PCR及其衍生技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十一章,聚合酶链反应 PCR及其衍生技术,1,PCR,的用途,体外扩增特异,DNA,片段,的技术，能,快速,、,特异,地扩增目的,DNA,片段。,能通过试管内的数小时反应将特定的,DNA,片段扩增数百万倍。,迅速获取大量的单一核酸片段，为分子生 物学研究提供了强大的工具。,2,1953,年，,Watson,和,Crick,提出,DNA,双螺旋结构及,半保留复制,模型。,1958,年，,Meselson,和,Stahl,用实验证实,DNA,半保留复制模型。,70,年代以来，人们采用两种思路去尝试建立基因的无性繁殖体系，一是,基因克隆,技术，二是,体外扩增,技术。,发展历程,3,1971,年，,Khorana,（美国,MIT,教授，,1968,年诺贝尔医学奖得主）：“经过,DNA,变性，与合适引物杂交，用,DNA,聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆,tRNA,基因。”,核酸体外扩增最早设想被遗忘原因,:,（,1,）很难进行测序和合成寡核苷酸引物；,（,2,）,1970,年,Smith,等发现了,II,型限制性内切酶，体外克隆基因已成为可能。,4,1976,年，台湾省籍科学家钱嘉韵（,Alice Chien,）从黄石国家公园的嗜热菌,Thermus aquaticus,中分离出热稳定的,Taq DNA,聚合酶,。,1985,年，美国,Cetus,公司人类遗传研究室的,Mullis,发明聚合酶链反应（,Polymerase Chain Reaction,，,PCR,），,Saiki,等首次应用,PCR,法成功地扩增了人,-,珠蛋白的,DNA,，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。,5,1988,年,Saiki,开始将,耐热性,Taq DNA,聚合酶,应用于,PCR,，整个反应只加一次酶即可，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。,1989,年被誉为“分子年”，列,PCR,为十余项发明之首。,1993,年，,Mullis,荣获诺贝尔化学奖。,6,PCR,的基本原理,试管中进行的,DNA,复制反应，依据,DNA,半保留复制,的机理；,体外,DNA,分子于不同温度下可,变性和复性,的性质；,通过人为控制体外合成系统的温度，使,双链,DNA,变成单链,，,单链,DNA,与人工合成的,引物退火,，,DNA,聚合酶使,引物沿着单链模板延伸为双链,DNA,。,7,待扩增片段,8,9,高温变性,10,低温退火,11,中温延伸,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,PCR,每一步的转换通过,温度的改变,控制。,DNA,模板解链（,变性,）、引物与模板结合（,退火,）、,DNA,聚合酶催化新生,DNA,的合成（,延伸,）三个步骤构成,PCR,反应的一个循环。,此循环反复进行，可使目的,DNA,得以迅速扩增。,22,理论扩增率：,2,n,递增,（,n,为循环次数），,25,30,循环，目标,DNA,可增加,10,9,倍。,实际扩增率：,(,),n,，,X,为,PCR,的实际扩增率，,平均约为,75%,。,由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行,30,个循环后，扩增倍数一般可达,10,6,10,7,。,以上“变性、退火、延伸”三部曲为,PCR,一轮循环。,23,PCR,扩增曲线,24,PCR,反应体系与流程,反应体系,模板,（,DNA,或,RNA,）,引物,Taq DNA,聚合酶,10PCR,缓冲液,1.5,4,mM,Mg,2+,0.2,mM,dNTP,反应流程,预变性,变性,退火,延伸,延伸完全,终止,25,35,循环,25,一、PCR 的反应体系,引物（,primer,）,酶,（,Taq DNA polymerase,）,dNTP,模板（,template,）,Mg,2+,（,magnesium,）,26,1、引物,引物：决定,PCR,反应的特异性,PCR,产物的特异性取决于引物与模板,DNA,互补的程度,理论上，只要知道任何一段模板,DNA,序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用,PCR,就可将模板,DNA,在体外大量扩增,27,基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。,引物设计的原则,28,引物长度：,15-30bp，常用20bp左右,引物的有效长度不能大于 38 bp，否则最适,延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度,（74），不能保证PCR,扩增产物的特异性,引物扩增跨度：,以,500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段,29,引物碱基：,G+C,含量以,40-60%,为宜,G+C,太少扩增效果不佳，,G+C,过多易出现非特异条带,ATGC,最好随机分布，避免,5,个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其,3,端不应超过,3,个连续的,G,或,C,，因为这样会使引物在,G+C,富集区 引发错误延伸,避免引物内部出现二级结构和引物间互补,特别避免,3,端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带,30,31,引物 3端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰）,特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端,碱基不配对而导致PCR,失败,引物,5端可修饰,引物5端限定着PCR产物的长度，但对扩增特,异性影响不大；引物5端碱基可不与模板DNA,互补而呈游离状态；引物5端最多可加10个碱,基而对PCR反应无影响,32,3,5,3,5,限制性内切酶的识别序列,启动子序列,定点突变,探针标记,33,引物的特异性：,引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性,引物量：,每条引物的浓度0.1 0.5,M，以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会,34,实例：设计人类GAPDH基因mRNA的引物,用,Primer Premier,软件设计引物；,在,UCSC Genome Browser,上验证（如果失败则重新设计）,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,我们设计的引物，是根据,GAPDH,的,mRNA,序列设计的，理论扩增长度是,318bp,，但它却在人类基因组上扩增出了,两个片段,；,第一个片段来自,12,号染色体,的扩增，长度为,2409bp,；第二个片段来自,X,染色体,的扩增，片段长度是,318bp,。,那么，那个扩增片段才是正确的呢？我们设计的这一对引物可否用于扩增人类,GAPDH,基因片段呢？,45,46,47,12号染色体扩增出的序列是真正的GAPDH基因。,在下面的序列比对中，我们可以发现，X染色体上被扩增出的序列实际上是GAPDH的,加工的假基因,（,processed pseudogene,）。,因此，如果我们能保证作为模板的cDNA不混杂有染色体DNA，就可以用这一对引物扩增GAPDH。,48,2、酶及其浓度,目前有两种 Taq DNA,聚合酶供应,天然酶：从水生嗜热杆菌中提纯,基因工程酶：大肠菌合成,一个典型的,PCR反应约需酶量1-2.5U/100 ul体系,浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少,49,50,Taq 酶的保真性不高,53聚合酶活性和53外切酶活性，无35外切活性;,在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能的。保真性不如,Pfu,DNA聚合酶,等。,51,3、dNTP 的质量与浓度,在,PCR,反应中，,dNTP,应为,50,200,M,，浓度过低会降低,PCR,产物的产量,注意,4,种,dNTP,的浓度要相等（等摩尔配制）,如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配,高浓度的,dNTP,可与,Mg,2+,结合，使游离的,Mg,2+,浓度下降，影响,DNA,聚合酶的活性,52,4、模板DNA,模板DNA的来源：,微生物中提取DNA,从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛,发、精斑、口腔上皮细胞,固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化,模板DNA的浓度：,0.12ug/100ul体系,PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高,模板DNA浓度过高导致非特异性产物增加,53,5、Mg,2+,浓度,Mg,2+,对PCR扩增的,特异性,和,产量,有显著的影响,在一般的 PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg,2+,浓度为1.52.0 mmol/L为宜,Mg,2+,浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少,54,二、PCR 的反应流程,温度与时间的设置,循环次数,常见问题,55,1、温度与时间的设置,设置变性-退火-延伸三个温度点,标准反应中采用,三温度点法,，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至4060退火，然后快速升温至7075延伸，,对于较短靶基因（长度100300bp）可采用,二温度点法,，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸。,56,变性温度与时间：,一般9394，1min足以使模板变性,若低于,93则需延长时间,但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。,57,退火(复性)温度与时间：,退火温度是影响PCR特异性的重要因素,退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度,对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，,55,作为选择最适退火温度的起点较为理想,58,引物的复性温度,通过以下公式帮助选择合适的温度：,Tm（解链温度）4(G+C)+2(A+T),复性温度=Tm值（510,）,在,Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR,反应的特异性,复性时间一般为,3060s，足以使引物与模板之间完全结合,59,延伸温度与时间：,Taq DNA聚合酶的生物学活性：7080,150,核苷酸/S/酶分子 70,60,核苷酸/S/酶分子 55,24,核苷酸/S/酶分子 高于90时，DNA合成几乎不能进行,60,延伸温度与时间：,延伸温度：一般选择在7075,之间,常用温度为,72,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。,延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定,1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）,34kb的靶序列需34min,扩增10kb需延伸至15min,延伸时间过长会导致非特异性扩增,对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些,61,2、循环次数,循环次数,决定,PCR,扩增程度,循环次数,主要取决于模板,DNA,的浓度,循环次数：,选在,3040次之间,循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多,62,如何提高,PCR,中的,DNA,聚合酶的保真性？,在,PCR,反应体系中，除使用,Taq,DNA,聚合酶，掺入少量的,具有,35,外切酶活性的耐热,DNA,聚合酶，如,Pfu,，,Vent,，,Pwo,等,，错配率可降为原来的,1/10,；,Mg,2+,浓度,尽可能低，但不影响,DNA,合成；,减少高温反应时间，这样,DNA,热损伤将减少；,减少循环数。,63,如何提高,PCR,扩增的特异性？,升高退火温度可增加引物与模板结合的特异性；,缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及多余的,DNA,聚合酶分子参与酶促延伸的机会；,降低引物和酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是能减少引物二聚体的引发；,改变,Mg,2+,的浓度可进一步提高扩增的特异性。,64,引物设计的特异性；,减少循环次数；,热启动（,Hot Start,）,。即首先将模板变性，然后在较高温度时加入,Taq,DNA,聚合酶、引物及,MgCl,2,等一些重要成分，这样使得引物在较高温度下与模板退火，提高了反应的严谨性，使扩增更特异；,采用二对引物即外引物和内引物进行扩增来提高扩增的特异性。,65,PCR,技术的主要类型,（1,）反向,PCR,技术,(Inverse PCR,IPCR),：,（,2,）锚定,PCR,技术,(Anchored PCR,APCR),：,（,3,）不对称,PCR,技术,(asymmetric PCR),：,（,4,）反转录,PCR,技术,(reverse transcription PCR,RT-PCR),：,（,5,）巢式,PCR,技术,(NEST-PCR),：,（,6,）多重,PCR,技术,(multiplex PCR),：,（,7,）重组,PCR,技术：,（,8,）原位,PCR,技术：,（,9,）荧光定量实时,PCR,技术,技术,66,（,1,）反向,PCR,技术,(Inverse PCR,IPCR),：,反向,PCR,是克隆已知序列旁侧序列的一种方法。,一种在已知序列中无 切点的限制性内切酶消化基因组,DNA,。,酶切片段自身环化。,以环化的,DNA,作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。,扩增产物是线性的,DNA,片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼,DNA,序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板,DNA,，再通过反向,PCR,获得未知片段。,67,cDNA,末端快速扩增技术（,rapid amplification of cDNA ends，RACE）,通过,RT-PCR,技术由已知部分,cDNA,序列来得到完整的,cDNA5,和,3,端，包括单边,PCR,和锚定,PCR,。,1.,基于蛋白质保守性的兼并引物的设计及,ORF,保守区,RT-PCR,克隆；,2.3-RACE,3.5-RACE,68,1.,基于蛋白质保守性的兼并引物的设计及,ORF,保守区,RT-PCR,克隆；,利用,ncbi,搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或,cDNA,编码的氨基酸序列因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。,对所找到的序列进行多序列对。,确定合适的保守区域 设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距,50,400,个,aa,为宜，使得,pcr,产物在,1501200bp,之间，最重要的是每一个保守区域至少有,6,个,aa,残基，因为每条引物至少,18bp,左右。利用软件设计引物,R,A,G,，,Y,C,T,，,M,A,C,，,K,G,T,，,S,C,G,，,W,A,T,，,H,A,C,T,，,B,C,G,T,，,A,C,G,，,D,A/G/T,N=A,C,G/T,密码子的兼并性,氨基酸密码子数,、,、,、,、,69,70,RT-PCR,及定量,RT-PCR,（,1,）,RT-PCR,（,reverse transcription-PCR,）,原理：先在逆转录酶的作用下、以,mRNA,为模板合成互补的,cDNA,（,complementary DNA,），再以,cDNA,为模板进行,PCR,反应。,是一种快速、简便、敏感性极高的检测,mRNA,表达的方法。,PCR,技术的主要类型,71,72,常用的两种逆转录酶,AMV,（,avian myeloblastosis virus,）：,酶活性最适温度,42,MMLV,（,Moloney murine leukemia virus,）：,酶活性最适温度,37,73,（,2,）定量,RT-PCR,（,qRT-PCR,）：,利用,RT-PCR,对,mRNA,水平进行半定量或绝对定量分析。,74,半定量,RT-PCR,选用在组织中普遍表达、表达量比较恒定的管家基因,mRNA,作为内源性基因模板标准。,管家基因,mRNA,和目的,mRNA,混合物共同进行逆转录，在各自的引物引导下扩增。,计算出扩增后,目的基因扩增子,/,管家基因扩增子,的比值，从而达到半定量的目的。,75,实时荧光定量,PCR,常规定量,PCR,技术：,对,PCR,扩增反应的,终产物,进行定量,重复性差,半定量,实时定量,PCR,技术：,对,PCR,扩增反应中,每一个循环的产物,进行定量,76,实时荧光定量PCR原理,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。,77,（1）Ct 值,是荧光定量PCR的一个重要的概念，C代表Cycle，t代表threshold。,含义是：,每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数,。,78,（2）荧光域值（threshold）的设定,PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10 SDcycle,3-15,79,Ct,值的确定,80,（3）Ct值与起始模板的关系,理想的,PCR,反应：,X=X,0,*2,n,非理想的,PCR,反应：,X=X,0,(1+Ex),n,n,：扩增反应的循环次数,X,：第,n,次循环后的产物量,X,0,：初始模板量,Ex,：扩增效率,81,在扩增产物达到阈值线时,:,X,Ct,=X,0,(1+Ex),Ct,=M (1),X,Ct,：,荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。,在阈值线设定以后，它是一个常数，我们设为,M,。,方程式,(1),两边同时取对数得,:,log M=log X,0,(1+Ex),Ct,(2),整理方程式,(2),得,:,log,X,0,=-log(1+Ex)*,Ct,+log M,(3),Log,浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到,域值的循环数即,Ct,值，,就可计算出样品中所含的模板量。,82,模板,DNA,量越多，荧光达到域值的循环数越少，即,Ct,值越小,Log,浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品,Ct,值，就可以计算出样品中所含的模板量,83,确定未知样品的,C(t),值,通过标准曲线由未知样品的,C(t),值推算出其初始量,Sample,25,84,（4）荧光标记方法,可分为两种：,荧光探针（Taqman）,荧光染料（SYBR Green）,85,86,87,