大鼠缺血性脑损伤引起学习记忆障碍及心率变异性改变.pdf

生理学报 Acta Physiologica Sinica,February 25,2007,59(1):35-41http:/35研究论文Received 2006-07-12 Accepted 2006-11-08This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.30370386,304704530,30640037)and theMunicipal Science Foundation of Tianjin(No.06YFJMJC09400).*Corresponding author.YANG Zhuo:Tel:[phone];E-mail:;ZHANG Tao:Tel:[phone];Fax:[phone];E-mail:大鼠缺血性脑损伤引起学习记忆障碍及心率变异性改变大鼠缺血性脑损伤引起学习记忆障碍及心率变异性改变李 董1，杜春芸2，汤晓军1，金英雄1，雷 霆1，姚 扬2，杨 卓2,*，张 涛1,*南开大学1生命科学学院，生物活性材料教育部重点实验室；2医学院，天津 300071摘摘 要：要：本研究通过建立高脂缺血性脑损伤大鼠模型，进行水迷宫实验和心率变异性(heart rate variability,HRV)的功率谱分析，探讨脑损伤前后大鼠学习记忆的变化及缺血对自主神经的影响。23 只成年雄性Wistar 大鼠随机分为对照组(n=10)、高脂组(n=6)和高脂缺血组(n=7)。高脂组和高脂缺血组大鼠均饲以高脂饲料制成高血脂大鼠模型。各组大鼠进行水迷宫实验后，高脂缺血组用双侧颈总动脉结扎(2-VO)法制作缺血再灌注模型，同时记录心电图。7 d 后各组大鼠再次进行水迷宫实验和记录心电图，对HRV 序列进行基于快速傅立叶转换(fast Fourier transformation,FFT)的功率谱分析。结果：(1)第一次水迷宫测试，3 组大鼠空间探索实验和定位航行实验结果无统计学差异；第二次水迷宫实验，高脂缺血组与其它两组相比，空间探索实验中平台所在象限的记忆频度明显下降(P0.01)，定位航行实验中平台所在象限的记忆频度显著下降(P0.01)，10 圆环记忆得分显著下降(P0.001)，但高脂组与对照组相比无明显差异。(2)高脂缺血组缺血后心率持续下降；缺血时HRV 中频段功率(0.20.6 Hz)呈现明显下降的趋势，高频段功率(0.62.5 Hz)缓慢下降，中频/高频功率比值明显下降(P0.05)。(3)缺血7 d 后高脂缺血组与高脂组相比，心率明显加快，HRV 的中频段功率无显著变化，高频段功率明显下降，中频/高频功率比值显著增高(P0.05)。结果表明，缺血过程中高脂缺血组大鼠的自主神经活动降低，交感神经活动相对于迷走神经活动减弱。缺血 7 d 后，由于海马区神经元对缺血敏感易受损，造成高脂缺血组大鼠学习记忆障碍，同时引发迷走神经活动下降，大鼠交感-迷走神经系统平衡失调。关键词：关键词：脑缺血再灌注；认知障碍；Morris 水迷宫；心率变异性中图分类号：中图分类号：Q424Changes of heart rate variability and impairment of learning and memoryinduced by cerebral ischemia/reperfusion in ratsLI Dong1,DU Chun-Yun2,TANG Xiao-Jun1,JIN Ying-Xiong1,LEI Ting1,YAO Yang 2,YANG Zhuo2,*,ZHANG Tao1,*1Key Laboratory of Bioactive Materials,Ministry of Education,College of Life Science;2College of Medicine,Nankai University,Tianjin 300071,ChinaAbstract:The present study was designed to observe the influence of cerebral ischemia/reperfusion injury on learning and memory inhyperlipidemic rats and estimate the changes of activity of autonomic nervous system.Twenty three male Wistar rats were randomlydivided into three groups,named control group(C group,n=10),hyperlipidemia group(H group,n=6)and hyperlipidemia-ischemiagroup(HI group,n=7),respectively.The rats in H and HI group were fed a high-fat diet for 2 weeks and the rats in all groups wereexamined through Morris water maze(MWM)task.The rats in HI group underwent ischemia/reperfusion by 2-vessel occlusion(2-VO)method,and had electrocardiogram(ECG)recording simultaneously.The MWM task and ECG recording were taken again after 7 d ofrecuperation.The following results were obtained:(1)In the second place navigation performance and probe trial performance,thefrequency of memory in quadrant of hidden-platform and memory score decreased significantly in HI group compared to that in C andH groups.(2)The heart rate in HI group decreased slowly after ischemia;the power at high frequency band(HF)reduced gradually,meanwhile the power at middle frequency band(MF)and the ratio of power at MF and HF decreased clearly compared to baseline value.生理学报 Acta Physiologica Sinica,February 25,2007,59(1):35-4136(3)After 7 d of ischemia/reperfusion,the heart rate in HI group was significantly higher than that in H group(P0.05).While there wasno statistical change in the power at MF,the power at HF decreased and the ratio of MF/HF increased significantly(P0.05).The datademonstrated that ischemia/reperfusion decreased the activity of autonomic nervous system,and the reduction of sympathetic nerveactivity was much more than that of vagus nerve activity.The results suggest that the hippocampus neuron injury caused by ischemiainduces cognitive disorder and imbalance of vago-sympathetic nerve activity accompanied by vagus nerve suppression.Key words:ischemia/reperfusion;cognition disorder;Morris water maze;heart rate variability脑缺血疾病占脑血管病人的60%85%，常留有较严重的后遗症1，如偏瘫、失语、认知障碍等。由缺血及再灌注造成的离子稳态失衡、兴奋性神经介质的释放及氧自由基大量产生等一系列瀑布样效应是导致缺血性神经细胞大量凋亡的重要机制2,3。神经系统中海马神经元对缺氧缺血损伤较敏感，更易因细胞凋亡产生细胞损伤4。海马又与学习记忆功能密切相关，脑缺血导致的海马神经元损伤会造成脑认知功能的障碍。海马区神经元和孤束核的一般内脏区存在多突触连接，可以影响中枢神经系统的活动5。通过神经电生理参数的分析，可以反映缺血性脑损伤发生时的交感迷走神经活动的特征。本研究通过建立接近血管性痴呆实际情况的高脂状态下缺血性脑损伤大鼠模型，经Morris水迷宫(Morris water maze,MWM)实验及心率变异性(heartrate variability,HRV)的频谱分析，探讨脑缺血前后大鼠学习记忆的变化及缺血对自主神经系统的影响。1 材料与方法材料与方法1.1 高血脂大鼠模型高血脂大鼠模型23 只健康成年雄性 Wistar大鼠体重(25621)g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供 随机分为对照组(C,n=10)，高脂组(H,n=6)和高脂缺血组(HI,n=7)。高脂组和高脂缺血组大鼠饲以特殊高脂饲料(3%胆固醇，10%猪油，0.2%甲基硫氧嘧啶，0.5%胆盐，86%基础饲料)，对照组大鼠饲以普通基础饲料。2周后，大鼠内眦静脉取血 1 mL，检测血液中血清总胆固醇(total cholesterol,TC)和甘油三酯(triglyceride,TG)的浓度(日立 7020 全自动生化分析仪)。1.2 动物行为学实验动物行为学实验MWM实验(北京新天地公司RB-100A型)分为定位航行实验(place navigationperformance)和空间探索实验(probe trial performance)两个部分。实验分两次进行，第1 次在检测大鼠血脂浓度合格后进行，第二次在大鼠缺血再灌注手术恢复7 d后进行。(1)定位航行实验：连续训练5 d，每天分两个时间段训练：开始时间上午8 时和下午6 时，两次间隔10 h。在每个时间段训练4 次，分别从4 个坐标象限内标定的入水点将大鼠面向池壁放入水中，并使大鼠头朝向同侧，强迫大鼠游泳，学习寻找没于水面以下的平台。每次训练间隔为10min。(2)空间探索实验：设置实验参数后，撤去平台，取第 1 象限入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录其在120 s 内游泳的行为表现。(3)MWM实验所使用的参数：在实验过程中大鼠在各象限寻找平台所用的时间占总时间的百分比为各象限的时间分布；在实验过程中大鼠在以平台为圆心的10个环内的轨迹点数与该圆环值的乘积为在该圆环中的记忆得分。1.3 缺血模型制作及电生理记录缺血模型制作及电生理记录采用双侧颈总动脉结扎(2-vessel occlusion,2-VO)法。高脂缺血组大鼠麻醉后(10%水合氯醛，3 mL/kg)，分离双侧颈总动脉，用微动脉夹阻断血流3次，每次30min，间隔2 次打开微动脉夹再灌注，每次10 min。利用PowerLab系统(澳大利亚埃德仪器公司)记录实验过程中的心电图(electrocardiogram,ECG)。对照组和高脂组大鼠只做分离颈总动脉后缝合的假手术对照。第2 次MWM 实验结束后，再次记录各组大鼠 ECG。1.4 细胞学染色细胞学染色电生理实验结束后，大鼠经4%甲醛灌流后快速断头取脑，采用苏木素-伊红(HE)染色。普通光镜下观察海马区神经元细胞损伤情况。1.5 数据处理数据处理对连续记录的ECG 信号，以120s 取样，获得心搏间期(RR interval,RRI)，经过等间距处理之后，应用快速傅立叶变换(fast Fouriertransformation,FFT)得到以频率为横坐标、功率为纵坐标的关于HRV的功率谱。功率谱频段取值范围为02.5 Hz，并分为：低频段(low frequency band,LF,0.040.2 Hz)、中频段(middle frequency band,MF,0.20.6 Hz)、高频段(high frequency band,HF,37李 董等：大鼠缺血性脑损伤引起学习记忆障碍及心率变异性改变0.62.5 Hz)、总功率(totale power,TP,0.042.5Hz)，并计算中频段与高频段比值(MF/HF)。实验数据表示为meansSEM，经t检验或2检验，P0.05时认为有显著性差异。2 结果结果2.1 高血脂大鼠模型高血脂大鼠模型高脂组和高脂缺血组大鼠饲以高血脂饲料 2 周后，与对照组大鼠相比，血清内 TC 和 TG 的浓度明显升高，TC浓度从(1.8470.249)mmol/L升高到(6.4430.803)mmol/L(P0.001)，TG 浓度从(0.4840.076)mmol/L升高到(0.8970.107)mmol/L(P0.001)。2.2 行为学实验行为学实验(1)缺血前第一次MWM 实验，对照组、高脂组和高脂缺血组定位航行实验10 圆环得分见图1。空间探索实验中各象限时间分布见表 1。经统计学检验，对照组、高脂组和高脂缺血组大鼠学习记忆能力无显著差异。(2)大鼠缺血再灌注手术7 d 后，恢复良好，进行第 2 次 MWM 实验。空间探索实验中，各组大鼠各象限时间分布见表2。统计学检验表明，高脂组和高脂缺血组比较有显著差异，尤其在虚平台所在的第3 象限(P0.01)；而对照组与高脂组比较无统计学差异。定位航行实验中，对照组和高脂组10圆环得分与相应的第1次MWM实验10圆环得分比较，统计学检验无显著差异。高脂缺血组大鼠10圆环得分为1 293.44146.78，与第1次MWM实验得分相比有极显著差异(P0.001)，与对照组和高脂组大鼠第2次MWM实验得分相比，也有显著差异(P0.01)(表 3)。两次MWM实验说明高脂缺血组大鼠空间学习记忆能力发生较大障碍，而高脂组大鼠则无明显变化。2.3 缺血再灌注对心率和缺血再灌注对心率和 HRV 的影响的影响缺血再灌注过程中，高脂缺血组大鼠平均心率从(33111)下降到(2689)次/分，有显著统计学差异(P0.05,P0.05).生理学报 Acta Physiologica Sinica,February 25,2007,59(1):35-4138表1.缺血前第一次水迷宫实验各组大鼠空间探索实验中各象限时间分布(s)Table 1.Temporal distribution of every quadrant in the first probe trial performance in three groups Quadrant 1 Quadrant 2 Quadrant 3 Quadrant 4C group(n=10)28.500.9923.630.9737.491.5430.381.51H group(n=6)28.531.1720.412.1837.792.1333.282.26HI group(n=7)31.641.2924.681.7734.851.8627.171.50Total time of experiment was 120 s,and hidden-platform was located in quadrant 3.表2.第二次水迷宫实验各组大鼠空间探索实验中各象限时间分布(s)Table 2.Temporal distribution of every quadrant in the second probe trial performance in three groups Quadrant 1 Quadrant 2 Quadrant 3 Quadrant 4C group(n=10)32.453.1229.551.9038.092.50*19.912.02H group(n=6)37.137.4226.755.0534.782.80*21.355.15HI group(n=7)48.713.9125.941.9622.811.6422.541.90Total time of experiment was 120 s,and hidden-platform was located in quadrant 3.There was no significant difference between C andH groups in the second probe trial performance(P0.05);*P0.05,*P0.05).*P0.001 compared with HI group in the first MWM;P0.01compared with C and H groups in the second MWM.图2.缺血再灌注过程中高脂缺血组大鼠的心率变化Fig.2.Changes in heart rate of rats in HI group during ischemia/reperfusion.The X axis represented the process of experiment.Base,base line;Isch1,the first ischemia(from 0 to 30 min);Isch2,the second ischemia(from 40 to 70 min);Isch3,the thirdischemia(from 80 to 110 min).n=7,*P0.05,*P0.01 vs base.图 3.缺血再灌注对高脂缺血组大鼠HRV 功率谱的影响Fig.3.Effect of ischemia/reperfusion on HRV power spectrum ofrats in HI group.MF,middle frequency band(0.2-0.6 Hz);HF,high frequency band(0.6-2.5 Hz);MF/HF,the ratio of power atMF and HF band.Base,base line;Isch1,the first ischemia(from0 to 30 min);Isch2,the second ischemia(from 40 to 70 min);Isch3,the third ischemia(from 80 to 110 min).n=7,*P0.05 vs base.2.4 缺血再灌注缺血再灌注 7 d 后心率和后心率和 HRV 的改变的改变手术 7 d 后，高脂缺血组大鼠与高脂组大鼠相比，心率显著上升(38515 vs 30229,P0.05)。HRV功率谱分析表明，高脂缺血组的MF分量无明显变化，HF分量和总功率明显下降(P0.05)，MF/HF比值显著增高(P0.05，图4)。与对照组大鼠的心率(39613)相比，高脂组大鼠的心率明显降低(P0.05)，高脂缺血组大鼠的心率无显著变化，HRV功率谱分析中对照组和其他两组均无显著差异。39李 董等：大鼠缺血性脑损伤引起学习记忆障碍及心率变异性改变3 讨论讨论20多年前，MWM 实验已经用于检测实验大鼠空间学习记忆能力，现已成为行为神经科学的常用实验工具。与跳台、避暗等检测工具相比，其主要的优点表现为能提供较多的实验参数，全面考察实验动物空间认知能力；将实验动物的学习记忆障碍和感觉、运动缺陷等分离，减少对学习记忆过程检测的干扰；操作简便，数据误差较小。MWM实验可以反映出不同脑区的损伤，包括海马、纹状体、基底前脑、小脑和大脑皮层等。海马结构的整合是空间学习的基础，海马区的损伤影响到实验动物的行为学实验结果6-8，故本实验采用MWM 来检验大鼠空间认知能力的变化。反复的脑缺血再灌注损伤是血管性痴呆所致学习和记忆障碍的主要原因，2-VO法是目前研究中常用的一类方法。制作方法简单，效果确实，有利于慢性病程的观察研究。本方法可造成急性脑缺血，而后可通过基底动脉环(Willis circle)血流调节以及逐渐形成的侧枝循环所改善和代偿造成的一种慢性脑低灌注状态，从而使脑组织产生缺血缺氧性损害9。但是仅仅通过短时间的阻断正常动物两侧颈总动脉后再灌注，并不能引起脑组织的严重损伤，进而导致动物生理和认知功能的显著变化，因此，在缺血再灌注的研究中引进一些诱因来增加损伤的程度，如高血压、低血压、高血脂等10,11。老年人多伴有不同程度的血脂升高、血液黏稠度增加等血液流变学变化，因而增加了脑内血管血流发生异常的几率。根据这一发病特点，本实验通过大鼠的高血脂症模型，以此作为重要的诱因，在这一基础上进行反复的缺血再灌注，最终导致神经细胞凋亡、学习记忆能力障碍，从而较好地模拟了人类因血脂升高导致的脑缺血损伤，建立起更接近人类实际情况的大鼠全脑缺血模型。实验大鼠在术后肢体恢复良好，有利于行为学观察。大鼠在长时间饲以高脂饲料后发生心搏缓慢，继而有脂肪肝等并发症12。本实验中由于控制喂养时间为4 周内，高血脂大鼠的心率与正常对照组相比明显降低。本研究中动物行为学实验结果表明高脂缺血组大鼠有学习记忆障碍的现象，但无缺血再灌注的高血脂大鼠没有明显的学习记忆变化。这可能是由于缺血后大鼠海马区神经元对缺血敏感易受损，大量神经元凋亡，由此造成高脂缺血组大鼠缺血7 d 后学习记忆障碍。基于FFT的功率谱分析已经有效地应用于自主图 4.缺血再灌注7 d 后各组大鼠的HRV 分析结果Fig.4.Analysis of HRV in three groups 7 d after ischemia/reperfusion.LF,low frequency band(0.04-0.2 Hz);MF,middlefrequency band(0.2-0.6 Hz);HF,high frequency band(0.6-2.5Hz);MF/HF,the ratio of power at MF and HF band;TP,toalpower.*P0.05 vs H group.2.5 海马区神经元海马区神经元 HE 染色染色高脂缺血组大鼠的海马区出现大量神经元凋亡，尤其海马锥体神经元。高脂组大鼠则未出现明显的神经元损伤(图 5)。图 5.海马区神经元HE 染色Fig.5.Hematoxylin and eosin staining of hippocampal neurons.A:Rats in H group.B:Rats in HI group.Scale bar,25 m.生理学报 Acta Physiologica Sinica,February 25,2007,59(1):35-4140神经系统各个变量的分析中，如血压和肾交感神经活动13-15。HRV 分析是检查心脏RRI 变异的方法。近年来，普遍认为HRV能定量地反映心脏自主神经的活性及其调节功能。通过对基于FFT 的HRV 的功率谱分析，可以预测某些疾病的病情发展和预后。作为一种无创的，可以重复的检查方法，HRV的频域分析有一定的实用价值。大鼠的HRV信号功率谱的低频段功率反映由血管收缩神经控制的体温调节和肾素-血管紧张素系统引起的心率波动变化，可能与迟发反应时间的体液机制相关；中频段功率反映了通过压力反射的耦合作用，经过交感与副交感传出纤维所共同介导的心率波动变化，受心脏交感与副交感神经活动的双重影响；高频段功率反映起源于呼吸活动，经心脏副交感神经传出活动所介导的心率波动变化，单独受心脏迷走神经支配，是检测心脏迷走神经活性的定量指标，MF/HF比值是反映心脏交感和迷走神经活动平衡的指标16,17。交感与迷走神经之间的相互影响很复杂，但是在有些情况下会出现HRV分析与神经活动不相符合的情况，这就需要一些直接的证据来验证交感与迷走神经的活动，比如肾交感神经。本结果表明高血脂大鼠2-VO 时脑供血不足，大脑各功能区的活动受到了影响。其原因可能与大脑扩布性抑制(spreading de-pression,SD)18 有关，即脑卒中时缺血远侧和/或对侧区出现的皮层电生理异常。在临床上将观察到的脑缺血患者伴有心功能紊乱的一系列表现称之为“脑-心卒中”。脑缺血时心血管功能障碍与 SD 二者之间具体相互关系还有待于验证。中枢心血管特定调节区域下丘脑、脑干、海马区等受到影响时，自主神经活动性同步降低，交感神经的活动相对于副交感神经活动相对减弱，大鼠心率下降。中枢神经系统中与自主神经有关的神经核团，如孤束核的一般内脏运动核和海马区存在多突触连接5，脑缺血再灌注后海马的神经元损伤，通过此通路影响到自主神经相关神经核团，导致自主神经活动发生变化。有文献报道HRV主要由迷走神经调节19，本实验的 HRV 分析表明，脑缺血 7 d 后，正是迷走神经活动下降，造成高脂缺血组大鼠交感/副交感神经平衡失调，表现为心率明显加快。从自主神经的变化也反映出自主神经活动的变化可能是由于中枢神经系统海马区的损伤造成的。本研究的结果表明，临床上脑缺血再灌注发生和发生后监控ECG等生理参数可以间接反映自主神经活动的变化，增加对缺血发生时心血管变化的了解；结合本实验中实验动物的认知障碍情况，可以对缺血后认知障碍等后遗症的预报和初步治疗积累数据。参考文献参考文献1Johnston SC,Fayad PB,Gorelick PB,Hanley DF,ShwayderP,van Husen D,Weiskopf T.Prevalence and knowledge oftransient ischemic attack among US adults.Neurology 2003;60:1429-1434.2Macdonald RL,Stoodley M.Pathophysiology of cerebralischemia.Neurol Med Chir(Tokyo)1998;38(1):1-11.3Padosch SA,Vogel P,Bottiger BW.Neuronal apoptosisfollowing cerebral ischemia:Basis,physiopathology and treat-ment strategies.Anaesthesist 2001;50:905-920.4Remolleau S,Aggoun-Zouaoui D.Apoptosis and programmedcell death:a role in cerebral ischemia.Biomed Pharmacother1998;52(6):264-269.5Castle M,Comoli E,Loewy AD.Autonomic brainstem nucleiare linked to the hippocampus.Neuroscience 2005;134:657-669.6DHooge R,De Deyn PP.Applications of the Morris watermaze in the study of learning and memory.Brain Res Rev2001;36(1):60-90.7Morris R.Developments of a water maze procedure forstudying spatial learning in the rat.J Neurosci Methods 1984;11:47-64.8Feng Y(冯寅),Zhang LX,Chao DM.Role of melatonin inspatial learning and memory in rats and its mechanism.ActaPhysiol Sin(生理学报)2002;54(1):65-70(Chinese,Englishabstract).9Corbett D,Nurse S.The problem of assessing effectiveneuroprotection in experimental cerebral ischemia.ProgNeurobiol 1998;54:531-548.10 Bendel O,Alkass K,Bueters T,von Euler M,von Euler G.Reproducible loss of CA1 neurons following carotid arteryocclusion combined with halothane-induced hypotension.Brain Res 2005;1033(2):135-142.11 Sugawara T,Kawase M,Lewen A,Noshita N,Gasche Y,Fujimura M,Chan PH.Effect of hypotension severity onhippocampal CA1 neurons in a rat global ischemia model.Brain Res 2000;877(2):281-287.12 Zbinden G,Brandle E,Pfister M.Modification of adriamycintoxicity in rats fed a high fat diet.Agents Actions 1977;7(1):163-170.13 Zhang T,Johns EJ.Somatosensory influence on renal sympa-thetic nerve activity in anaesthetised Wistar and hypertensiverats.Am J Physiol 1997;272:R982-R990.41李 董等：大鼠缺血性脑损伤引起学习记忆障碍及心率变异性改变14 Zhang T,Johns EJ.Chaotic characteristics of renal nerve peakinterval sequence in normotensive and hypertensive rats.ClinExp Pharmacol Physiol 1998;25(11):896-903.15 Yang Z,Zhang T,Coote JH.Synchrony analysis betweenblood pressure and sympathetic nerve signal inhibited byatrial receptor stimulation in Wistar rats.Exp Physiol 2002;87(4):461-468.16 Cai Y,Qiu Y,Wei L,Zhang W,Hu S,Smith PR,Crabtree VP,Tong S,Thakor NV,Zhu Y.Complex character analysis ofheart rate variability following brain asphyxia.Med Eng Phys2006;28(4):297-303.17 Cai ZF(蔡紫峰),Lei T,Jin YX,Yu J,Zhang T,Yang Z.Changes in autonomic nervous system following focal cerebralischemia in SD rats.Tianjin Med J(天津医药)2006;34(2):101-105(Chinese,English abstract).18 Martins-Ferreira H,Nedergaard M,Nicholson C.Perspec-tives on spreading depression.Brain Res Rev 2000;32:215-234.19 He SY(贺书云),Hu SJ,Wang XH,Han S.The role of vagalinnervation in the variability of heart beat.Acta Physiol Sin(生理学报)2002;54(2):129-132(Chinese,Englishabstract).