水产用微生物制剂源细菌的分离鉴定及耐药性分析.pdf

微生物制剂因其具有无毒害、无污染、低成本的优点在水产领域迅速发展，成为最具潜力的抗生素的替代产品。本研究通过对市场在售水产微生物制剂中的细菌进行分离培养与鉴定，以及抗生素药敏实验、耐药基因和可移动遗传元件的检测，评估水产微生物制剂源细菌的耐药性，为水产养殖中益生菌的筛选和安全应用提供科学依据。结果显示，分离得到的2 11株细菌可分为9 个属，其中以芽孢杆菌属、肠球菌属、乳杆菌属为主。药敏实验结果显示，2 11株分离菌株中9 8 株（46.7%）细菌表现为耐药。进一步对耐药性较强和多重耐药的7 9株细菌进行五大类（磺胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类和-内酰胺类）耐药基因和可移动遗传元件检测。结果显示，7 9株耐药菌中携带耐药基因的菌株阳性率为7 4.7%，存在多重耐药基因的菌株高达40.5%，氨基糖苷类和磺胺类耐药基因的检出率最高，分别为53.2%和40.5%。可移动遗传元件（Tn916/1545）检出率为13.9%。综上可知，市售微生物制剂中发现了耐药菌株以及耐药基因，表明水产用微生物制剂存在一定的安全隐患，应加强对微生物制剂的安全性检测和风险评估。关键词：微生物制剂；分离；鉴定；耐药性；抗性基因中图分类号：S917.1文献标识码：A文章编号：10 0 0-6 9 0 7-(2 0 2 3)0 4-0 0 12-14随着我国水产养殖设施化、集约化和规模化的快速发展，高密度养殖已成为当前的主流 。在追求高密度养殖过程中，养殖水环境承受巨大压力，水产养殖经济动物病害频发，制约了水产养殖业的健康可持续发展。为了防控养殖动物病害暴发，需要大量使用抗生素、消毒剂等化学药物。然而，这些药物的长期使用，不仅加剧了细菌耐药性的产生和耐药基因的传播，而且水产品中的药物残留也危害人类健康。在当前我国努力遏制细菌耐药，维护人民群众健康的政策下，绿色健康养殖是今后水产养殖发展的必由之路。微生物制剂指一类在自然环境中筛选得到的有益微生物及其代谢产物经过特殊加工制备而成的生物制剂2 。目前，光合细菌、硝化细菌、酵母菌、肠球菌、芽孢杆菌、乳酸菌等广泛应用于净化养殖环境、提高动物生产性能和抗病力等方面，是常用的微生物制剂3。例如，光合细菌、芽孢杆菌和硝化细菌等，因其能够降解养殖水体中的有机物、氨氮和亚硝酸盐等，常被用作水体改良剂4。一收稿日期：2 0 2 2-0 9-2 9；修订日期：2 0 2 2-12-0 5资助项目：国家大宗淡水鱼产业技术体系专项资金（CARS45）；2 0 2 1年乡村振兴战略专项资金；广东省现代农业产业技术体系创新团队建设专项资金（2 0 19KJ150）；广州市科技计划项目（2 0 190 40 2 0 0 0 4）第一作者简介：王红莉（1998、），女，硕士研究生，专业方向为水生动物医学。E-mail：w h l 0 32 7 1998 16 3.c o m通讯作者：王庆。E-mail：s u n n y _92 9 16 3.c o m;夏苏东。E-mail：x s d 2 0 0 2 2 0 0 3 12 6.c o m些具有拮抗抑菌活性的益生菌如贝莱斯芽孢杆菌（Ba c i l l u s v e l e z e n s i s）、乳酸菌因其能够产生抑菌物质从而控制病原菌的生长繁殖，具有良好的生防作用效果，是常有的生防菌5.6 。芽孢杆菌、酵母菌、肠球菌等益生菌具有增强消化酶活性，提高饲料利用率，改善肠道菌群，提高水产动物的免疫力等功能，通常用于饲料添加剂7.8 我国水产用微生物制剂的发展较晚，缺乏完善的市场监管系统，产品良莠不齐，其安全性难以保证。本实验旨在通过分离市售水产微生物制剂中的细菌，并进行耐药性分析以及耐药基因检测，进而评估水产用微生物制剂的安全性，为水产养殖中益生菌的筛选和安全应用提供科学依据。1材料和方法1.1实验材料从市场上购买35个厂家常见的45种微生态制剂（表1）。乳酸菌培养基（MRS）、牛肉膏蛋白陈培养基(LB)和水解酪蛋白陈培养基（MH)均购于广第4期州环凯微生物科技有限公司；琼脂粉购于北京奥赛星生物技术有限公司；药敏纸片购于杭州微生物试产品生产厂家产品名称1芽孢杆菌高纯度芽孢杆菌和多种维生素、氨基酸、分解有机质、去粘除臭、提高透明度促生长因子2EM王厂家13调水王2 号菌体蛋白及多种维生素4新益生菌富含菌体蛋白及多种维生素，胡萝卜素5厂家2EM原菌种乳酸菌、光合细菌、硝化细菌、酵母菌、净化水质，降低氨氮芽孢杆菌放线菌6EM菌原液枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、酿酒酵母菌厂家37EM益生菌原种芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵8厂家4浓缩EM菌母、嗜酸乳杆菌乳酸菌、酵母菌、放线菌、丝状菌、光和9厂家5浓缩EM原液细菌10EM菌液厂家611水产EM菌种菌、乳酸菌、酵母菌12厂家713厂家8复合芽孢杆菌芽孢杆菌14厂家9高活性乳酸菌粪肠球菌15厂家10EM菌浓缩粉枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、酿酒酵母菌16厂家11高效EM菌粉嗜酸乳杆菌、酵母菌、放线菌17厂家12超浓缩乳酸菌嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌硝化细菌、芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、18厂家13高活性EM菌反硝化细菌植物乳杆菌、嗜热链球菌、酵母菌、光合19厂家14浓缩EM菌粉细菌、芽孢杆菌干酪乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植20厂家15纯酿乳酸菌物乳杆菌21厂家16复合EM菌种乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌、光合细菌22厂家17EM菌浓缩粉枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌、光合细菌、调23EM厂家182425262728王红莉等：水产用微生物制剂源细菌的分离鉴定及耐药性分析表1微生态制剂产品信息Tab.1Information of the microbial agents in this study益生菌改良水质促进生长、减少疾病，提高养殖品种的质量与产量清洁养殖水体，保持水质清爽调节水质，降低氨氮调水稳水，辅助肥水稳水爽水，降解毒素调水肥水，降低氨氮芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌净水肥水，降解亚硝酸盐粪肠球菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆调水净水，降低氨氮粪链球菌粪链球菌发酵丝状菌乳酸菌乳酸菌厂家19EM菌厂家2 0EM原液乳酸菌原种嗜酸乳杆菌、丁酸梭菌、粪肠球菌厂家2 1芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、硝化菌、光EM益生菌原种合细菌、放线菌13剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司。主要成分分解残，改良水质调节水质，底质改良改善肠道，调节pH调水净水，分解残净水，洁底，肥水调水诱食，增强免疫调节水质，改良水底，降低氨氮调节水质，降低氨氮调节肠道，改善水体净化水质，降低氨氮稳水肥水，降低氨氮调水净水，降低氨氮调水净水，调节肠胃乳酸菌、酵母菌调节水质，降低氨氮乳酸菌、酵母菌、放线菌、光合细菌、硝调水净水，降低氨氮化细菌、反硝化细菌、丝状菌改善肠道，调节pH调节水质，降低氨氮功能14产品生产厂家产品名称29厂家2 230厂家2 331厂家2 432厂家2 533厂家2 6枯草芽孢杆菌液枯草芽孢杆菌芽孢杆菌、植物乳酸菌、屎肠球菌、丁酸34厂家2 735厂家2 8水产EM菌液益生菌枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪肠球36厂家2 937芽孢杆菌菌种枯草芽孢杆菌38厂家30394041424344451.2实验方法1.2.1细菌的分离与培养将购买的微生物制剂进行10 倍系列梯度稀释为10、10 0、10 0 0 和10 0 0 0 倍稀释液，分别吸取100L涂布于LB固体平板和MRS固体平板，LB固体平板置于2 8 培养2 4h，M RS固体平板置于28培养48 h。挑取形态、大小不同的菌落进行二次划线培养，并根据菌落形态特征进行第三次划线培养，直至获得纯培养物。收集纯培养物，加入LB或MRS液体培养基，并加入无菌甘油使其终浓度为2 0%，转移至菌种保藏管中置于-8 0 冰箱中保存。1.2.2分离菌株的基因组DNA提取将获得的纯培养物接种到LB或MRS液体培养基中，其中MRS平板上筛选的菌株接种于MRS液体培养基，其它细菌接种于LB液体培养基，置于28、2 0 0 r/m i n 恒温摇床培养8 12 h，收集菌体，使用细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取分离菌株的基因组DNA，将提取的DNA样品置于-18冰箱中保存备用。1.2.3分离菌株的鉴定以提取的细菌基因组 DNA 为模板，通过 PCR淡水渔业主要成分EM菌原液乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌浓缩乳酸菌乳酸菌乳酸菌原种乳酸菌肠动力乳杆菌EM菌梭菌EM菌液菌、乳酸菌、酵母菌EM菌益生菌调水王复合益生菌厂家31鱼水爽厂家32水产专用EM菌枯草芽孢杆菌芽孢杆菌纯粉枯草芽孢杆菌厂家33EM益生菌嗜酸乳杆菌、芽孢杆菌厂家34浓缩EM菌酒酿酵母、肠球菌、植物乳杆菌厂家35帅菌王2023年续表1功能稳定水体，降低氨氮优化水体，增强体质调水解毒，降低氨氮调节水产动物肠道菌群平衡调水净水，降低氨氮调水净水，分解残饵生物改底，降解氨氮调水肥水，池塘改底调水净水，改底除臭调节水质，改底除臭净水肥水，降低氨氮芽孢杆菌调水净水，优化水体净化水质，降低氨氮净化水质，降低氨氮调水净水，降亚硝酸盐净化水质，降低氨氮芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌保水稳水，肥水培藻扩增分离菌株的16 SrRNA和gyrB基因，16 SrRNA的上游引物2 7 F：5-A G A G T T T G A T CCT G G CT CA G-3，下游引物1492R:5-GGTTACCTTGT-TACGACTT-3，芽孢杆菌属gyrB9】的上游引物：5-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3下游引物：5-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3。PC R反应条件：94预变性5min；94变性30 s；5256 退火30 s；7 2 延伸1min；35个循环；72终延伸10 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，阳性PCR产物委托广州艾基生物技术有限公司测序。测序结果在NCBI中的Blastn上进行序列初步的比对分析。1.2.4药敏实验参考美国临床与实验室标准协会（CLSI)规定的纸片琼脂扩散法（K-B法）检测分离菌株对11种抗生素的敏感性10 。以金黄色葡萄球菌ATCC25923（芽孢杆菌和肠球菌的质控菌株）和大肠杆菌ATCC25922（乳杆菌和片球菌的质控菌株）作为质控菌株对分离菌株进行11种抗生素的药敏实验。所用抗生素为氯霉素、恩诺沙星、罗红霉素、复方新诺明、链霉素、四环素、庆大霉素、青第4期霉素、氟苯尼考、万古霉素、头孢氨苄。药敏实验的具体操作步骤参考文献11，12，将分离得到的乳杆菌和片球菌在MRS固体平板上培养48 h，然后挑取单克隆菌落接种于MRS液体培养基，其它菌株在LB固体平板上培养2 4h后，挑取单克隆菌落接种于LB液体培养基，将液体培养基于37、2 0 0 r/m in 摇床培养12 h，收集菌体，以0.65%生理盐水重悬，使用麦氏比浊仪将菌液浓度调整为0.5个麦氏标准单位，吸取2 0 0 L菌悬液均匀涂布于MRS固体平板、MH固体平板，乳杆菌和片球菌的菌悬液涂布于MRS固体平板，其它菌株涂布于MH固体平板，待干后再使用无菌镊子将药物含量抗菌药物/ug氯霉素30恩诺沙星10罗红霉素15复方新诺明300链霉素10四环素30庆大霉素10青霉素10氟苯尼考30万古霉素30头孢芊30王红莉等：水产用微生物制剂源细菌的分离鉴定及耐药性分析表2 抗菌药物敏感性判定标准Tab.2Decision criteria of antimicrobial susceptibility test耐药中介敏感耐药中介1213 171516 201313 221213 161213 141415 181213 14141213 171415 161415 1715药敏片贴于平板上，MRS固体平板于37 培养箱培养48 h，M H 固体平板于37 培养箱培养2 4h，每组三个平行，培养结束后测量并记录抑菌圈直径，受试菌株药敏性的判定标准参考文献10，对于缺乏耐药、中度敏感（中介）和敏感范围的芽孢杆菌、乳杆菌和片球菌参考其质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠杆菌ATCC25922的判定标准，芽孢杆菌参考葡萄球菌的药敏性判定标准，乳杆菌和片球菌参考肠杆菌的判定标准。各药敏纸片的含药量及主要分离菌株药物敏感性的判定标准见表2。抗菌圈直径/mm敏感耐药中介18122118231217121512191415121519181217141814敏感13 161719 212213 171813 161713 141515 181913 141520 272813 171815 161715 1718121815121118121312141413 1719 2116 2013 1613 1419 2313 1414 1613 1715 1615 1718222117152315171817181.2.5抗生素抗性基因的检测以提取的细菌基因组为模板，采用PCR的方法检测以下抗性基因（antibiotics resistance genes，ARGs）13-15：磺胺类耐药基因（sull、s u l 2、s u l 3）、四环素类耐药基因（tetA、t e t B、t e t C、t e t D、t e t E、tetM）、氨基糖苷类耐药基因（strA、s t r B、a a c 2、aadA、a a d K）、大环内酯类耐药基因（ermB、me f A、mphA）、-内酰胺类耐药基因（blaOXA、b l a T EM）。引物序列和退火温度见表3，PCR反应程序参考“1.2.3”，阳性PCR扩增产物委托广州艾基生物技术有限公司进行测序，测序结果用NCBI官网中的Blastn程序与GenBank数据库进行比对。2结果2.1细菌的分离与鉴定从45种微生态制剂中共分离纯化获得2 11株细菌，分离菌株的16 SrRNA基因的PCR扩增产物测序结果进行在线Blastn（h t t p s:/b l a s t.n c b i.n l m.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE-TYPE=BlastSearch&BLAST_ SPEC=&LINK_ LOC=blasttab）比对分析，初步确定分离菌株的种属分类地位。此外，下载NCBI中与分离菌株16 SrRNA基因序列同源性高的芽孢杆菌、肠球菌、乳杆菌等细菌的16 S rRNA基因序列，利用MEGA11软件采用NJ法（NeighborJo i n i n g，NJ）构建分离菌株的16 S rRNA基因系统发育树（图1）。除芽孢杆菌属的细菌外，其余菌株均可与其相对应的细16类别磺胺类四环素类氨基糖苷类大环内酯-内酰胺类整合子转座子菌16 S rRNA基因归于一簇，能够利用16 S rRNA基因的比对结果和构建的系统发育树将这些细菌确定到种。而芽孢杆菌种属间的16 S rRNA基因同源性较高，考虑到芽孢杆菌不同菌种的gyrB基因具有明显的差异性，故采用gyrB基因进一步确定其所属菌种9。下载NCBI上与芽孢杆菌同源性高的各菌种gyrB基因序列，利用MEGA11软件构建芽孢杆菌的gyrB系统发育树（图2）。在gyrB系统发育树中，不同种类的芽孢杆菌被划分为8 簇，基于淡水渔业表3耐药基因引物Tab.3The primer sequences of ARGs基因引物序列(5-3)F:GCACCGGAAACATCGCTGCAsullR:GAAGTTCCGCCGCAAGGCTCF:TCCGGTGGAGGCCGGTATCTsul2R:CGGGAATGCCATCTGCCTTGF:CTTGGTGATAACGGCAATTCsul3R:CCAATCGCAGATAGAAGGCF:GCTACATCCTGCTTGCCTTCtetAR:CATAGATCGCCGTGAAGAGGF:TTGGTTAGGGGCAAGTTTTGtetBR:GTAATGGGCCAATAACACCGF:CCGTGTATGAAATCTAACAATGCtetCR:GACGAAGGCTTGAGCGAGGGF:TGTGCTGTGGATGTTGTATCTCtetDR:CAGTGCCGTGCCAATCAGF:AAACCACATCCTCCATACGCtetER:AAATAGGCCACAACCGTCAGF:GTGGACAAAGGTACAACGAGtetMR:CGGTAAAGTTCGTCACACACF:GAGAGCGTGACCGCCTCATTstrAR:TCTGCTTCATCTGGCGCTGCF:ATCGTCAAGGGATTGAAACCstrBR:GGATCGTAGAACATATTGGCF:CCTCCTGACAACTTCCAAGAaadKR:GCAAGACCTTCTGATACAGCF:GACTGGCACTGTGATGGGATACGCaac2R:CCAAGCATCGGCATCTCATAF:GCGCCATCTGGAATCAACGTaadAR:TGCCGGTTATTGCGCTGTACF:GATACCGTTTACGAAATTGGermBR:GAATCGAGACTTGAGTGTGCF:TTCTTCTGGTACTAAAAGTGGmefAR:GTGGACAAAGGTACAACGAGF:AGCAGCGCCAGTGCATCAblaOXAR:ATTCGACCCCAAGTTTCCF:CTCACCCAGAAACGCTGGTGblaTEMR:ATCCGCCTCCATCCAGTCTAF:GTTCGGTCAAGGTTCTGGintlR:CGTAGAGACGTCGGAATGF:CAAGCATCTCTAGGCGTAint2R:AGTAGCATCAGTCAATCCF:CATCAGACGCTAAAGAATGGTn916/1545R:GGCTTCTTCAACCATAGGAA2023 年片段大小/bp退火温度/1636319163128632105865958418588445827858406585485883758689583845838858639583455870855876558905511005545255gyrB 基因序列的比对结果和构建的 gyrB系统发育树从而确定芽孢杆菌的菌种。根据Blastn比对分析结果、16 SrRNA和gyrB系统发育树的结果，确定分离菌株隶属于9个属2 0 个菌种，并且以芽孢杆菌属（Bacillus）、肠球菌属（Enterococcus）和乳杆菌属（Lactobacilus）为主，其比例分别为7 1.1%、16.6%、7.6%；产品中菌株的具体分离结果见表4和表5。第4期王红莉等：水产用微生物制剂源细菌的分离鉴定及耐药性分析17BLBLBL9LIQLNN图1基于分离菌株16 SrRNA基因序列构建的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree was constructed based on 16SrRNA gene sequences of isolates菌属芽孢杆菌属(Bacillus）乳杆菌属(Lactobacillus)片球菌属(Pediococcus)肠球菌属(Enterococcus)醋酸杆菌属(Acetobacter)肠杆菌属(Enterobacter)邻单胞菌属(Plesiomonas)微小杆菌属（Exiguobacterium）鲁梅利杆菌属（Rummelibacillus）图2基于芽孢杆菌gyrB基因序列的系统发育树Fig.2Phylogenetic tree was constructed based on gyrBgene sequences of Bacillus表4微生物制剂源菌株分离情况Tab.4Information of the strains isolated from microbial agents副地衣芽孢杆菌(B.paralicheniformis）短小芽孢杆菌(B.pumilus)蜡样芽孢杆菌(B.cereus)黄海芽孢杆菌(B.marisflavi)苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）植物乳杆菌(L.plantarum)副干酪乳杆菌(L.paracasei)布氏乳杆菌(L.buchneri)乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)屎肠球菌(Enterococcus faecium)过氧化醋杆菌(Acetobacter peroxydans)巴氏醋杆菌(A.pasteurianus)路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigi)类志贺邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides）乙酰微小杆菌（Exiguobacteriumacetylicum）鲁梅利杆菌(Rummelibacillus stabekisi)合计菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)数量77401396311347223521111221118产品123456789101112131415161718192021枯草芽孢杆菌（KC71、K C7 2）、贝莱斯芽孢杆菌（BL40）、短小芽孢杆菌（DX4-DX6）、布氏乳杆菌（B1、B2）22232425262728293031枯草芽孢杆菌（KC36）、贝莱斯芽孢杆菌（BL19）、屎肠球菌（F8）、植物乳杆菌（Z4）、乙酰微小杆菌（Q3）32枯草芽孢杆菌（KC39、K C40）、地衣芽孢杆菌（DY6）、屎肠球菌（F4-5）333435363738394041枯草芽孢杆菌（KC11、K C16）、贝莱斯芽孢杆菌（BL6、BL16）、地衣芽孢杆菌（DY13）、副地衣芽孢杆菌（FD2）642443枯草芽孢杆菌（KC13）、贝莱斯芽孢杆菌（BL17）、地衣芽孢杆菌（DY5）44枯草芽孢杆菌（KC4、K C 7 4）、地衣芽孢杆菌（DY4）、鼠李糖乳杆菌（S3）45枯草芽孢杆菌（KC1）、贝莱斯芽孢杆菌（BL3、BL7、BL14、BL37）淡水渔业表5微生物制剂产品和分离菌株的对应关系Tab.5The correspondence of microbial agents and isolated strains菌株种类及编号黄海芽孢杆菌（HH1）、蜡样芽孢杆菌（LY1)枯草芽孢杆菌（KC49）、鼠李糖乳杆菌（S1）、巴氏醋杆菌（Q1）地衣芽孢杆菌（DY1、D Y2）、枯草芽孢杆菌（KC41）蜡样芽孢杆菌（LY2）、鼠李糖乳杆菌（S2）、类志贺邻单胞菌（Q2）枯草芽孢杆菌（KC43-KC45）、地衣芽孢杆菌（DY12）、短小芽孢杆菌（DX1）贝莱斯芽孢杆菌（BL8、BL9、BL12）、乳酸片球菌（A1）枯草芽孢杆菌（KC59）、地衣芽孢杆菌（DY9）、副地衣芽孢杆菌（FD4）、粪肠球菌（F21、F2 2）枯草芽孢杆菌（KC50、K C 52）、贝莱斯芽孢杆菌（BL32）、副干酪乳杆菌（P4-P7）枯草芽孢杆菌（KC2、K C3）、地衣芽孢杆菌（DY3）枯草芽孢杆菌（KC48、K C49）、副地衣芽孢杆菌（FD5、F6）、过氧化醋杆菌（Q4、Q 5）枯草芽孢杆菌（KC62）、地衣芽孢杆菌（DY10）、副地衣芽孢杆菌（FD9）、屎肠球菌（F23-F26）枯草芽孢杆菌（KC68-KC70）、贝莱斯芽孢杆菌（BL30-BL32）、路德维希肠杆菌（Q6）枯草芽孢杆菌（KC61、K C7 3）、地衣芽孢杆菌（DY11）、屎肠球菌（F16、F32、F34）枯草芽孢杆菌（KC46、K C47）、副地衣芽孢杆菌（FD8）枯草芽孢杆菌（KC60）、贝莱斯芽孢杆菌（BL23-BL29）、短小芽孢杆菌（DX3）枯草芽孢杆菌（KC54-KC58）枯草芽孢杆菌（KC64-F67）、屎肠球菌（F18、F19、F31、F35）枯草芽孢杆菌（KC63）、副地衣芽孢杆菌（FD7）、短小芽孢杆菌（DX2）、屎肠球菌（F27-F30）蜡样芽孢杆菌（LY3）、苏云金芽孢杆菌（SY1）、植物乳杆菌（Z2、Z3）、副干酪乳杆菌（P2、P3）枯草芽孢杆菌（KC26）、副干酪乳杆菌（P1）、屎肠球菌（F11）枯草芽孢杆菌（KC32、K C 33）、屎肠球菌（F2、F15）枯草芽孢杆菌（KC30）、贝莱斯芽孢杆菌（BL21）、屎肠球菌（F13、F14）、鲁梅利杆菌（Q7、Q 8）枯草芽孢杆菌（KC23、K C 34）、屎肠球菌（F9、10）枯草芽孢杆菌（KC37、K C38）、贝莱斯芽孢杆菌（BL22）、地衣芽孢杆菌（DY8）、屎肠球菌（F7）枯草芽孢杆菌（KC27-KC29）、屎肠球菌（F12、F2 0）枯草芽孢杆菌（KC34、K C35）、地衣芽孢杆菌（DY7）、屎肠球菌（F3、F17)枯草芽孢杆菌（KC20-KC22）枯草芽孢杆菌（KC12）、戊糖片球菌（A2）贝莱斯芽孢杆菌（BL1-2、BL10、BL39）、植物乳杆菌（Z1）贝莱斯芽孢杆菌（BL5、BL11、BL34、BL35、BL36、BL38）、副地衣芽孢杆菌（FD1）枯草芽孢杆菌（KC9、K C10、K C15、K C7 5）、贝莱斯芽孢杆菌（BL15）枯草芽孢杆菌（BL17、BL18）、副地衣芽孢杆菌（FD3）贝莱斯芽孢杆菌(BL4、BL13)枯草芽孢杆菌（KC14、BL19、BL7 6）、贝莱斯芽孢杆菌（BL18）合计2023年数量/株3335458枯草芽孢杆菌（KC77）、屎肠球菌（F33）2368763958768枯草芽孢杆菌（KC25、K C53）、贝莱斯芽孢杆菌（BL20）3枯草芽孢杆菌（KC31）、屎肠球菌（F1、F6)334645555532475枯草芽孢杆菌（KC5-KC8）432345211素素第4期2.2药敏实验质控菌株对各抗生素的药敏实验结果在规定的质控范围内，表明药敏实验结果可靠。从微生物制剂中分离的2 11株细菌中有98（46.7%）株菌株表现不同程度的耐药性（图3），分离菌株中对磺胺类、氨基糖苷类和大环内酯类抗生素的耐药率最高，分别为2 7.9%、2 3.7%、19.9%；头孢类、糖肽类和青霉素类抗生素的耐药菌株比例分别为17.0%、15.6%、13.7%；四环素类、喹诺酮类和酰胺醇类抗生素表现耐药的菌株比例较低，分别为7.6%、6.2%和1.4%。其中，150 株芽孢杆菌中有45株表现耐药，耐药芽孢杆菌对除氟苯尼考以外的抗生素表现出不同程度的耐药，对庆大霉素、氯霉素、恩诺沙星、头孢氨苄、链霉素、万古霉素、四环素、罗红霉素、复方新诺明、青霉素表现耐药的菌株比例分别为0.7%、0.7%、0.7%、1.3%、2.0%、6.7%、6.7%、10.7%、13.3%、种类罗红霉素万古霉素庆大霉素枯草芽孢杆菌0地衣芽孢杆菌7贝莱斯芽孢杆菌2短小芽孢杆菌1黄海芽孢杆菌0蜡样芽孢杆菌1副地衣芽孢杆菌5苏云金芽孢杆菌0合计16876543210图4分离菌株的多重耐药情况Fig.4 The distribution of multi-drug resistance of isolates王红莉等：水产用微生物制剂源细菌的分离鉴定及耐药性分析表6 芽孢杆菌对不同药物的敏感性Tab.6Susceptibility of Bacillus to different antibiotics链霉素氯霉素氟苯尼考恩诺沙星四环素复方新诺明头孢氨苄青霉素4020110000101010101物出变布1915.3%（表6）。分离菌株中多重耐药菌株的比例为30.8%（图4），芽孢杆菌主要表现为2 重耐药和3重耐药；乳酸菌和肠球菌的耐药性较强，乳杆菌和乳球菌主要表现为4重和5重耐药，肠球菌主要表现为3重、4重和5重耐药。耐药中介敏感%0Fig.3 The results of the antibiotic sensitivity test of isolates耐药菌株数量2000100000010000312重耐药2.3ARGs的定性检测及分布3重耐药4重耐药5重耐药6重耐药7重耐药其万图3分离菌株药敏实验结果000001000000000001根据药敏实验结果，挑选7 9株耐药性较强和耐药重数较高的耐药菌株，其中有2 8 株芽孢杆菌（11株枯草芽孢杆菌、6 株地衣芽孢杆菌、5株短小芽孢杆菌、2 株贝莱斯芽孢杆菌、2 株蜡样芽孢杆菌、1株副地衣芽孢杆菌、1株苏云金芽孢杆菌）、2 8 株肠球菌、16 株乳杆菌、3株醋杆菌、2株片球菌、1株邻单胞菌和1株肠杆菌，进一步对其耐药基因和可移动遗传元件（整合子 intl、i n t 2和共轭转座子Tn916/1545）进行检测。耐药基因的PCR电泳检测结果如图5，对阳性PCR扩增产物进行测序，测序结果用NCBI官网中的Blastn程序与GenBank数据库进行比对，序列与数据库的抗生素65240004111302011020001100002952412012320相应基因的序列相似性97%，确定扩增产物为目的耐药基因。本研究发现7 9株耐药菌株中检出耐药基因的共计59株，不同种属检出耐药基因的菌株结果见表7，并且 sul2、s u l3、t e t C、a a d K、aadA、e r m B、m e f A 耐药基因的检出率分别为34.2%、2 6.6%、7.6%、53.2%、19.0%、10.1%、2.5%，其他耐药基因检测结果为阴性（表7）。氨基糖苷类和磺胺类耐药基因的检出率显著高于其它耐药基因，分别为53.2%和40.5%，并且7 9株耐药菌株中携带多重耐药基因的菌株比例为40.5%，以肠球菌同时携带氨基糖苷类和磺胺类耐药基因为Tab.7TThe detection rate of drug resistance genes in different strains菌株sul2枯草芽孢杆菌地衣芽孢杆菌贝莱斯芽孢杆菌短小芽孢杆菌副淀粉芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌粪肠球菌植物乳杆菌副干酪乳杆菌鼠李糖乳杆菌戊糖片球菌布氏乳杆菌过氧化醋杆菌淡水渔业主。可移动遗传元件（共轭转座子Tn916/1545）检出率为13.9%，未检测到intl和int2。M 123451000700500400300200100图5耐药基因PCR扩增产物的电泳图谱Fig.5Detection of drug resistance genes by electrophoresisMarker:DL1000;1-7:sul3,sul2,tetC,aadK,aadA,ermB,mefA。表7 不同种类菌株耐药基因检出率%抗生素抗性基因检出率sul3tetC7.62.51.31.31.32.522.82.51.32023 年67aadKaadA3.81.3一12.731.62.517.62.51.32.5ermB一一19.010.1一mefA1.31.3一Tn916/15451.32.58.91.3邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides），只有一株蜡样3讨论芽孢杆菌不具有溶血活性，其余3株菌株均具有溶本研究从45种水产用微生物制剂中分离到血活性，并且，分离得到的蜡样芽孢杆菌携带溶血211株细菌，分离菌株经过分子生物学鉴定，结果性肠毒素基因（hblA、h b l B），不符合我国饲用微生显示这些菌株可分为9个属，其中芽孢杆菌属比例物添加剂使用菌株的安全标准；对分离的4株潜在最高（7 2.0%）；其次是肠球菌属（16.6%），再次致病菌进行了其对斑马鱼（Danio rerio）的致病性实是乳杆菌属（7.6%）。根据2 0 13年农业部发布的验，斑马鱼在攻毒7 天内均有不同程度的死亡现象饲用添加菌种名单，本研究中分离的菌株符合上述（2 5%90%），表明这4株细菌均具有一定的致名单的菌株只有137 株16 ，其比例为6 4.9%。从病性。蜡样芽孢杆菌是引起食源性疾病的常见细菌微生物制剂里还分离得到4株潜在的致病菌，分别之一，当食品中蜡样芽孢杆菌的数量超过10 3是3株蜡样芽孢杆菌（Bacilus cereus）和1株类志贺CFU/g时，会对食用者造成潜在的危害，因此，诸第4期耐药基因检出率/%相似性/%sullsul2sul3tetAtetBtetCtetEtetMstrAstrBaadKaac2aadAermBmefAblaOXAblaTEMintlint2Tn916/1545多国家为防止蜡样芽孢杆菌导致食物中毒对其在食品中的含量进行了明确规定，蜡样芽孢杆菌能够通过产生肠毒素和呕吐毒素导致食物中毒，主要症状表现为呕吐、腹泻，临床上偶尔会通过菌体感染导致眼部疾病、心内膜炎、脑膜炎、菌血症等疾病17 ；蜡样芽孢杆菌同样可以导致多种水产经济动物如半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）【18 、罗非鱼（Oreochromis niloticus）【19 等发病甚至死亡。类志贺邻单胞菌是一种可导致人、畜、鱼共患病的条件致病菌，类志贺邻单胞菌感染能够引起急性肠胃炎、脑膜炎、蜂窝组织炎、骨髓炎、菌血症等疾病2 0 。这两种致病菌均可使人、畜、鱼患病，水产用微生物制剂中含有致病菌不仅对养殖动物造成潜在的致病风险，而且可能会危害水生态环境，进而威胁公共卫生安全。抗生素的长期使用引起养殖环境中的细菌普遍具有耐药性和抗性基因，微生物制剂中的菌株主要王红莉等：水产用微生物制剂源细菌的分离鉴定及耐药性分析表8#抗生素抗性基因检出率Tab.8Detection rate of ARGs34.298.3226.698.21一一7.698.57一53.2一19.010.12.5一13.921来源于养殖环境和健康动物，若生产厂家开发微生物制剂时未对其进行耐药性检测或者生产过程不规参考序列范引人了其他的耐药性细菌等，均会增加市售微生物制剂中存在耐药菌和耐药基因的可能性。通过对微生物制剂中分离得到的菌株进行实验室常用抗生VDA51098.1素的耐药性检测，我们发现46.7%的菌株表现不MBR3380865.1同程度的耐药性，其中对氨基糖苷类、-内酰胺类和磺胺类抗生素耐药的菌株比例最高，可能与这些抗生素作为兽药的使用历史悠久，以及抗生素的滥AFR43493用有关，因为每年的水产品样品检测中时常有关于检出禁用抗生素和可用抗生素超限量使用的报道2 1。根据药敏实验结果，本研究进一步对耐药菌的耐药基因及可移动遗传元件进行检测，耐药基因 sul2、s u l 3、t e t C、a a d A、a a d K、e r m B、m e f A、Tn916/1545的PCR扩增序列与数据库的相应序列100.00AAB80893.1一98.76100.0097.98一100.00相似性97%，进一步验证了阳性PCR产物扩增的结果。氨基糖苷类、磺胺类耐药基因的检出率与ADM62671.1药敏实验结果的氨基糖苷类、磺胺类耐药菌耐药比AF299292.1例相符；然而，-内酰胺类和大环内酯类耐药基因检出率与药敏实验结果不符，这可能是由于乳酸菌AC131199.1对-内酰胺类抗生素具有天然的耐药性，而肠球菌细胞壁坚厚，抗生素难以进入菌体，并且肠球菌可产生一种特殊的青霉素结合蛋白（PBPS）导致其对青霉素耐药2 2 ，而大环内酯类耐药基因的检出率低于其耐药表型，可能是由于大环内酯类耐药基MBR3379297.1因众多，本研究中仅检测了几种常见的大环内酯类耐药基因，存在部分耐药基因未被检测到，可能正是由于这些原因造成了-内酰胺类和大环内酯类耐药菌数量多但耐药基因检出率低的原因本研究中7 4.