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基于碳纳米管的安培型H2O2生物传感器的研究
麦智彬 邹小勇*
(中山大学化学与化学工程学院，广州：510275)
摘要 利用阳离子染料硫堇（Thionine, Thi）作为介体同时结合多壁碳纳米管（MWNTs）、壳聚糖（Chitosan, CHIT），辣根过氧化酶（Horseradish peroxidase, HRP）的混合包埋物制作H2O2生物传感器。通过循环伏安法、计时电流法对传感器的性能进行研究。结果表明所得传感器具有明显的增敏效应，线性范围为30μmol/L~5.5mmol/L，相关系数为0.9995。在S/N=3的情况下，检出限为19μmol/L。所得的传感器具有良好的稳定性及工作寿命。
关键词 碳纳米管 硫堇 壳聚糖 辣根过氧化酶 过氧化氢
1 引言
H2O2是过氧化酶参与的酶促反应产物，它的测定对于食品、药物和环境分析等具有重要意义。迄今为止，H2O2的测定方法包括光谱法[1]，化学荧光分析法[2]，滴定分析法[3]以及电化学分析法[4]。其中电化学分析法由于具有较高的灵敏度，良好的线性范围，快速而稳定的响应信号而被广泛研究。
碳纳米管（CNTs）发现于1991年[5]，其独特的理化性质使之广泛地应用在生物传感器的研究之中。目前国内外已有多篇有关CNTs生物传感器的综述[6-7]。本文首次利用Thi作为介体结合CHIT、MWNTs和HRP的混合包埋物制作H2O2传感器，利用循环伏安法（CV），计时电流法（I-t）对传感器的工作机理、性能及寿命进行了研究。
2 实验部分
2.1 试剂
HRP购自国药集团化学试剂有限公司(RZ>250 units/mg)。CHIT购自上海伯奥生物科技有限公司，脱乙酰度为99%。H2O2（30% w/v溶液）购自广州化学试剂厂。羧基化的MWNTs购自深圳纳米港公司，纯度大于90％，直接使用。其它试剂均为分析纯。0.1mmol/L的Thi溶液用0.05mol/L pH＝6.5的PBS溶液配制。1%的CHIT溶液用醋酸溶液配制。其余溶液用超纯水配制。

2.2 仪器
CHI660A型电化学工作站（上海辰华仪器公司）以及三电极系统：H2O2传感器为工作电极，铂丝为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极。
扫描电镜（SEM）照片采自日本电子株式会社场发射扫描电子显微镜（型号：JSM-6330F），透射电镜（TEM）照片采自日本电子株式会社透射电子显微镜（型号：JEM-2010HR）。红外光谱采用德国Bruker公司傅里叶变换红外光谱-红外显微镜联用仪（型号：EQUINOX 55）制作。

2.3 传感器的制作
玻碳电极（GC, Φ=4mm）分别在载有1.0、0.3、0.05μm的Al2O3颗粒的绒毛垫上抛光处理后，用超纯水冲洗干净，依次在1:1 HNO3、无水乙醇及超纯水中超声处理各两分钟，自然晾干后备用。
5%的Nafion用无水乙醇稀释至0.5%。5μL 0.5%的Nafion滴加在电极表面，自然晾干，得Nafion修饰电极（GC/Naf）。GC/Naf在0.1mmol/L的Thi水溶液中浸泡10min，在此过程中，Nafion和Thi通过静电作用充分结合。静电吸附Thi后的电极用二次水彻底洗去弱吸附的Thi分子，晾干后得传感器底层（GC/Naf/Thi）。
1mg MWNTs在1%的CHIT中超声处理15min后得到1mg/mL的MWNTs-CHIT。10μL MWNTs-CHIT与5μL10mg/mLHRP均匀混合后，取其中8μL覆盖在传感器底层上， 4℃下干燥24h，得H2O2传感器（GC/Naf/Thi/MWNTs-HRP-CHIT），整个传感器的制作过程如图1所示。

图1 H2O2传感器制作流程图

2.4 实验方法
所有实验在0.05 mol/L pH6.5 PBS中进行。电解池中加入0.6mL底液，然后加入不同体积H2O2储备液进行电化学测定。循环伏安曲线在溶液静止状态下测定，计时电流法实验在搅拌状态下进行。
3 结果与讨论
3.1 MWNTs的物理表征
MWNTs在1% CHIT中的分散状况如图2C所示。分别考察MWNTs在水及1% CHIT中分散30天后的状况，研究发现MWNTs在水中已出现明显的聚沉现象，而在1% CHIT中仍分散良好。因此与水相比，1% CHIT对MWNTs具有更稳定的分散能力。
从MWNTs的SEM（图2A）可以很好地观察到MWNTs的管状结构。而由TEM（图2B）可判断出MWNTs的直径范围为8~20nm。
同时利用FT-IR表征了MWNTs功能化前后表面官能团（图2D）的状况。结果表明功能化后的MWNTs在1710和1568cm-1有明显的吸收峰。另外3440cm-1和1185cm-1的吸收峰分别归属于-OH和C-OH的弯曲吸收振动。由这些吸收峰可以推知，MWNTs的表面被部分氧化为羧基和羟基。
(A) (B) (C) (D)
图2 MWNTs的物理表征
（A为MWNTs的SEM图、B为MWNTs的TEM图、C为MWNTs分别在水和1%CHIT中分散30天后分散效果对比、D为羧基化前后MWNTs的IR图）

3.2 传感器的电化学性质
利用循环伏安法研究了传感器的电化学性质如图3所示。传感器在底液里（图3c）有一对准可逆峰（Ea=-0.137V, Ipa＝-1.668μA; Ec＝-0.212V, , Ipc＝1.668μA; ΔE=75mV），该峰归属于Thi在电极表面的氧化还原。与GC/Naf/Thi（图3a）相比（Ea=-0.146V, Ipa＝-8.672μA; Ec＝-0.231V, , Ipc＝6.203μA; ΔE=85mV），传感器的氧化及还原峰电流均有所下降，而可逆性增加。这是由于包埋MWNTs-CHIT-HRP后导致传感器的阻抗增大，但MWNTs特殊的空间效应和催化能力又促进了传感器内部介体的电子传递，使Thi的氧化还原电对的可逆性增加。在21mmol/LH2O2的存在下（图3b），Thi的还原峰电流明显地增加。H2O2与生物传感器的反应机理如下所示：
H2O2+HRP→H2O+HRP-I (1)
HRP-I+LTH→HRP-II+TH· (2)
HRP-II + TH·→HRP + TH+ (3)
TH++H++2e→LTH2 (4)
HRP首先将H2O2还原为H2O，自身氧化为HRP-I（1）。HRP-I被白硫堇（LTH）进一步氧化成HRP-II（2），之后在硫堇自由基（TH·）的存在下HRP-II被还原为HRP，失去电子后的TH·转变成TH+，在酸性条件下得到电子重新还原LTH2，所以传感器在H2O2的存在下还原峰电流增加。

图3 生物传感器对21mmol/L H2O2响应的循环伏安图

3.3 实验条件的优化
通过一系列实验对传感器的实验条件进行了优化，结果如表1所示。在以后的定量分析中，均采用表1的选择值作为实验条件。
表1 实验条件参数优化表
参数
测量范围
选择值
静电吸附时间/min
5~15
10
扫描速率/(mV/s)
20~100
50
工作电位/V
0~-0.40
-0.22
pH
5.9~8.0
6.5
HRP用量/units
1~9
6

3.4 传感器工作机理探讨及在定量分析中的应用

3.4.1 传感器工作机理探讨
为了探讨MWNTs、HRP对传感器响应信号的贡献，利用计时电流法分别考察了(A)GC/Naf/Thi/MWNTs-HRP-CHIT；(B)GC/Naf/Thi/HRP-CHIT；(C)GC/MWNTs-CHIT对0.5mmol/L H2O2的响应情况，结果如图4所示。由图可知，IA>>IB+IC，传感器具有明显的增敏效应。增敏现象可以从几方面来考虑：一方面HRP可以有效地吸附在MWNTs管壁上[8]，由于MWNTs具有较大的比表面积，电极表面的活性位点增多；另一方面MWNTs也可以利用其独特的三维网络结构深入HRP的活性中心[9]，促进酶与电极的电子传递，减少HRP外层多肽的阻抗；另外，MWNTs较大的比表面积也可以对H2O2起到富集作用；同时，注意到GC/Naf/Thi/MWNTs-CHIT对H2O2仍有部分响应（图5），MWNTs 对H2O2具有催化作用，促使H2O2还原的过电位下降。总的来说，传感器的增敏作用受到以上几个因素的协同效应的影响，涉及到MWNTs在传感器中的空间效应及电子效应。

图4 传感器不同组分对0.5mmol/L H2O2 图5 GC/Naf/Thi/MWNTs-CHIT对
响应信号的贡献 0.5mmol/L H2O2的响应

3.4.2 传感器的工作曲线及米氏常数
利用计时电流法考察了传感器对H2O2的响应情况（图6）。结果表明，传感器的对H2O2具有快速的响应，信号达到95%所需的时间小于6s，且在H2O2浓度为30μmol/L~5.5mmol/L的范围内呈线性响应，方程为Current/A= 4.272×10-8+ 7.040×10-4C/(mol/L)，相关系数为0.9995。同时，根据Lineweaver-Burk方程[10]：
1/Iss＝1/Imax+KMapp/ImaxC
（式中Iss为加入底物后的电流强度，C为底物浓度，Imax为固定底物浓度后的最大电流，KMapp为米氏常数。）用双倒数法求得米氏常数为1.93mmol/L（图7）。从图形意义上来说，米氏常数为检测上限和检测下限的中点位置，而本文所求得的米氏常数与该理论非常吻合，说明在该浓度范围内，传感器的反应属于一级反应动力学过程。
传感器对0.1mmol/L的H2O2分别进行了8次测量，求得R.S.D=5.8%，D.L. = 19μmol/L。

图6 传感器对H2O2的标准曲线 图7 传感器的米氏常数曲线
（I-t曲线由连续加入浓度为0.1mmol/LH2O2制作）

3.4.3 传感器的稳定性和寿命
传感器连续考察了7天，每天用0.1mmol/L H2O2分别测量6次，结果表明当传感器进入第四天后，电流下降了6.3%，但此后电流基本上稳定在75nA左右。说明传感器具有良好的稳定性和较长的寿命。

4 结论
利用MWNTs-CHIT包埋HRP制作了以Thi为介体的H2O2的生物传感器。实验结果表明，MWNTs由于其特殊的空间结构，电子性质，使其在传感器中起到三维网络导电骨架的作用，与一般的CHIT包埋HRP传感器相比具有明显的增敏效应。用这种方法制作的传感器具有良好的生物活性、稳定性及重现性。在这个结果之上有望开发基于氧化酶-HRP双酶体系的生物传感器。
参 考 文 献
1. Higashi N., Yokota H., Hiraki S., et al. Direct Determination of Peracetic Acid, Hydrogen Peroxide, and Acetic Acid in Disinfectant Solutions by Far-Ultraviolet Absorption Spectroscopy. Anal. Chem., 2005, 77(7): 2272-2277.
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3. Hurdis E. C., Romeyn Jr. H.. Accuracy of Determination of Hydrogen Peroxide by Cerate Oxidimetry. Anal. Chem., 1954, 26(2): 320-325.
4. Elzanowska H., Abu-Irhayem E., Skrzynecka B., et al. Hydrogen Peroxide Detection at Electrochemically and Sol-Gel Derived Ir Oxide Films. Electroanalysis, 2004, 16(6): 478-490.
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致 谢
感谢中山大学化学与化学工程学院创新实验与研究基金（No. 24）对本项目的资助。