肝豆状核变性病基因突变分析.pdf

中山医科大学学报990 2 0 4中山医科大学学报 A CA D EM IC JO U RNA L O F SU N YA T-SEN U NI VERSIT Y O F M ED ICA L SCIENCES 1999年第2 0 卷第2 期Vol.20No.2 1999肝豆状核变性病基因突变分析徐评议梁秀龄马少春摘要：目的：寻找中国人肝豆状核变性病(W D)基因突变的形式及频率。方法：应用PCR-SSCP法对45名W D 患者进行基因e x o n 5、8、14、18 筛选，对确定异常者进行D NA序列分析。结果：在45名患者D NA 样本的PCR扩增产物中未发现e x o n 18 泳动异常，而3名患者显示e x o n 14多态性泳动异常，但这种泳动也可见于正常标本中。4例患者显示e x o n 5单链构象多态性，序列分析表明为T 插入突变，其突变频率为8.8 9%；2 例存在e x o n 8 泳动异常，序列分析表明该外显子同时存在7 7 0 c o d o n C2 2 50G 同义突变和G2 2 7 3T A r g 7 7 8 Le u 错义突变，其突变频率为4.44%。结论：不同功能区域的e x o n 5及e x o n 8 外显子突变可能是中国人W D 发病的原因。主题词：肝豆状核变性/遗传学；D NA 突变分析 中图号：R 7 42.4Analysis of Gene Mutation of Wilson DiseaseXu Pi n g y i Li a n g Xi u l i n g M a Sh a o c h u n (D e p a r t m e n t o f Ne u r o l o g y,Fi r s t A f f i l i a t e d H o s p i t a l,Su n Ya t-s e n U n i v e r s i t y o f M e d i c a l Sc i e n c e s,G u a n g z h o u,510 0 8 0)A b s t r a c t O b j e c t i v e:T o i n v e s t i g a t e t h e s t y l e a n d f r e q u e n c y o f g e n e m u t a t i o n i n Ch i n e s e p a t i e n t s s u f f e r i n g f r o m W i l s o n d i s e a s e(W D).M e t h o d:PCR-SSCP w a s u s e d t o s c r e e n i n e x o n 5,8,14,18 o f W D g e n e f o r 45 W i l s o n d i s e a s e p a t i e n t s a n d D NA s e q u e n c e w a s a n a l y z e d t o a b n o r m a l g e n e b a n d s i d e n t i f i e d b y p o l y a c r y l a m i d g e l e l e c t r o p h o r e s i s.Re s u l t s:I n 45 PCR p r o d u c t s o f W D D NA s a m p l e s,n o m o b i l i t y c h a n g e w i t h e x o n 18 w a s f o u n d i n s i n g l e s t r a n d c o n f o r m a t i o n p o l y m o r p h i s m a n a l y s i s,b u t 3 m o b i l i t y c h a n g e w i t h e x o n 14 w a s d e t e c t e d,b u t t h i s m o b i l i t y c h a n g e w a s a l s o d e t e c t e d i n PCR-SSCP a n a l y s i s o f n o r m a l D NA s a m p l e s a n d a l s o 4 m o b i l i t y s h i f t w a s d e t e c t e d i n e x o n 5.T h e r e i s a n e w T i n s e r t i o n i n e x o n 5 b y D NA s e q u e n c e a n a l y s i s.T h e m u t a t i o n f r e q u e n c y i s 8.8 9%,a n d w e a l s o d e t e c t e d 2 m o b i l i t y s h i f t i n e x o n 8,a n d a f f i r m e d t h a t t h e r e i s a s a m e s e n s e m u t a t i o n C2 2 50G o n 7 7 0 c o d o n w i t h a m i s s e n s e m u t a t i o n G2 2 7 3T o n A r g7 7 8Le u t o g e t h e r i n t h e e x o n,t h e m u t a t i o n f r e q u e n c y i s 4.44%.Co n c l u s i o n:T h e s e f i n d i n g s i n d i c a t e d t h a t t h e m u t a t i o n o f e x o n 5 a n d e x o n 8 i n d i f f e r e n t f u n c t i o n a l a r e a s o f W i l s o n d i s e a s e g e n e m a y b e t h e c a u s e o f t h e d i s e a s e i n Ch i n e s e p e o p l e.Su b j e c t h e a d i n g s h e p a t o l e n t i c u l a r d e g e n e r a t i o n/g e n e t i c s;D NA m u t a t i o n a l a n a l y s i sf i l e:/E|/q k/z s y k d x x b/z s y k 99/z s y k 990 2/990 2 0 4.h t m（第 15 页）2 0 10-3-2 3 2 2:15:47万方数据中山医科大学学报990 2 0 4近年来国内外学者相继开展肝豆状核变性病(W i l s o n d i s e a s e,W D)的分子生物学研究。W D 基因已定位和克隆15，其基因表达产物为一种与铜离子转运有关的A T P酶(A T P7 B)。迄今为止，国外学者已报道W D 基因至少存在95种突变6，形式多为单碱基置换、插入或几个碱基丢失，其中欧洲人基因突变的特点为e x o n 14和e x o n 18，发生错义突变的频率分别高达2 8%和10%，而国内关于中国人W D 基因突变的正式文献尚未见报道。本文报告采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)、聚合酶链反应-D NA(PCR-D NA)直接测序法对45个W D 患者基因进行e x o n 5、8、14、18 突变分析的结果。1材料与方法 1.1D NA 标本收集 收集15例无亲缘关系正常个体和45例来自全国各地已确诊的W D 患者外周抗凝全血5 m L，经酚氯仿抽提法提取白细胞D NA。正常个体标本由中山医科大学附属第一医院血库提供。W D 患者经本科确诊，具有典型锥体外系症状和体征，角膜K-F环阳性以及血清铜蓝蛋白水平低下，2 4 h 尿铜含量升高等生化特征。1.2 基因突变筛查的PCR-SSCP法 W D 基因e x o n 5、8、14、18 扩增产物及条件如表1。2 5 L PCR反应体系中，含1 L D NA 样品，2 0 p m o l 引物，1PCR缓冲液，0.2 m m o l d NT P，1U T a q 酶(PE公司)；97 变性10 m i n；94 30 s，退火50 s，7 2 6 0 s，循环35次，最后7 2 延伸10 m i n：扩增产物经10 g/L普通琼脂糖电泳鉴定后，按文献7 方法稍作改良进行SSCP分析。PCR产物8 L 加8 L甲酰胺变性剂(950 g/L去离子甲酰胺，3 g/L溴酚蓝，3 g/L二甲氰醇)，97 变性5 m i n，-2 0 立即冷却，上样6 0 g/L或8 0 g/L的聚丙烯酰胺凝胶中，以0.5T BE(T r i s-硼酸)为电泳缓冲液，4，2 0 0 V电泳45 h，取胶后用银染法8 观察结果。表1W D 基因e x o n 5、8、14、18 扩增产物及条件 T a b l e 1Pr i m e r s a n d c o n d i t i o n s f o r PCR-SSCP a n a l y s i s i n e x o n 5,8,14,18 o f W D g e n eEx o nNo.p r i m e rPr i m e r s e q u e n c e(5-3)Si z e o f p r o-d u c t(n /b p)A n n e a l d e g-r e e(t /)E55Ac c t g g g c t g t g g g a t t c t2 336 0E85Ba a a g g t g a c t a c a a t t t t t a a t g a2 96588 Ba g g c a g c t c t t t t c t g a a cE1414At c a t c t g t a t t g t g g t c a g30 15814Bc a g c t a g g a g a g a a g g a c a tE1818 Aa c c t t t t g c c a a c a c t a g c a t2 7 55918 Bt c c c a g c a c c c a c a g c cf i l e:/E|/q k/z s y k d x x b/z s y k 99/z s y k 990 2/990 2 0 4.h t m（第 2 5 页）2 0 10-3-2 3 2 2:15:47万方数据中山医科大学学报990 2 0 41.3PCR双链模板的直接测序 按参考文献9进行，2 550 L PCR产物经透析袋法纯化后，用超纯水溶解后测浓度。将此双链模板与测序引物以12 0 混合，按美国U SB公司的Se q u e n a s e Ve r.2 测序盒说明和北京亚辉生物医学工程公司的-32P d A T P(37 0 G Bq/L)进行标记和延伸反应。以每孔3.5 L上样于7 m o l/L尿素的6 0 g/L聚丙烯酰胺变性凝胶中1 2 0 0 V电泳4 h，放射性自显影12 2 4 h。为了清楚显示D NA 片段的每一个碱基，序列分析有时重复从两个方向独立进行。所测序列与G ENEBA NK 中的A T P7 B基因序列进行对照分析。2 结果 2.1W D 基因突变的PCR-SSCP分析 应用PCR-SSCP法分别对各标本的W D 基因的e x o n 5、8、14、18 进行突变筛选，结果发现e x o n 18 出现正常标本的3条带，未显示单链构象多态性，而e x o n 14在3个标本中显示泳动异常，但也可见于正常对照中，故考虑为多态性。e x o n 5在4个标本中出现明显的单链构象多态性，e x o n 8 则有2 例出现泳动异常，这种异常未见于正常对照标本中。2.2 W D 基因突变的直接测序结果 进一步对筛查出的SSCP异常样本(e x o n 5和e x o n 8)进行测序鉴定。2 次独立进行的实验证实e x o n 5泳动异常样本出现W D 基因突变为c ND A 第1 17 6 位T 插入，导致密码子顺序发生变化，突变频率为8.8 9%，为一种新的突变(图1)。而e x o n 8 泳动异常样本则出现7 7 0 c o d o n C2 2 50G 同义突变及G2 2 7 3T 即A r g7 7 8Le u 错义突变，上述两个突变同时存在，且突变频率为4.44%，其突变形式与台湾学者10 及国内学者报道的两种形式相同，但两种突变在同一标本中同时存在，且频率较低。图1Ex o n 5 SSCP阳性标本D NA 测序 Fi g.1Se q u e n c e a n a l y s i s o f a b n o r m a l b a n d o f m i g r a t i o n b y SSCP i n e x o n 5 A:n o r m a l p r o s t a t e B:a b n o r m a l b a n d b y SSCP;A r r o w:T i n s e r t i o n3讨论 迄今为止，国外学者已报道W D 基因在白种人的突变的热点为e x o n 14(2 8%)和e x o n 18(10%)，其它外显子突变频率低，其中e x o n 5和e x o n 8 突变频率小于2%6。台湾学者(1996 年)报道台湾地区W D 患者e x o n 8 存在G2 2 7 3T 即A r g7 7 8Le u 突变，频率为2 7%。f i l e:/E|/q k/z s y k d x x b/z s y k 99/z s y k 990 2/990 2 0 4.h t m（第 35 页）2 0 10-3-2 3 2 2:15:47万方数据中山医科大学学报990 2 0 4近来国内学者的会议资料也有e x o n 8 突变报道，且频率高达37%(华东6 省第10 届神经病学会议资料)，其突变形式与国外报道相同。据报道，e x o n 8 编码A T P7 B的跨膜功能区，该位点如发生突变，则使细胞膜铜离子转运异常，对W D 发病具有重要意义。我们的结果显示，e x o n 14、18 未见明显单链构象多态性，基因突变率小，不是中国人W D 基因突变热点，而e x o n 8 在研究中仅2 例SSCP泳动异常，虽然基因突变形式与国内外报道一致，但值得注意的是，2 例W D 患者e x o n 8 同时出现C2 2 50G 同义突变和G2 2 7 3T 错义突变，是其新的特点，需进一步对更多的病例进行筛查并探讨这种突变发生的机制。我们的结果显示e x o n 8 突变频率低，仅4.44%，与国外报道相接近，而与国内及台湾学者结果有较大差异，需要进一步筛查。本研究中，我们在45个W D 患者中，发现4例标本存在e x o n 5 SSCP泳动异常，序列分析显示为117 6 位T 插入引起移码突变，频率为8.8 9%，与国外报道的e x o n 5仅2 例发生17 11-1 G C置换突变形式明显不同6，是一种新的突变形式，提示中国人W D 基因的突变形式及热点可能与白种人存在差异。e x o n 5主要编码W D 基因第6 铜离子(Cu 6)结合区氨基酸序列，而Cu 6 对铜离子结合起重要作用，故e x o n 5突变影响Cu 6 功能，可能是W D 发病的一种原因。总之，结合国内外和本研究关于中国人W D 基因突变研究热点的结果，仍不能完全解释中国人W D 的分子发病机制，有关中国人W D 基因热区的筛选工作，仍需作进一步研究。国家自然科学基金(396 7 0 2 7 0)和广东省自然科学基金(954334)资助课题作者单位：徐评议梁秀龄马少春中山医科大学附属第一医院神经内科；广州，510 0 8 0参考文献1Fr y d m a n F,Bo n n e-Fa m i r B,Fa r r e r L A.A s s i g n m e n t o f t h e g e n e f o r W i l s o n d i s e a s e t o c h r o m o s o m e 13:l i n k a g e t o e s t e r a s e D l o c u s.Pr o c Na t l Sc i U SA,198 5,8 2(2):18 1 2 Bo w c o o k A M,Fa r r e r L A,H e b e r t J M.Ei g h t c l o s e l y l i n k e d l o c i p l a c e t h e W i l s o n s d i e a s e s l o c u s w i t h 13q 14.2 1.A m J H u m G e n e t,198 8,43(2):6 4 3Bu l l P C,G o r d o n R,Co x D W.T h e W i l s o n d i s e a s e g e n e i s a p u t a t i v e c o p p e r t r a n s p o r t i n g P t y p e A T Pa s e s i m i l a r t o t h e M e n k e s g e n e.Na t u r e G e n e t,1993,6 4(3):13 4St e w a r t E A,W h i t e A,Bo w c o c k A M，e t a l.Po l y m o r p h i c m i c r o s a t e l i t e s a n d W i l s o n d i s e a s e(W D).A m J H u m G e n e t,1993,53(1):8 6 4 5T a n z i R E,Pe r t u k h i n K,Ch e m o v L,e t a l.T h e W i l s o n d i s e a s e g e n e i s a c o p p e r t r a n s p o r t i n g A T Pa s e w i t h h o m o l o g y t o t h e M e n k e s d i s e a s e g e n e.Na t u r e G e n e t,1993,5(4):344 6 G o r d o n R T,Jo h n R F,Co x D W，e t a l.T h e W i l s o n d i s e a s e g e n e:Sp e c t r u m o f m u t a t i o n s a n d t h e i r c o n s e q u e n c e s.Na t u r e G e n e t,1995,9(2):2 10 7 K e n s h i H,Sa i k i R,G e l f a n d D H.PCR-SSCP:A m e t h o d f o r d e t e c t i o n o f m u t a t i o n s.G A T A,1992,9(3):7 3 8 Sh i r e l e y E P,M i c h a e l D,U l r i c k e K，e t a l.D e t e c t i n g h i g h-r e s o l u t i o n p o l y m o r p h i s m i n h u m a n c o d i n g l o c i b y c o m b i n i n g PCR a n d s i n g l e-s t r a n d c o n f o r m a t i o n p o l y m o r p h i s m (SSCP)a n a l y s i s.A m J H u m G e n e t,1991,48(1)：10 6 9Re i s h e U.A r a p i d p r o t o c o l f o r D NA e x t r a c t i o n a n d p r i m e r a n n n e l i n g f o r PCR s e q u e n c i n g,f i l e:/E|/q k/z s y k d x x b/z s y k 99/z s y k 990 2/990 2 0 4.h t m（第 45 页）2 0 10-3-2 3 2 2:15:47万方数据中山医科大学学报990 2 0 4Bi o t e c h,1994,17(5):8 42 10 Ch u a n g L M,W u H P,Ja n g M H.H i g h f r e q u e n c y o f t w o m u t a t i o n i n c o d o n 7 7 8 i n e x o n 8 o f t h e A T P7 B g e n e i n T a i w a n e s e f a m i l i e s w i t h W i l s o n d i s e a s e.J M e d G e n e t,1996,33(4):52 1收稿1998 -0 4-15 修回1998 -12 -2 3f i l e:/E|/q k/z s y k d x x b/z s y k 99/z s y k 990 2/990 2 0 4.h t m（第 55 页）2 0 10-3-2 3 2 2:15:47万方数据肝豆状核变性病基因突变分析肝豆状核变性病基因突变分析作者：徐评议，梁秀龄，马少春作者单位：刊名：中山医科大学学报英文刊名：ACADEMIC JOURNAL OF SUN YAT-SEN UNIVERSITY OF MEDICAL SCIENCES年，卷(期)：1999,20(2)被引用次数：9次 引证文献(9条)引证文献(9条)1.洪桢.陈生弟 从文献分析看我国帕金森病及运动障碍性疾病研究进程期刊论文-中国现代神经疾病杂志 2009(3)2.鲍远程.吴鹏.余元勋.蒋怀周.汪鸿浩 肝豆状核变性患者ATP7B基因8、12号外显子突变的DNA分析期刊论文-中风与神经疾病杂志2008(3)3.余元勋.朱霖.鲍远程.吴鹏.蒋怀周.汪鸿浩 WD患者ATP7B基因exon8 DNA突变检测方法的研究期刊论文-中国优生与遗传杂志 2007(12)4.鲍远程.余元勋.吴鹏.蒋怀周.汪鸿浩 HLD ATP 7B基因8、12、14、16、18号外显子突变的DNA分析()期刊论文-中国优生优育 2007(3)5.陈源.耿江辉.张会丰 肝豆状核变性分子生物学研究进展期刊论文-临床荟萃 2006(2)6.丰岩清.李洵桦.国宁.梁秀龄.黄帆.王莹.陈曦 CCC2基因缺陷型酵母对中国人Wilson病突变热点致病性的研究期刊论文-中山大学学报（医学科学版）2005(5)7.丰岩清.国宁.王莹.黄帆.徐琳.陈曦.梁秀龄 应用USE定点诱变技术制备Wilson病突变体期刊论文-中山大学学报(医学科学版)2003(6)8.王莹.丰岩清.国宁.黄帆.徐琳.陈曦.梁秀龄 Wilson蛋白N端多克隆抗体的制备和纯化期刊论文-中山大学学报(医学科学版)2003(6)9.黄帆.朱燕珍.丰岩清.国宁.王莹.徐琳.梁秀龄 Wilson病基因突变酵母分析系统的建立期刊论文-中山大学学报(医学科学版)2003(5)本文链接：http:/