基于碳纳米管的安培型H2O2生物传感器的研究.docx

基于碳纳米管的安培型H2O2生物传感器的研究麦智彬 邹小勇*(中山大学化学与化学工程学院，广州：510275)摘要 利用阳离子染料硫堇（Thionine, Thi）作为介体同时结合多壁碳纳米管（MWNTs）、壳聚糖（Chitosan, CHIT），辣根过氧化酶（Horseradish peroxidase, HRP）的混合包埋物制作H2O2生物传感器。通过循环伏安法、计时电流法对传感器的性能进行研究。结果表明所得传感器具有明显的增敏效应，线性范围为30mol/L5.5mmol/L，相关系数为0.9995。在S/N=3的情况下，检出限为19mol/L。所得的传感器具有良好的稳定性及工作寿命。关键词 碳纳米管 硫堇 壳聚糖 辣根过氧化酶 过氧化氢 1 引言H2O2是过氧化酶参与的酶促反应产物，它的测定对于食品、药物和环境分析等具有重要意义。迄今为止，H2O2的测定方法包括光谱法1，化学荧光分析法2，滴定分析法3以及电化学分析法4。其中电化学分析法由于具有较高的灵敏度，良好的线性范围，快速而稳定的响应信号而被广泛研究。碳纳米管（CNTs）发现于1991年5，其独特的理化性质使之广泛地应用在生物传感器的研究之中。目前国内外已有多篇有关CNTs生物传感器的综述6-7。本文首次利用Thi作为介体结合CHIT、MWNTs和HRP的混合包埋物制作H2O2传感器，利用循环伏安法（CV），计时电流法（I-t）对传感器的工作机理、性能及寿命进行了研究。2 实验部分2.1 试剂HRP购自国药集团化学试剂有限公司(RZ250 units/mg)。CHIT购自上海伯奥生物科技有限公司，脱乙酰度为99%。H2O2（30% w/v溶液）购自广州化学试剂厂。羧基化的MWNTs购自深圳纳米港公司，纯度大于90，直接使用。其它试剂均为分析纯。0.1mmol/L的Thi溶液用0.05mol/L pH6.5的PBS溶液配制。1%的CHIT溶液用醋酸溶液配制。其余溶液用超纯水配制。2.2 仪器CHI660A型电化学工作站（上海辰华仪器公司）以及三电极系统：H2O2传感器为工作电极，铂丝为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极。扫描电镜（SEM）照片采自日本电子株式会社场发射扫描电子显微镜（型号：JSM-6330F），透射电镜（TEM）照片采自日本电子株式会社透射电子显微镜（型号：JEM-2010HR）。红外光谱采用德国Bruker公司傅里叶变换红外光谱-红外显微镜联用仪（型号：EQUINOX 55）制作。2.3 传感器的制作玻碳电极（GC, =4mm）分别在载有1.0、0.3、0.05m的Al2O3颗粒的绒毛垫上抛光处理后，用超纯水冲洗干净，依次在1:1 HNO3、无水乙醇及超纯水中超声处理各两分钟，自然晾干后备用。5%的Nafion用无水乙醇稀释至0.5%。5L 0.5%的Nafion滴加在电极表面，自然晾干，得Nafion修饰电极（GC/Naf）。GC/Naf在0.1mmol/L的Thi水溶液中浸泡10min，在此过程中，Nafion和Thi通过静电作用充分结合。静电吸附Thi后的电极用二次水彻底洗去弱吸附的Thi分子，晾干后得传感器底层（GC/Naf/Thi）。1mg MWNTs在1%的CHIT中超声处理15min后得到1mg/mL的MWNTs-CHIT。10L MWNTs-CHIT与5L10mg/mLHRP均匀混合后，取其中8L覆盖在传感器底层上， 4下干燥24h，得H2O2传感器（GC/Naf/Thi/MWNTs-HRP-CHIT），整个传感器的制作过程如图1所示。图1 H2O2传感器制作流程图2.4 实验方法所有实验在0.05 mol/L pH6.5 PBS中进行。电解池中加入0.6mL底液，然后加入不同体积H2O2储备液进行电化学测定。循环伏安曲线在溶液静止状态下测定，计时电流法实验在搅拌状态下进行。3 结果与讨论3.1 MWNTs的物理表征MWNTs在1% CHIT中的分散状况如图2C所示。分别考察MWNTs在水及1% CHIT中分散30天后的状况，研究发现MWNTs在水中已出现明显的聚沉现象，而在1% CHIT中仍分散良好。因此与水相比，1% CHIT对MWNTs具有更稳定的分散能力。从MWNTs的SEM（图2A）可以很好地观察到MWNTs的管状结构。而由TEM（图2B）可判断出MWNTs的直径范围为820nm。同时利用FT-IR表征了MWNTs功能化前后表面官能团（图2D）的状况。结果表明功能化后的MWNTs在1710和1568cm-1有明显的吸收峰。另外3440cm-1和1185cm-1的吸收峰分别归属于-OH和C-OH的弯曲吸收振动。由这些吸收峰可以推知，MWNTs的表面被部分氧化为羧基和羟基。(A) (B) (C) (D) 图2 MWNTs的物理表征（A为MWNTs的SEM图、B为MWNTs的TEM图、C为MWNTs分别在水和1%CHIT中分散30天后分散效果对比、D为羧基化前后MWNTs的IR图）3.2 传感器的电化学性质利用循环伏安法研究了传感器的电化学性质如图3所示。传感器在底液里（图3c）有一对准可逆峰（Ea=-0.137V, Ipa-1.668A; Ec-0.212V, , Ipc1.668A; E=75mV），该峰归属于Thi在电极表面的氧化还原。与GC/Naf/Thi（图3a）相比（Ea=-0.146V, Ipa-8.672A; Ec-0.231V, , Ipc6.203A; E=85mV），传感器的氧化及还原峰电流均有所下降，而可逆性增加。这是由于包埋MWNTs-CHIT-HRP后导致传感器的阻抗增大，但MWNTs特殊的空间效应和催化能力又促进了传感器内部介体的电子传递，使Thi的氧化还原电对的可逆性增加。在21mmol/LH2O2的存在下（图3b），Thi的还原峰电流明显地增加。H2O2与生物传感器的反应机理如下所示：H2O2+HRPH2O+HRP-I (1)HRP-I+LTHHRP-II+TH(2)HRP-II + THHRP + TH+(3)TH+H+2eLTH2(4)HRP首先将H2O2还原为H2O，自身氧化为HRP-I（1）。HRP-I被白硫堇（LTH）进一步氧化成HRP-II（2），之后在硫堇自由基（TH）的存在下HRP-II被还原为HRP，失去电子后的TH转变成TH+，在酸性条件下得到电子重新还原LTH2，所以传感器在H2O2的存在下还原峰电流增加。图3 生物传感器对21mmol/L H2O2响应的循环伏安图3.3 实验条件的优化通过一系列实验对传感器的实验条件进行了优化，结果如表1所示。在以后的定量分析中，均采用表1的选择值作为实验条件。表1 实验条件参数优化表参数测量范围选择值静电吸附时间/min51510扫描速率/(mV/s)2010050工作电位/V0-0.40-0.22pH5.98.06.5HRP用量/units1963.4 传感器工作机理探讨及在定量分析中的应用3.4.1 传感器工作机理探讨为了探讨MWNTs、HRP对传感器响应信号的贡献，利用计时电流法分别考察了(A)GC/Naf/Thi/MWNTs-HRP-CHIT；(B)GC/Naf/Thi/HRP-CHIT；(C)GC/MWNTs-CHIT对0.5mmol/L H2O2的响应情况，结果如图4所示。由图可知，IAIB+IC，传感器具有明显的增敏效应。增敏现象可以从几方面来考虑：一方面HRP可以有效地吸附在MWNTs管壁上8，由于MWNTs具有较大的比表面积，电极表面的活性位点增多；另一方面MWNTs也可以利用其独特的三维网络结构深入HRP的活性中心9，促进酶与电极的电子传递，减少HRP外层多肽的阻抗；另外，MWNTs较大的比表面积也可以对H2O2起到富集作用；同时，注意到GC/Naf/Thi/MWNTs-CHIT对H2O2仍有部分响应（图5），MWNTs 对H2O2具有催化作用，促使H2O2还原的过电位下降。总的来说，传感器的增敏作用受到以上几个因素的协同效应的影响，涉及到MWNTs在传感器中的空间效应及电子效应。 图4 传感器不同组分对0.5mmol/L H2O2 图5 GC/Naf/Thi/MWNTs-CHIT对响应信号的贡献 0.5mmol/L H2O2的响应3.4.2 传感器的工作曲线及米氏常数利用计时电流法考察了传感器对H2O2的响应情况（图6）。结果表明，传感器的对H2O2具有快速的响应，信号达到95%所需的时间小于6s，且在H2O2浓度为30mol/L5.5mmol/L的范围内呈线性响应，方程为Current/A= 4.27210-8+ 7.04010-4C/(mol/L)，相关系数为0.9995。同时，根据Lineweaver-Burk方程10：1/Iss1/Imax+KMapp/ImaxC（式中Iss为加入底物后的电流强度，C为底物浓度，Imax为固定底物浓度后的最大电流，KMapp为米氏常数。）用双倒数法求得米氏常数为1.93mmol/L（图7）。从图形意义上来说，米氏常数为检测上限和检测下限的中点位置，而本文所求得的米氏常数与该理论非常吻合，说明在该浓度范围内，传感器的反应属于一级反应动力学过程。传感器对0.1mmol/L的H2O2分别进行了8次测量，求得R.S.D=5.8%，D.L. = 19mol/L。 图6 传感器对H2O2的标准曲线 图7 传感器的米氏常数曲线（I-t曲线由连续加入浓度为0.1mmol/LH2O2制作）3.4.3 传感器的稳定性和寿命传感器连续考察了7天，每天用0.1mmol/L H2O2分别测量6次，结果表明当传感器进入第四天后，电流下降了6.3%，但此后电流基本上稳定在75nA左右。说明传感器具有良好的稳定性和较长的寿命。4 结论利用MWNTs-CHIT包埋HRP制作了以Thi为介体的H2O2的生物传感器。实验结果表明，MWNTs由于其特殊的空间结构，电子性质，使其在传感器中起到三维网络导电骨架的作用，与一般的CHIT包埋HRP传感器相比具有明显的增敏效应。用这种方法制作的传感器具有良好的生物活性、稳定性及重现性。在这个结果之上有望开发基于氧化酶-HRP双酶体系的生物传感器。参 考 文 献1. 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