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总黄酮的测定方法
黄酮类化合物是广泛存在于植物界的一大类天然产物,种类繁多, 大多数黄酮类化合物与葡萄糖或鼠李糖结合成苷,部分为游离态或与鞣质结合存在。黄酮化合物系色原烷或色原酮的2-或3-苯基衍生物, 一般具有C6-C3-C6的基本骨架结构。近年来, 黄酮类化合物以其广谱的药理作用倍受青睐, 人们对含有黄酮的化合物进行大量研究, 以期获得黄酮含量较高的中草药。因此黄酮的含量测定成为研究的关键步骤。
一、方法
（一）高效液相色谱法 
1. 原理  植物类样品用石油醚脱脂后，经甲醇加热回流提取，以高效液相色谱法分离，在紫外检测器360nm条件下，以保留时间定性、峰面积定量。
2．仪器和试剂 （1）高效液相色谱仪 （2）紫外检测器  （3）层析柱  （4）超声波清洗仪 （5）索氏提取器  
（6）微孔过滤器（滤膜0.45um） （7）甲醇（色谱纯） （8）芦丁标准品 
（9）石油醚，盐酸，磷酸（分析纯）。 （10）去离子水 
（11）芦丁标准溶液：精确称取经105℃干燥恒重的芦丁标谁品15.0mg，加甲醇溶解并定容至100ml，配成150ug／ml的芦丁标准溶液
3. 操作步骤
（1）样品处理 
1）固体样品：称取2.0g干燥的固体样品，研细，置于索氏提取器中，用石油醚（60～90℃）提取脂肪等脂溶性成分，弃去石油醚提取液，剩余物挥去石油醚，加人甲醇50ml和25％HC1 5ml，80℃水浴回流水解1h，取出后快速冷却至室温，转移至50ml容量瓶中，甲醇定容，经0.45um滤膜过滤，供分析用。 
2）液体样品：准确吸取样品2.0ml，直接以石油醚萃取脱脂，挥去石油醚后，
以甲醇溶解并定容，经微孔滤膜（0.45um）滤过后供测定用。 
（2）色谱分离条件 
色谱柱：CLC－ODS，6mm×150mm，5um; 
流动相：0.3％磷酸水溶液：甲醇（V:V）＝40:80，临用前用超声波脱气； 流  速：lml／min； 柱  温：40℃； 检测波长：360nm； 灵敏度：0.02AUFS； 进样量：20ul。 
（3）样品测定：准确吸取样品处理液和标准液各10ul，注入高液相色谱仪进行分离，以其标准溶液峰的保留时间定性，以其峰面积计算出样品中总黄酮的含量。4、结果计算

（二）分光光度法
1．原理  黄酮类化合物是具有苯并吡喃环结构的一类天然化合物的总称，一般都具有4位羰基，且呈现黄色。黄酮类化合物的3—羟基、4—羟基或5—羟基、4－羰基或邻二位酚羟基，与铝盐进行络合反应，在碱性条件下生成红色的络合物。 
本方法对样品中黄酮类化合物进行提取纯化后，用分光光度法于510nm波长下测定其吸光度，与芦丁标准品比较，进行待测物中总黄酮的定量测定。
2．仪器和试剂 （1）722分光光度计 （2）索氏提取器 
（3）真空泵，盐基交换管等。 （4）恒温水浴，分液漏斗。 （5）芦丁标准品 
（6）亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠（分析纯）。  （7）氯仿，无水乙醇，甲醇（分析纯）。 
（8）5％香草醛溶液：称取5g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至100ml。 （9）聚酰胺树脂  （10）去离子水。
3．操作步骤 （1）样品处理 
1）固体样品：称取1～2g干燥的固体样品，用滤纸包紧，置于索氏提取器中，加入50～100ml 70％乙醇溶液浸润后，在80℃水浴下回流3h，至提取液无色为止。粗提液冷却后，减压抽滤，并用少量25％乙醇溶液洗涤滤渣，合并滤液。在50℃下减压蒸馏，除去其中的乙醇，直至索氏提取器内溶液呈无醇味。倒出容器内溶液，用30ml热水分3次洗涤，抽滤后，将滤液倒入分液漏斗中，以75ml 氯仿分3次萃取脱脂，待完全分层后，收集各次下层水溶液并定容至50ml。 
称取1～2g经预处理的聚酰胺树脂粉末，湿法装柱，用水饱和。吸取上述脱脂后的水溶液1～2ml，沿层析柱漫漫滴人柱内，放置一定时间，待测液被充分吸附后，用70％乙醇或甲醇洗脱，流速为1.0ml／min，至流出液基本无色，一般收集10ml即可。上述洗出液用洗脱剂定容后即可用于测定。 
2）液体样品：准确吸取1.0ml样品，定容至50ml后，直接以75ml 氯仿分3次萃取脱脂，其余步骤同上。 
（2）标准曲线的绘制：准确吸取芦丁标准溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、⒋00ml（相当于芦丁0、75、150、300、450、600ug），移入10ml刻度比色管中，加入30％乙醇溶液至5ml，各加5％亚硝酸钠溶液0.3ml，振摇后放置5min，加入10％硝酸铝溶液0.3ml摇匀后放置6min，加1.0mol／L氢氧化钠溶液2ml，用30％乙醇定容至刻度。摇匀，放置15min，于510nm波长处测定吸光度，以零管为空白，以芦丁含量（ug）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算相关系数（r）。 
（3）样品测定：根据样品中总黄酮含量高低，取适宜体积待测液，按标准曲线制备操作步骤于510nm处进行吸光度的测定（样液如有沉淀，应过滤后测定）。 
4.结果计算  根据标准工作曲线，求出相当于样品吸光度的芦丁含量，按下式求出总黄酮含量

（三）毛细管电泳法
毛细管电泳法是离子或荷电粒子以电场为驱动力, 在毛细管中按其淌度或分配系数不同进行高效、快速的电泳分离新技术。常用的方法主要有毛细管区带电泳( CZE )、胶束电动力学毛细管色谱(MEKC) 、毛细管凝胶电泳( CGE) 、毛细管等速电泳( CITP) 等。它的各种操作模式特别是CZE 和MEKC 都能很好的用于中药成分含量分析。
（四）其他
共振散射光谱法、单扫示波极谱法、近红外漫反射光谱法（对已知总黄酮含量的样品在1100 ~2500 nm 处扫描建立样本数据库, 对预测集样品进行分析, 结
果预测值与H PLC 真值的相关系数( r )为0. 973, 结果准确且提高了检测效率）、流动注射法-化学发光, 电化学法, 免疫化学发光, 这些检测灵敏度高的分析方法也将逐步应用于总黄酮的含量测定。
二、总黄酮的作用
1、对造血系统的保护作用
2、对免疫系统的保护作用
3、清除自由基、抗氧化作用
4、保护DNA
三、为什么测植物中总黄酮的含量多用芦丁做对照品？
1 芦丁有典型的黄酮类结构和紫外特征，在总黄酮家族中是比较典型的代表物质。
2 芦丁在很多含有黄酮类物质的植物中广泛存在，而且含量比较高。
3 芦丁比较容易分离得到纯体，作为对照品比较易得。
四、芦丁标准溶液的配制
称量13.2mg芦丁，用60%乙醇定容到25ml容量瓶作为标准溶液。
备注：如有不恰当的地方，请老师尽管指点。