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第 35 卷第 l 期2004 年 2 月解剖学报ACTA ANATOMICA SINICAVoI.35，No.lFeb.2004幽门螺旋杆菌对慢性胃炎患者粘膜内 D 细胞及生长抑素 mRNA 表达的影响葛振华l!周凡l武一曼2周维湛l唐福康l（l.福建省中医药研究院，福州350003；2.福建中医学院，福州350003）摘要 目的了解幽门螺旋杆菌（Hp）感染与慢性胃炎患者胃窦粘膜内 D 细胞及生长抑素 mRNA+细胞（DmRNA+细胞）减少的关系。方法免疫细胞化学和原位杂交技术。结果正常组 D 细胞与 Hp-胃炎组无差别（P 0.05），但 Hp+胃炎组 D 细胞显著减少，与 Hp-胃炎组相比有显著性差异（P 0.0l）。D mRNA+细胞，Hp+胃炎组也低于其他 2 组且有显著性差异（P 0.05），but in the HP+group，the D ceIIs markedIy reduced as compared with HP-group and showed a significantIydifference（P 0.0l）.Somatostatin mRNA+ceIIs in the HP+gastritis group was aIso Iower than that of the other two groups，andhad a significant difference（P 0.0l）.ConclusionThe D ceIIs and somatostatin mRNA+ceIIs decreased in the HP+groupcIoseIy reIated to the Hp infection，which can be abIe to reduce the inhibition of G ceII s secretion by D ceII producingsomatostatin，but the transcription of somatostatin gene and protein synthesis were runing weII.Key wordsChronic gastritis；D ceIIs；Somatostatin mRNA+ceIIs；Immunocytochemistry；in situ hybridization；HeIicobacter pyIori收稿日期 2002-07-23 修回日期 2002-ll-29基金项目 福建省卫生厅科研基金资助课题（96057）作者简介 葛振华（l929），男（汉族），山东省寿光县人，研究员。!通讯作者（To whom correspondence shouId be addressed）E-maiI：cdefgpubITeI：（059l）3570808人与动物胃窦粘膜腺上皮中，散在分布着较多G细胞和 D 细胞。G 细胞分泌胃泌素，可刺激壁细胞分泌胃酸及粘膜生长；而 D 细胞则分泌生长抑素，以旁分泌方式调节 G 细胞胃泌素的分泌l。G、D 细胞功能上协调，维持了生理性胃酸分泌。近年的研究证实，幽门螺旋杆菌（heIicobacter pyIori，Hp）感染的慢性胃炎患者，胃粘膜中 G、D 细胞比例失去了平衡，D 细胞数量显著下降。由于 D 细胞的减少，降低了生长抑素对胃泌素释放的抑制作用，从而使有的病人出现高胃泌素血症（hypergastrinemia）2，胃溃疡和十二指肠溃疡的发病率也大为增加3。但是D 细胞减少的原因还不太清楚，是否 Hp 影响了 D细胞生长抑素基因的转录和蛋白的合成。本研究拟用免疫细胞化学和原位杂交技术，探讨 Hp-和 Hp+慢性胃炎患者粘膜内 D 细胞数目的改变，及生长抑素 mRNA 在 D 细胞内的表达，目的是在细胞和分子水平上阐明 Hp 与 D 细胞减少的关系，并为临床治 疗提供实验和理论依据。材料和方法1.标本的选择所有胃镜活检标本，均取自胃窦大弯部粘膜，受检者均经尿素酶检测 Hp。正常组 7 例，慢性胃炎组25 例，其中 15 例为 Hp 阳性，10 例为 Hp 阴性。2.切片制备活检标本均用 LiIIie 固定液固定，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，厚 4!m，用 0.1%多聚赖氨酸贴片，HE 染色，做一般病理学诊断。3.免疫细胞化学染色方法切片脱蜡入水，入 0.2moI/L HCI 20 min（阻断内源性碱性磷酸酶），流水洗5min；入 pH7.4 的 PBS（含0.1%Triton X-100）20 min，PBS 洗 5 min；除去多余液体，滴加 10%正常羊血清室温 20 min（减少背景非特异性染色）；去除多余血清后，滴加兔抗人生长抑素抗体（福州迈新公司，1150），将切片置潮湿容器内，4C冰箱过夜。次日取出，室温放置 30 min，PBS 洗 5minX 2；滴加即用型生物素标记的羊抗兔 IgG 抗体（福州迈新公司），室温 45 min，PBS 洗 5 min X 2；滴加碱性磷酸酶标记的链亲合素（Dako 公司，11100），室温 30 min；入 PBS 5 min，pH8.8 Tris-HCI 缓冲液 10min，用 BCIP/NBT 混合液显色，在暗处反应 10 15min，入 5 mmoI/L EDTA 终止反应，流水洗 5 min，甘油明胶封片。阴性对照片用 PBS 代替第一抗体，其他步骤与实验片相同。4.生长抑素 mRNA 原位杂交试剂的配制和步骤基本按照 Larsson 的方法进行4。4.1杂交步骤：切片脱蜡入水，加 0.2 moI/L HCI配制的 0.03%胃蛋白酶（Sigma 公司）室温消化 20min；入高压消毒的蒸馏水 5 min X 2，入 4%多聚甲醛固定 5 min；PBS 洗 5 min X 2，除去多余液体，加杂交液（探针+杂交缓冲液），置潮湿容器内，55C温箱孵育过夜。杂交液中探针浓度 50!g/L，探针由丹麦国家血清研究所 Larsson 教授赠送，探针序列为 Som5-TGA GTT AGC AGA TCT CTG CAG CT-3，与人生长抑素 mRNA 互补，生物素标记。次日取出，室温放置 10 min，用预热的 0.3 X SSC 40C洗 15 min X 4。4.2杂交后信号的检测：PBS 洗 5 min X 2，入阻断液（PBS 含 1%BSA，0.1%Triton X-100）室温 30 min，PBS洗 5 min X 2，加鼠抗生物素抗体（Dako 公司，11100）室温 45 min；PBS 洗 5 min X 2，加生物素标记的兔抗鼠 IgG（Dako 公司，11100）室温 30 min；PBS 洗5 min X 2，加碱性磷酸酶标记的链亲合素（Dako 公司，11100）室温 30 min；pH7.4 洗液洗 5 min X 4，入pH8.8 预检测缓冲液 3 min X 2，加 BCIP/NBT 混合液，显色 10 15 min，显微镜下观察。当阳性信号由红棕色变为蓝黑色时，入 5 mmoI/L EDTA 终止反应 5min。流水洗 5 min，甘油明胶封片。阴性对照片不加探针，用杂交缓冲液代替，其他步骤同实验片。全部操作过程需戴手套，所需器材必须高压消毒，以免被 RNA 酶污染，影响实验结果。5.统计学处理在高倍镜下（X 40），对每个标本连续计数 10 个网格内的 D 细胞及生长抑素 mRNA 阳性细胞，网格面积为 0.1662 mm2。先计算每个标本单位面积内阳性细胞的均值，再分别计算正常组、Hp-胃炎组、Hp+胃炎组各组阳性细胞的均值、标准差，并进行统计学处理和比较。结果免疫细胞化学结果显示，D 细胞为蓝黑色，对照片阴性，D 细胞散在分布于腺上皮之间。生长抑素不仅布满胞质而且突起也见到生长抑素阳性反应，这些突起多为横断面，胞核阴性（图 1 3）。3 组 D细胞单位面积内的数目见附表。生长抑素 mRNA 多位于核周（图 4 6）或核上区（图 4），有的突起内也有 mRNA 阳性物质（图 4）。3 组生长抑素 mRNA 阳性细胞（D mRNA+细胞）单位面积内的数目见附表。附表正常组与 Hp-和 Hp+胃炎组胃窦粘膜 D 细胞及 D mRNA+细胞数的比较TaIbeTo compare the number of D ceIIs and D mRNA+ceIIs in antraI mucosa between the controI group andHp-，Hp+gastritis groups组别groups例数casesD 细胞D ceIIs生长抑素 mRNA+细胞D mRNA+ceIIs正常组controI group713.19 1 1.3412.15 1 1.62Hp-胃炎组Hp-gastritis group1012.29 1 2.3511.18 1 2.50!Hp+胃炎组Hp+gastritis group152.80 1 0.77!2.34 1 0.21!注：与正常组比较：!0.05，!0.01；与 Hp-胃炎组比较：!0.01Note，To compare with controI group：!0.05，!0.01；tocompare with Hp-gastritis group：!0.05），但 Hp+组远低于 Hp-组，有显著性差异（!0.01）。D mRNA+细胞单位面积内数目，正常组均高于其他两组，与 Hp-组比较!0.05，与 Hp+组比较!0.01，Hp+组与 Hp-组比较则!0.01。98VoI.35，No.1葛振华等.幽门螺旋杆菌对慢性胃炎患者粘膜内 D 细胞及生长抑素 mRNA 表达的影响图 l正常人胃窦粘膜 D 细胞（!），生长抑素阳性反应位于细胞底部，突起也呈阳性反应（）。X 40（下同）图 2Hp-胃炎组胃窦粘膜内 D 细胞（!），D 细胞突起也呈阳性反应（）。图 3Hp+胃炎组胃窦粘膜可见少数 D 细胞（!），突起阳性（）。图 4正常人胃窦粘膜生长抑素 mRNA 位于核周（!），核上区（）和突起（#）呈阳性反应。图 5Hp-胃炎组胃窦粘膜生长抑素 mRNA 位于核周区（!），突起阳性（）。图 6少数生长抑素 mRNA 阳性细胞（!）散在分布于 Hp+胃炎组胃窦粘膜内。Fig.lShowing the D ceIIs（!）in the normaI human antroI mucosa，the somatostatin was found in the basaI part of D ceII，the process was aIsodispIayed positive reaction（）.X 40（The same beIow）Fig.2The D ceIIs（!）in the antroI mucosa of Hp-gastritis group，the process of D ceII was positive too（）.Fig.3A few D ceIIs found in the antroI mucosa of Hp+gastritis group（!），the process was positive（）.Fig.4The somatostatin mRNA in the normaI human antroI mucosa Iocated in the prenucIear region（!）and supernucIear compartment（）andprocesses（#）.Fig.5The somatostatin mRNA in the antroI mucosa of Hp-gastritis group found in the prenucIear compartment（!），the process was positive（）.Fig.6Few somatostatin mRNA positive ceIIs（!）scattered in the antroI mucosa of Hp+gastritis group.09解剖学报35 卷，l 期讨论过去慢性胃炎神经内分泌的研究大多集中在 G细胞胃泌素与萎缩性胃炎、胃溃疡、胃癌、肠化生等方面5 7，而忽视了 D 细胞分泌的生长抑素在胃部疾患形成过程中的重要性。自从 Hp 被认为是引起胃部疾患的首要致病因素后，人们对 Hp 在慢性胃炎中所产生的影响进行了广泛的研究，其中也涉及到对 G、D 细胞分泌的影响，肯定了高胃泌素血症和高胃酸与 Hp 感染的关系。如 Zavros 等8比较研究了 Hp-和 Hp+胃炎患者胃镜活检标本提取的生长抑素和胃泌素，发现 Hp+患者胃粘膜中生长抑素的含量比 Hp-患者低 6 倍，而胃泌素则显著增高。Mihaijevic 等9检测了 Hp-和 Hp+胃炎患者血清中的胃泌素和生长抑素，结果显示 Hp+患者血清中的胃泌素明显高于 Hp-患者，而生长抑素则低于 Hp-患者。我们的染色结果显示，Hp-患者和正常人胃窦粘膜内的 D 细胞密度均高于 Hp+患者，并有显著性差异（P 0.01）；同时 D mRNA+细胞密度 Hp-患者高于 Hp+患者，两者之间有显著性差异（P 0.01），正常人与 Hp-患者比较也有差异（P 0.05）。提示 Hp+胃炎患者胃粘膜内 D 细胞减少，与Hp 有密切关系，并在形态学上得到证实，但其机理目前还不清楚。Lchmann 等10认为 Hp+胃炎患者在胃粘膜炎症细胞中可诱发多种炎症细胞激动素（cytokines），它 可 以 刺 激 胃 泌 素 和 胃 蛋 白 酶 原（pepsinogen）的释放，从而抑制生长抑素的合成和活性。Caiam2在体外培养中发现，Hp 可释放肿瘤坏死因子-!，它可以抑制 D 细胞释放生长抑素。我们认为 D 细胞减少的原因与 Hp 的介入有关，由于 Hp的介入导致局部炎症反应，从而改变了胃窦部适合D 细胞发育的微环境，同时 Hp 分泌的毒素也会抑制D 细胞的生长发育。由于 D 细胞分泌的生长抑素减少，进而降低了 D 细胞对 G 细胞释放胃泌素的抑制作用，结果导致某些 Hp+胃炎患者出现高胃泌素血症。从表中可看出，3 组 D 细胞及 D mRNA+细胞数基本上呈平行关系，说明 Hp 感染的胃炎患者，虽然D 细胞显著下降，但生长抑素的基因转录和蛋白合成依然正常运行，未出现 mRNA 翻译途径受阻或 D细胞储存生长抑素功能障碍。因此 Hp 得到根治后的胃炎患者，D 细胞数量可以恢复。D 细胞在机体内分布较广泛，如脑、消化道、胰脏和免疫器官等，当胃窦部缺乏生长抑素时，为什么其他脏器的 D 细胞分泌 的 生 长 抑 素 不 能 进 行 功 能 上 的 代 偿 呢？Larsson1认为，D 细胞调节 G 细胞胃泌素的分泌是通过旁分泌的方式，即 G、D 细胞紧密接触，这点在形态上得到证实，并观察到与 D 细胞接触的 G 细胞内 mRNA 比未接触的 G 细胞显著减少，说明 D 细胞分泌的生长抑素可减少胃泌素基因转录和蛋白合成。然而遗憾的是 Lamberts 等11在电镜下没有观察到 G、D 细胞接触处出现 D 细胞的分泌颗粒，因此胃窦部 D 细胞如何以旁分泌的方式来调节胃液的pH，其确切机理尚待研究。参考文献 1 Larsson LI，Hougaard DM.Evidence for paracrine somatostatinergicreguiation of gastrin gene expression by doubie staining cytochemistryand guantitationJ.J Histochem Cytochem，1994，42（1）：37-40.2 Caiam J.Heiicobacter pyiori and somatostatin ceiisJ.Eur JGastroenteroi hepatoi，1998，10（4）：281-283.3 Huang SM，Lin HH，Wen TY，et ai.Extreme hypergastrinemia byatrophic gastritis and heiicobacter pyiori infection-a case reportJ.Hepatogastroenteroiogy，2001，48（40）：1215-1216.4 Larsson LI，Hougaard DM.Non-radioactive in situ mRNA 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