r 2 0 0 6反相高效液相色谱法(R P-H P L C)测定丙酮酸发酵液中丙酮酸高年发，吴迪，张健(天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津3 0 0 2 2 2)摘要：提出一种利用反向高效液相色谱法(R P-H P L c)测定丙酮酸发酵液中丙酮酸的方法。应用反相c，。色谱柱0 D S-2H Y P E R S I L2 5 0m m 4 6m m5 斗m，以0 0 5m 0 1 L 1N H 4 H 2 P 0 4(用H 3 P 0 4 调p H2 6)为流动相，发酵液经稀硫酸预处理后直接进样分离定量，每一样品的分析过程不超过5m i n，可及时了解丙酮酸发酵过程中丙酮酸的变化，适于发酵液中丙酮酸的检测。关键词：反向高效液相色谱法；丙酮酸发酵液；丙酮酸中图分类号：T Q 9 2 1 7文献标识码：A文章编号：1 6 7 2 _ 6 5 1 0 2 0 0 6)0 1 m 0 2 1 J D 4D e t e r l n i 的t i o no fP y m V a t ei nP y 川V a t eF e 珊e n t a t i o nB m t h 协R e v e 玛e d-p h 嬲eH i g h p e r f o 珊a n c eL i q l l i dC h r o m a t o g 咫p h y(R P-H P L C)G A ON i 锄-f a，W UD i，Z H A N GJ i 锄(T i a n j i nK e yL a b o r a t o r yo fI n d u s t r i a lM i c m b i o l o g y，C o l l e g eo fB i o t e c h n o l o g y，T i a n j i nU n i V e r s i t yo fS c i e n c e T e c h n o l o g y，T i a n j i n3 0 0 2 2 2，C h i n a)A b s t 髓c t：AR P-H P L Cm e t h o df o rt h ed e t e n n i n a t i o no fp y r u v a t ei np y r u v a t ef e 瑚e n t a t i o nb r o t hw 鹊d e v e l o p e d 0 D S-2H Y-P E R S I LC 1 8c o l u m nw a su s e da n dm o b i l ep h 髂ew a sO 0 5m 彬LN H 4 H 2 P 0 4(a d j u s t e dt op H2 6w i t l lH 3 P 0 4)码e8 0 1 u t i o n0 fs 砌p l e sp r e t r e a t e d 硒t ht 1 1 es o l u t i o no fs 幽r i ca c i dw a u l d b ed 反e m i n e d，n ea 1 1 a l y s i sp m c e s sw o u l db e 矗n i s h e di nf i v em i n u t e s T h em e t h o dw a sp m v e dar a p i de 珏e c t i v ew a yt od e t e 邛【l i n et h ep y r u v a t ei np y m v a t ef e 册e m a t i o nb m t h 融”恻心：r e v e r s e d p h 船eh i g hp e 艋n a n c el i q u i dc h r o m a t 唧p h(R P H P L C)；p)r n l v a t ef e 珊e n t a t i o nb r o t l l；p y r u v a t e丙酮酸是机体代谢的重要中间代谢产物，是多种氨基酸、维生素以及其他一些有用物质合成的重要前体，在化工、制药和农用化学品工业中有广泛的用途J。由于近年来丙酮酸所具有的独特的减肥效果，丙酮酸的世界需求量迅速增长，价格居高不下，引起生产和研究的热潮旧J。丙酮酸及其他有机酸，可采用气相色谱分离。但采用气相色谱法进行有机酸分析时，常因有机酸的沸点较高、不易气化而需要先对其衍生再进行测定旧J，方法繁琐；同时又因有机反应不易定量进行而直接影响测定结果的准确性。早期的有机酸液相色谱测定方法，大多是采用阳离子交换法分离，然后以示差检测器检测。其检测器影响因素多，灵敏度收稿日期：2 0 0 5 0 5 1 3作者简介：高年发(1 9 4 5 一)，男，江苏吴江人，教授，博士生导师低，样品需要富集H J，而且离子柱与反相c，。色谱柱相比，价格昂贵，适用范围窄。目前反相高效液相色谱(R P H P L c)是应用最广泛的液相色谱法，本文进行了R P H P L C 法测定发酵液中丙酮酸含量的研究，并把用离子柱s C R-1 0 1 H 1 与用反相C。8 色谱柱O D s l 2H Y P E R S I L 两种色谱柱的测定方法的测定参数作了比较。提出一种利用反向高效液相色谱(R P-H P L C)测定丙酮酸发酵液中丙酮酸的方法，确定了最佳色谱分离条件，可对丙酮酸发酵液定性定量分析，从而指导菌种选育和发酵条件的研究，为以后进行这方面的研究提供条件。万方数据2 2 1 材料与方法1 1 仪器与设备s s IP C 2 0 0 0 型高压液相色谱仪(S s I 型输液泵，5 0 0 型紫外可见检测器，A N A S T A R 色谱工作站)；L D 51 0 型低速离心机(北京医用离心机厂)；s P-2 1 0 2 u V型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；循环水式多用真空泵s H B(河南省巩义市站街光亚仪器厂)；P H s 3 c 型精密p H 计(上海精密科学仪器有限公司)；A S 2 1 2 0 A 型超声波清洗器(天津奥特赛恩思仪器有限公司)；移液枪(日本制造)。1 2 主要试剂超纯水；葡萄糖(色谱纯)；H，P O。(生化试剂)；N H。H：P O。(分析纯)，天津市凯通化学试剂有限公司；甲醇(色谱纯)，天津康科德科技有限公司；硫酸(分析纯)，天津兴华化学试剂厂；丙酮酸(生化试剂)，中国医药(集团)上海化学试剂公司；仅一酮戊二酸(色谱纯)，S i g I l l a 公司。1 3 实验方法1 3 1 有机酸标准样品的选择分别准确称取1 0、2 0、4 0、6 0、8 0m g 丙酮酸置于1 0 0m L 容量瓶中，用超纯水溶解并定容，配制成丙酮酸标样系列溶液。在预实验中，通过对丙酮酸发酵液液相色谱分析，初步确定发酵液中存在两种有机酸，在通过光谱扫描及对发酵液中可能存在的几种有机酸在液相色谱中保留时间的确定，确定两种有机酸分别为丙酮酸和仅一酮戊二酸。所以，分别准确称取6 0m g 丙酮酸及2 0m g 仅一酮戊二酸置于1 0 0m L 容量瓶中，用超纯水溶解并定容，配制成这两种有机酸混合标准样品溶液。1 3 2 流动相的配制准确称取5 7 5 1gN H 4 H 2 P O。置于10 0 0m L 容量瓶中定容制成0 0 5m 0 1 L。N H。H：P O。的水溶液，用H，P O。调至p H2 6。再经0 4 5 斗m 水系膜抽真空过滤、脱气后使用。1 3。3 样品预处理取1 0m L 丙酮酸发酵液，离心(4 0 0 0r m i n 一，1 0m i n)除去菌体，取5m L 离心后的上清液置于5 0 0m L容量瓶中，再加入5m L0 0 1m 0 1 L。1 的硫酸水溶液进行酸解，使有机酸游离出来，然后定容并取适量以0 4 5 斗m 孑L 径的滤膜过滤即得到待测液。1 3 4 色谱分离条件色谱分离柱：O D S _ 2H Y P E R s I L2 5 0m m 4 6m m天津科技大学学报第2 1 卷第1 期5 斗m；流动相：以0 0 5m 0 1 L“N H 4 H 2 P 0 4(用H 3 P 0 4调p H2 6)为流动相；检测器紫外检测波长：2 1 5n m；进样量：2 0 斗L；流动相流速：1m L m i n；柱温：柱温为室温。1 3 5丙酮酸定性定量方法以有机酸紫外吸收光谱定性。在相同色谱条件下，将样品色谱图与有机酸标准液色谱图进行对照，根据保留时间确定样品中各有机酸的峰。以标准品追加增加峰高法进一步定性。将丙酮酸标准溶液系列在上述色谱条件下进样，以峰面积外标法定量，得到丙酮酸标准曲线方程。2 结果与讨论2 1紫外检测波长及流动相的选择紫外检测波长的选择，可通过紫外光谱扫描进行测定。对葡萄糖和几种发酵液中可能存在的有机酸分别进行了紫外扫描，葡萄糖的紫外光谱扫描波长为2 0 0 3 0 0n m；有机酸扫描波长为2 0 0 4 0 0n m。扫描结果表明，在2 0 0 2 2 0n m 范围内有机酸都有较强的吸收，由于丙酮酸的最大吸收波长为2 1 5n m，故定紫外检测波长为2 1 5n m，而葡萄糖在紫外检测波长范围内几乎没有吸收，故糖分的存在不影响对丙酮酸的检测。许多缓冲溶液在2 1 0n m 附近有较强的吸收，产生了较强的干扰，使灵敏度降低，有时根本无法测定。而磷酸盐缓冲溶液比较典型，在紫外区几乎无吸收，可作为有机酸测定的流动相MJ。本文先后实验了不同浓度的K H。P O。、N H。H：P O。磷酸盐缓冲溶液，综合考虑保留时间、色谱峰型及对分离柱的保护等因素，决定以0 0 5m 0 1 L“N H 4 H 2 P 0 4 为流动相。2 2 不同流动相的p H 对分离效果的影响流动相的p H 对各种有机酸的分离效果具有十分重要的作用。将流动相的p H 分别调至3 2、3 1、3 O、2 9、2 8、2 7 和2 6，以这7 种不同p H 的O 0 5m 0 1 L。1N H。H：P O。(用H 3 P O。调p H)为流动相分离丙酮酸与倥一酮戊二酸混和酸的标样，分离结果表明：两种有机酸的保留时间随着流动相p H 的变化而改变，见图1。由图1 可以看出，当流动相p H 为3 2 3 0 时，丙酮酸和d 酮戊二酸未得到分离；而p H2 9 2 7时，两种有机酸的分离效果不明显，相比较流动相p H2 6 时，效果最佳，综合分离效果及对分离柱的保护等因素，选择流动相的p H 为2 6。此时丙酮酸和a 一酮戊 万方数据2 0 0 6 年3 月高年发，等：反相高效液相色谱法(R P H P L c)测定丙酮酸发酵液中丙酮酸二酸混和酸标样得到较好的分离，见图2。丙酮酸标样测定回收率。结果见表1。图l 有机酸保留时间随流动相p H 的变化图2 丙酮酸和酮戊二酸混合标样液相色图谱2 3 外标工作曲线和线性范围的确定在标样与样品进样量相同的情况下，用外标法定量。准确吸取浓度为O 1，O 2，O 4，O 6，O 8g L。的丙酮酸标准溶液2 0 止分别进样，每个级别进样5次，取平均值，测定其峰面积，以峰面积对浓度作图得到标准曲线，其线性范围为0 1 一o 8g L 一。标准曲线见图3。图3 丙酮酸标准曲线2 4 方法的回收率及重现性实验以3 0L 发酵罐上6 8h 丙酮酸发酵液为样品，重复测定5 次，考察方法的重现性，5 次测定丙酮酸含量结果分别为5 8 5 2、5 8 3 7、5 8 2 4、5 8 4 4、5 8 0 6g L。其平均值为5 8 3 3g L，由此计算出相对标准偏差(尺肋)为0 2 4。同时对该时刻的丙酮酸发酵液添加表l 加标回收率测定结果(n=4)2 3 加入标准警加入酸实掣量回收彰g L 叫g L 12 0 0 01 9 9 29 9 64 0 0 03 9 8 59 9 66 0 0 06 0 2 11 0 0 42 5 发酵液样品中丙酮酸的定量分析结果取3 0L 发酵罐中不同发酵时间的发酵液(2 4、3 2、4 8、6 8h)，在上述分离条件下进行色谱分析，结果见表2。其中3 2、6 8h 发酵液的色谱图分别如图4 a、图4 b所示。(a)3 2h 发酵液(b)6 8h 发酵液图4 发酵液的分离色谱图图4 b 中的主峰(出峰时间3 4 7 3m i n)为丙酮酸峰，杂峰(出峰时间4 8 1 2m i n)为a 一酮戊二酸。从结 万方数据2 4 果中可以看出，用此方法能准确反映出丙酮酸发酵过程中丙酮酸在发酵液中的积累情况和其他有机酸副产物随发酵时间的变化。发酵前期，发酵液中的有机酸仅为丙酮酸，当发酵进行到中期，发酵液中有少量的a 一酮戊二酸产生，当发酵结束时，丙酮酸积累达到最高峰，此时发酵液中仍有少量的a 酮戊二酸。2 6与离子柱S C R-1 0 1 H 的唧L C 法比较表3 是反相c 1 8 色谱柱O D s-2H Y P E R S I L 的R P H P L C 法与离子柱S C R 一1 0 1 H 的H P L C 法比较。从回收率上看，两种方法的准确度均较高，从J R 如()值及分析时间的比较，可以看出反相C，。色谱柱O D s-2H Y P E R S I L 的R P H P L C 法的重现性更好，且分析更快速。更重要的是反相c。色谱柱与离子柱相比，价格便宜，应用范围广。表3与离子柱S C R-1 0 1 H 的I 口L C 法比较色谱柱回收率平均值嬲D 分析时间l I l i n反相c 1 8 色谱柱9 9 9O 2 45离子柱1 0 0 1O 8 873 结论丙酮酸发酵液经离心酸化等简单的处理后，采用反相色谱柱O D S-2H Y P E R S I L2 5 0m m 4 6m m5 肛m，以0 0 5m o l L _ 1N H 4 H 2 P 0 4(用H 3 P 0 4 调p H2 6)作为流动相，在流速1m L-m i n，波长2 1 5n m天津科技大学学报第2 1 卷第1 期下检测。实验结果证明，该方法能将丙酮酸发酵液中丙酮酸与在发酵中期产生的理一酮戊二酸完全分离并准确定量。本方法具有前处理简单、灵敏度高、分析速度快等优点，在4m i n 内便可检测出发酵液中的丙酮酸，对于及时测定丙酮酸发酵过程的变化具有重要意义。从发酵液的液相色谱图可以看出，发酵前期，发酵液中的有机酸仅为丙酮酸，在发酵中期开始产生仪一酮戊二酸，造成理一酮戊二酸产生的原因很多，有待于进一步的分析研究。参考文献：1 M i y a t aR，Y o n e h 啦T B r e e d i n go f I i 曲-p y r u v a t ep 剃u c i n gT o m l o p-s i sd a b m t aa 1 1 d 锄i n oa c i da u)【一o t r o p h i cm u t 帅t s J J B i o s c iB i o e n g，2 0 0 0，9 0(2)：1 3 7 1 4 1 2 吕咏梅丙酮酸钙及原料丙酮酸发展前景广阔 J 中国医药情报，2 0 0 2，8(3)：5 2 5 3 3 天津轻工业学院，等工业发酵分析 M 北京：轻工业出版社，1 9 9 4：3 4 6 3 4 8 4 白冬梅，赵学明，胡宗定应用H P L c 反相色谱法测定米根霉乳酸发酵液中的有机酸 J 工业微生物，2 0 0 1，3 1(1)：8 1 1 5 高先富，高年发，韩英素，等发酵液中丙酮酸的H P L c 法检测的研究 J 天津科技大学学报，2 0 0 3，1 8(3)：1 0 一1 2 6 杨毅，李崎，陈蕴，等反相高效液相色谱法(R P H P L c)测定啤酒中有机酸 J 食品与发酵工业，2 0 0 3，2 9(8)：6 1 2 万方数据反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定丙酮酸发酵液中丙酮酸反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定丙酮酸发酵液中丙酮酸作者：高年发，吴迪，张健，GAO Nian-fa，WU Di，ZHANG Jian作者单位：天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津,300222刊名：天津科技大学学报英文刊名：JOURNAL OF TIANJIN UNIVERSITY OF SCIENCE&TECHNOLOGY年，卷(期)：2006,21(1)被引用次数：2次 参考文献(6条)参考文献(6条)1.杨毅;李崎;陈蕴 反相高效液相色谱法(RPHPLC)测定啤酒中有机酸期刊论文-食品与发酵工业 2003(08)2.高先富;高年发;韩英素 发酵液中丙酮酸的HPLC法检测的研究期刊论文-天津科技大学学报 2003(03)3.白冬梅;赵学明;胡宗定 应用HPLC-反相色谱法测定米根霉乳酸发酵液中的有机酸期刊论文-工业微生物2001(01)4.天津轻工业学院 工业发酵分析 19945.吕咏梅 丙酮酸钙及原料丙酮酸发展前景广阔 2002(03)6.Miyata R;Yonehara T Breeding of high-pyruvate producing Torulop-sis glabrata and amino acid aux-otrophic mutants外文期刊 2000(02)引证文献(2条)引证文献(2条)1.董丽芳.闫荣哲.李会然.王娜 高效液相色谱法测定发酵液中丙酮酸的含量期刊论文-河北化工 2009(11)2.左莹.李静.施超欧.谢小波.刘霞 离子排斥法测定丙酮酸发酵提取液中的丙酮酸含量期刊论文-化学分析计量2007(6)本文链接：http:/