香蕉穿孔线虫监测方法.doc

香蕉穿孔线虫监测方法（试行）

为规范香蕉穿孔线虫监测工作，及时发现新疫情，准确掌握疫情扩散、分布及发生动态，特制定本监测方法。本方法，适用于全省各地开展香蕉穿孔线虫监测。
1监测准备
收集当地天南星科、凤梨科、芭蕉科、香蕉、甘蔗等观赏植物和农作物的种植情况，以及香蕉穿孔线虫的发生历史和现状等有关资料，制定监测计划。
2 监测区域
2.1未发生区
重点监测高风险区域，包括曾发生过疫情的花卉生产、销售基地，境外引进天南星科、竹芋科、凤梨科、棕榈科和芭蕉科等观赏植物的集中销售场所和种植地区。主要监测是否传入香蕉穿孔线虫。
2.2发生区
重点监测发生疫情的花卉生产和销售基地。主要监测香蕉穿孔线虫的发生动态和扩散趋势。
3 监测范围
重点监测天南星科、竹芋科、凤梨科、棕榈科和芭蕉科等观赏植物种植区和销售场所。
4监测时期
寄主植物的生长期，一般全年都可进行监测。
5 监测工具
工具：铲、枝剪、砍刀、聚乙烯塑料袋、油性笔、标签、记录本等。
6 监测方法
6.1未发生区监测方法
6.1.1访问调查
向花卉生产经营者、乡镇农技人员等询问调查当地天南星科等花卉植物的种植和病虫害发生情况，特别是苗木来源和是否有香蕉穿孔线虫发生的症状，做好访问调查记录，分析是否存在香蕉穿孔线虫可疑发生区。对询问过程中发现的香蕉穿孔线虫可疑发生地区进行深入重点调查。
6.1.2踏查
对访问调查过程中发现的香蕉穿孔线虫可疑发生区和其他有代表性的花卉种植和销售地区进行踏查（目测观察）。在花卉生长期进行2-3次踏查，踏查数量一般应不少于种植面积（株数）的50%。如果发现症状，详细记录所发现的可疑症状（附表1），发病程度，出现的地点，表现症状的面积（株数），确定疑似发生区。
6.1.3定点调查
对踏查过程中发现的疑似发生区和其他高风险区域进行定点调查。用GPS确定需定点调查区域的地理位置，从苗期开始，在植物生长期采用5点取样法或随机取样法进行2次以上调查，统计疑似发病株率。结果记入附表1，同时，对疑似病株按照附录2方法取样，进行室内检测鉴定。
6.1.4 经鉴定一旦发现确认新疫情，相应区域按发生区进行监测。
6.2发生区监测方法
6.2.1发生区范围监测
参照6.1各方法采取访问调查、踏查和定点调查。
6.2.2发生区发生动态监测
对发生区及其边界区域，每月调查一次，监测香蕉穿孔线虫的发生动态。
6.3 调查取样
对调查过程中发现的疑似病株和无明显症状的植物按照附录1的方法取样，填写附表1，并附上田间症状照片。
7 疫情诊断
7.1 现场诊断
在种植、销售场地，对香蕉穿孔线虫的寄主植物进行调查，观察其生长状况，对地上部分表现疑似症状的植株，采集其根部和根际介质（土壤）；若地上部无明显症状表现的，则随机抽取部分植株，观察其根部生长状况并采集根和根际介质（土壤），并根据附录2的方法进行抽样送实验室检验，将现场检验抽样结果填入附表1。
7.2 样品保存
采集的植物材料和生长介质样品放入聚乙烯塑料袋中，带回实验室分离，样品若不能及时分离，可将样品放在20℃～25℃的室内，将袋口打开透气，并注意保湿和避免阳光照射，样品保存时间不要超过1个月。
7.3 室内鉴定
按附录3的方法分离样品中的线虫，采用形态学鉴定或分子生物学方法进行鉴定。鉴定有困难的，送省级植物检疫机构或其委托的科研教学单位鉴定，并详细填写附表2。
8 监测记录
各监测点详细记录调查监测数据并填写附表1，将原始调查记录表连同相关照片、影像等资料妥善保存于县级植物检疫机构备查。
9 监测报告
县级植物检疫机构对辖区各监测点的监测结果进行整理汇总按要求上报。经鉴定确认发生新疫情时，应立即上报。

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雌虫： 雄虫： 幼虫：
A——整体 B——整体 M——侧区
C,D——头部 E,F——头部
G——头部顶面观 H——头部顶面观
I~K——尾部 L——尾部
N——侧区

雌虫： 雄虫：
A—头部，C—尾部 B—头部，D E—尾部

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附录1：
香蕉穿孔线虫形态、生物学特性及防治措施等
1 病原特征
香蕉穿孔线虫隶属于线虫门(Nematoda)、侧尾腺纲(Secernentea)、垫刃目(Tylenchida)、短体科(Pratylenchidae)、穿孔属(Radopholus Thorne, 1949)，学名Radopholus similes。
雌虫：虫体呈线形，从虫体中部向两端略渐变细；热杀死后，虫体直或稍向腹面弯。体环纹清楚；侧区有4条深浅、粗细均匀的侧线，部分有网格，侧区中带与外带基本等宽；头部低，前端平圆，不缢缩或略缢缩，头环3～4个，头架骨化强；口针和基部球发达，食道发育正常，中食道球卵圆形、有显著的中食道球瓣，后食道腺长叶状从背面或背侧面覆盖肠；阴门显著，双生殖腺、对伸，受精囊球形、有杆状的精子；尾通常呈长圆锥形，偶尔呈近圆柱形，尾的平均长度通常超过52mm，尾后部透明区平均长度通常超过9mm，透明区的环纹不规则，尾端部形态变化多样，多数呈规则或不规则锥圆形，末端钝，少数有一指状突或略分叉，尾端光滑或有不规则环纹。
雄虫：虫体呈线形，热杀死后虫体直或略向腹面弯。头部高圆、呈球形，显著缢缩，具3～5个头环，头架骨化弱或不明显；侧线4条；口针和食道显著退化，口针基部球不明显或无；中食道球不清楚；单精巢，前伸，交合刺柄强状，引带伸出泄殖腔、末端有小爪状突，交合伞伸到尾部约2/3处；尾呈长圆锥形，尾端部形态多样，末端钝圆或有一指状突。
2 寄主范围
香蕉穿孔线虫的寄主范围非常广泛，超过360多种。主要为害的农作物和经济作物包括香蕉(Musa spp. )、胡椒(Piper nigrum )、柑橘(Citru spp. )、柚子(Citrus maxima)、柠檬(Citrus limon)、菠萝(Ananas comosus)、甘蔗(Sacchanum officinanum)、荔枝(Litchi chinensis)、椰子树(Cocos nucifera)、槟榔树(Areca cathecu)、可可(Theobroma cacao)、咖啡(Coffea arabica)、茶树(Camellia sinensis)、生姜(Zingiber officinale)、花生(Arachis hypogaea)、番茄(Lycopersicon esculentum )、马铃薯(Solanum tuberosum )等数10种，此外还严重危害天南星科(Araceae)、竹芋科(Marantaceae )、棕榈科( Palmae )、芭蕉科(Musaceae)和凤梨科(Bromeliaceae)的观赏植物。
3 为害症状
不同的寄主植物被香蕉穿孔线虫危害后所表现的症状不完全相同。香蕉植株根部被侵染后，根表面产生红褐色略凹陷的斑痕，并出现边缘稍凸起的纵裂缝，将病根纵切开，可见皮层上有红褐色条斑，随着病害的发展，根组织变黑腐烂；香蕉植株地上部表现为生长缓慢，叶片小、枯黄，座果少，果实小，由于根系被破坏，固着能力弱，蕉株易摇摆、倒伏或翻蔸，故香蕉穿孔线虫病又称为“黑头倒伏病”(black head toping disease)。柑橘被侵染后，受害根部肿胀，侵染点产生黑色伤痕，根表皮容易脱落，根系萎缩；地上部叶片稀少，叶片小、僵硬和黄化，树枝末端叶落枯死，季节性新梢生长差，开花数不受影响，但座果少，并且果实小、很少成熟，病树呈衰退现象，在土壤缺水和干旱季节易迅速萎蔫。在发病柑橘园中，该病以每年约15m的速度扩散，故柑橘穿孔线虫病又称为柑橘扩散性衰退病（spreading decline）。胡椒被侵染后，细嫩的营养根表现出明显的橙色到紫色斑痕，老根上的斑痕呈棕色、不明显，根系大量腐烂，细嫩的营养根比主根腐烂快，随后较大的侧根大量坏死；地上部表现为叶片变黄、下垂，随后落叶、落花、生长停止，最后死亡。其它寄主植物被害，一般表现为根部出现大量空腔，韧皮部和形成层可完全毁坏，出现充满线虫的间隙，使中柱的其余部分与皮层分开，根部坏死斑呈橙色、紫色或褐色，根部坏死处外部形成裂缝，根腐烂；地上部一般表现为叶片缩小、变色、新枝生长弱等衰退症状或整株萎蔫。
4 传播途径
远距离传播靠带虫的种植材料以及所沾附的土壤，是新病区的主要初侵染源，也是病区再次蔓延的虫源。在田间，该线虫还可以通过植物根系伸长和相互绞织接触传染，水流、农事操作和线虫自身的活动也可以传播。
5 生物学特性
香蕉穿孔线虫是迁移型内寄生线虫，主要侵染为害植物的根和球茎等地下组织，雌虫和二龄及其以上幼虫均有侵染能力，在寄主植物内和土壤中都能完成生活史。香蕉小种在香蕉根部，在24℃～32℃时的生活史为20～25天；柑橘小种在柑橘根部，24℃～27℃时的生活史为10～20天。通常该线虫繁殖和侵染寄主的最适温度为24℃，最低温度为12℃，最高温度为29.5℃～32.5℃；在田间，该线虫在潮湿土壤(27℃～36℃)中可存活6个月，在干燥土壤(29℃～39℃)中能存活1个月；在温室中，该线虫在潮湿土壤(25.5℃～28.5℃)中可存活15个月，在干燥土壤(27℃～31℃)中能存活3个月；在被侵染的寄主根和其它地下组织内，该线虫可长期存活。
6 防控措施
（1）严格检疫：对来自疫区的植物种植材料进行严格细致的检查，或禁止疫区的寄主植物种植材料和土壤进入无病区。
（2）检疫处理：一旦发现这种线虫传入，要立即向政府和检疫部门报告，并及时采取封锁和铲除措施。对发生疫情的花场、苗圃、果园、田块，采取严格的控制措施全面销毁发病花场、苗圃、果园、田块中的染疫或可能染疫植物，禁止可能受污染的植物和土壤、工具外传，防止疫情扩散蔓延。清除土壤中植物的根茎残体并集中销毁，土壤用溴甲烷、必速灭或线克等熏蒸性杀线虫剂处理，并覆盖黑色薄膜，保持土壤无杂草等任何活的植物至少6个月，在侵染区和非侵染区之间建立宽5～18m的“隔离带”。
（3）疫区防治：主要防治措施包括农业防治、种苗处理和化学防治。农业防治主要是加强栽培管理，增施有机肥，对于观赏植物，要用经过有效消毒的介质，并将花盆上架；对大田作物，可通过培育浅根系植株减少线虫的侵染。种苗处理可以采用温水或杀线剂浸根及其它地下组织，如，香蕉的吸芽可以用53℃～55℃温水浸20min，也可以将吸芽或球茎在益舒宝60×10-5溶液中浸20min或在25×10-5苯线磷溶液中浸10min；柑橘苗根部可用55℃温水浸10min，然后转入冷水中处理10min；也可以用益舒宝10×10-5溶液浸30～60min。化学防治主要是用杀线虫剂如克线磷(nemacur)、益舒宝、万强、涕灭威等处理土壤。

附录2：
调查抽样方法
当田间或温室（大棚）内地栽的植物表现明显症状时，在发病点的病株根部，采集表现症状的根及其周围的土壤。对盆栽的观赏植物，当无明显症状表现时，随机抽取长势相对较弱的植株，采集其根和根际介质（或土壤），抽样率按植株数＞10000株（盆）抽3%～5%，植株数为100～10000株（盆）抽6%～10%，植株数＜100株（盆）抽样最低数不少于10株（盆）（植株数不足最低数的全部抽样），每株（盆）采集根5g～10g和根际介质（或土壤）50g～100g，每40～50株（盆）植物的根和根际介质（或土壤）分别混合成1个根样和1个土样。当抽样数少于100株（盆）时，至少组成2个混合样品。当盆栽的花卉表现明显症状时，可以采集整个病株的根系及其周围的介质（或土壤）做为1个独立的样品。采集的样品放在塑料袋中封好袋口，贴上标签，防止不同样品相混。
当田间或温室（大棚）内地栽的植物没有明显症状表现时，可采用对角线、棋盘式、平行跳跃式或拉链式随机取样方法，确定取样点，在1 hm2～2hm2的地块上至少取20～30个点，在取样点的植株根部，铲去表层土壤、杂草和其它杂物，取营养根10g~20g，根际土壤100~200g，将各点土壤混合均匀后，倒去部分土壤，保留1000g~2000g土壤作为一个土样，根放在一起作为1个根样。可根据植物根系的深浅，采集营养根或须根及其周围土壤。
附录3：
香蕉穿孔线虫分离方法
1 直接解剖法
将表现可疑症状的病根表面洗净，剪成1cm～2cm小段，放在装有适量清水的培养皿中，在解剖镜下用镊子和解剖针撕开组织，线虫就会从组织中游到水中，挑取若干条线虫置于凹玻片上，制成临时玻片供鉴定用。
2 浅盘贝曼漏斗法
在漏斗下面接一段乳胶管，乳胶管上装一个止水夹，或在乳胶管另一端套一个小试管，在漏斗中装清水至边沿1cm～2cm处，将漏斗置于架上，赶除乳胶管中的气泡；将面巾纸铺在浅筛盘上，然后将土壤、介质或剪成1cm长的根平铺在浅盘上；将装着样品的筛盘轻轻放在漏斗上,若漏斗中的水不能浸没样品，则沿漏斗壁轻轻注入清水，使漏斗中的水刚好浸没样品；根组织也可用小型搅拌机搅碎后再用浅盘漏斗法分离。线虫由于其趋水性、钻孔性和自身的重量下沉至漏斗下的乳胶管或小试管中，24h~48h后，用小培养皿接在乳胶管下，松开止水夹，收集线虫悬浮液，或直接把乳胶管下的小试管取下。
3 过筛——浅盘贝曼漏斗法
将土壤样品放入大小适当的容器内，加水充分淘洗，静置30s～1min后，将上面的悬浮液通过20目的筛子倒入第二个容器中，在第一个容器内加入适量清水重复上述步骤，并用水冲洗筛子，将滤渣里的线虫尽可能冲洗到第二个容器中，然后充分搅动第二个容器中的混合液使之悬浮，静置30s～1min后，将悬浮液过400目的筛子，再在第二个容器中加适量清水，重复此步骤，之后用水充分冲洗筛子上的滤渣去除土壤颗粒，再用浅盘贝曼漏斗法进一步分离400目筛上的滤渣。此法对粘性土壤中线虫的分离效果较好。
附录4：
植物线虫的分离与固定
1 线虫的杀死
将分离所得的线虫悬浮液放在试管中，把试管置于试管架上静止1h～2h，待线虫沉底后，用吸管小心地吸去上清液，试管底部保留约2cm高的悬浮液，然后将试管放入60℃～65℃的水浴箱中2min～3min杀死线虫。
杀死少量的线虫可将线虫放在凹玻片上的水滴中，手持凹玻片在洒精灯的火焰上来回5s～6s钟即可，加热过程中，要不断用手背接触玻片，感觉稍烫手即可。加热过度会破坏线虫形态结构，影响观察。
2 线虫的固定
已杀死的线虫必须及时用固定液固定，防止虫体腐烂，保持虫体的形态不变和内部器官的清晰。固定液种类较多，常用的有4%甲醛溶液（福尔马林:蒸馏水=1:9）、TAF（三羟基乙胺:福尔马林:蒸馏水=2:7:91）和FG（福尔马林:甘油:蒸馏水=10:1:89）。少量线虫被加热杀死后，可用挑针将线虫移到固定液中固定，大量的线虫被加热杀死后，在线虫悬浮液中加等量的浓度双倍的固定液（如8%的甲醛溶液）即可。
附录5：
线虫临时玻片标本的制作
临时玻片标本用于线虫的一般形态观察和鉴定，鉴定完后可回收到离心管中。临时玻片标本的制作方法比较简单，一般用固定线虫的固定液作为浮载剂，滴适量于载玻片上，在解剖镜下，用挑针将固定好的线虫数条（一般5～10条）挑到浮载剂中，并使其沉下，然后把与线虫虫体直径相近的3根3mm～5mm长的玻璃丝均匀置于浮载剂边缘，加盖玻片，用滤纸吸去溢出的浮载剂，即可在显微镜下观察鉴定，若不能及时鉴定,则需用指甲油封片,可保存几天至数周。也可用厚1.0mm～1.2mm的凹玻片,将线虫沉入凹玻片上的浮载剂底部后,无需加支撑物，直接加盖玻片,进行观察鉴定，这种方法制作的临时玻片，放在保湿皿中可保存数周，并且鉴定后，玻片上的线虫易于回收到离心管中长期保存。

附表1 ：
香蕉穿孔线虫疫情调查监测记录表
编号：
生产/ 经营者
（受检单位）

地址及邮编

联系/负责人

联系电话

调查日期

抽样地点

样品编号
植物名称（中文名和学名）
品种名称
植 物
生育期
调查株数或面积
植物来源

症状描述：

发病率及分布情况：

抽样方法、抽样比例和采集样品类型（例如根、球茎、土壤、介质等）：

备注：

抽样单位（盖章）：

填表人（签名）：

年 月 日

生产/经营者

现场负责人

年 月 日
注：此表将作为监测的原始记录，请妥善保管

附表2：
有害生物样本送检表
送样单位（盖章）

通讯地址

邮编

送样人

电话

传真

E-mail

标本编号

标本类型

样本数量

寄主植物

采集地点

采样人

采集场所

海拔高度

危害症状描述（或图片）