水稻萌发耐淹性的遗传分析_李姗.pdf

种子发芽耐受性及发芽耐低氧相关基因的发掘与应用，是直播稻新品种培育的前提，研究种子发芽耐低氧成苗特性，对提高直播稻产量具有重要意义。采用200份东乡野生导入系成熟的水稻种子，进行了正常萌发试验、淹水低氧萌发试验和遗传谱图构建、筛选候选基因的实验。结果表明，水稻群体内耐淹萌发性状存在广泛的表型变异。主要成分分析说明水稻群体内部存在明显的群体结构，这种结构对于关联分析有着较强的影响。利用主要成分作为关联分析的协变量，可以提高关联分析的准确度。对200份材料的耐淹水稻干重进行全基因组关联分析，共检测到了10个与耐淹水稻干重相关的SNP位点，基于水稻基因组注释，通过LD衰减水平，在关联SNP位点上下游区域检测到227个基因，其中9个为关联候选基因。在此基础上，通过全基因组关联分析，构建了一张高密度遗传连锁图谱，获得了多个关键 QTL。研究结果将为今后选育耐涝水稻新品种奠定基础，对提高直播稻育种水平具有重要的理论与现实意义。关键词水稻；耐淹；萌发；关联分析中图分类号S435.111.2文献标志码Adoi:10.3969/j.issn.1673-887X.2023.05.011Genetic Analysis of Submergence Tolerance in Rice GerminationLi Shan(Hubei University,Wuhan 430062,Hubei,China)AbstractAbstract：The discovery and application of genes related to seed germination tolerance and germination tolerance to hypoxia are theprerequisite for the cultivation of new varieties of direct seeding rice.The research on seed germination tolerance to hypoxia andseedling formation characteristics is of great significance for improving the yield of direct seeding rice.In this study,200 mature riceseeds from Dongxiang wild imported lines were used for normal germination test,waterlogging and hypoxia germination test,and genetic spectrum construction and selection of candidate genes.The results showed that there was a wide range of phenotypic variationin subflooding tolerance traits.The main component analysis showed that there was obvious population structure within the rice population,and this structure had a strong influence on the association analysis.The accuracy of correlation analysis can be improved byusing main components as covariables.A total of 10 SNP loci related to dry weight of flooded rice were detected by genome-wide association analysis of 200 materials.Based on rice genome annotation,227 genes were detected in the upstream and downstream regions of associated SNP loci through LD attenuation level,nine of which were association candidate genes.On this basis,a high density genetic linkage map was constructed by genome-wide association analysis,and several key QTLS were obtained.The results ofthis study will lay a foundation for breeding new varieties of waterlogging tolerant rice in the future and have important theoreticaland practical significance for improving the level of direct seeding rice breeding.Key words：rice,flood resistance,germination,association analysis水稻在国计民生和农业生产方面有着重要的影响，是最普遍的农业经济作物品种之一。水稻生长期间一旦发生水淹，会引起水稻缺氧，植株会通过厌氧呼吸来获取氧份（养份）维持其基本的生理活动，同时会产生乙醇。若水稻植株长时间处于缺氧状态，则会因产生过多的乙醇而中毒，造成稻秧植株组织溃败，导致植株萎缩或死株等。缺氧在很大程度上还会加重水稻稻瘟病、立枯病的发生，是制约水稻生产的重要因素。2019年孙凯等人利用200份来源广泛的水稻种质为材料，在有氧环境下进行萌发试验，测量种子萌发率、萌发指数和活力指数；在低氧条件下测量芽鞘长和芽鞘直径；进行耐淹成苗试验，测定耐淹成苗率。发现种子活力、芽鞘长与耐淹成苗率密切相关，可作为筛选高耐淹成苗水稻材料的重要性状。进行了全基因组关联分析、转录组分析与基因表达模式比较的联合应用，可提高候选基因的筛选效率。分析了影响耐淹成苗率的关键表型性状，挖掘相关的遗传位点和候选基因1。2020年王杰等人对水稻育种发展趋势进行了分析，综述了水稻耐淹水萌发表型的遗传研究、基因鉴定、连锁分子标记开发等工作，并指出了该领域应用研究的关键问题2。2021年孙志广等人对来自不同年代和地区的191份粳稻种质资源进行了萌发耐淹性鉴定，共获得12份萌发耐淹性强的种质资源，其中连粳15号表现出较强的低氧萌发能力。利用收稿日期2023-03-01作者简介李姗（1997-），女，河南人，硕士研究生在读，研究方向：水稻。试验研究第5期（总第401期）28其与籼稻品种构建的分离群体，采用模拟大田的鉴定方法，在水稻1号、3号、9号、10号染色体上共检测到4个QTL3。虽然已有较多的水稻低温萌发农艺性状的研究报道，但针对耐淹萌发的表现和遗传鉴定研究较少。本研究利用具有遗传多样性的种质资源构建自然群体，结合实验采集、分析水稻遗传数据，以期为选育耐淹品种、提高水稻产量提供依据。1材料与方法1.1试验材料本试验以 200 份常规粳稻为试验材料，来自于东乡野生导入系自然群体。1.2试验试剂本实验所用试剂包括次氯酸钠、无水乙醇、氢氧化钠、乙二胺四乙酸、琼脂糖、蛋白胨、酵母提取物、硼酸、氯化镁、曲拉通、肌醇、蔗糖、葡萄糖、硝酸钾、硫酸铵、硫酸镁、硫酸铜、硫酸亚铁、硫酸锌、磷酸二氢钾、钼酸钠、谷氨酰胺、脯氨酸、水解酪蛋白等。实验所用灭菌水为超纯水，DNA提取液采用EDTA法配制。1.3试验设备电热恒温水浴锅、电子天平、离心机、植物组织破碎仪、漩涡振荡器、磁力搅拌器、pH计、移液枪、PCR仪、微波炉、电泳仪、电泳槽、恒温摇床、光照培养箱、根系扫描仪。1.4试验方法1.4.1种子萌发试验200份自然群体材料，每个材料设 3 次生物学重复，每个重复内分 2 次技术重复，每个技术重复取100粒种子，放置在铺好的两层中速定性滤纸的9 cm直径培养皿上，加10 mL超纯水，盖上培养皿盖子，放置在恒温光照培养箱中培养7 d，培养箱内温度设置为30，光照设置为光照8 h、无光照16 h。每隔24 h 测量记录萌发种子个数持续7 d，第7 d记录未萌发种子数，测量萌发率、萌发势、萌发指数和活力指数。萌发率=（萌发种子数/种子总数）100%.（1）萌发势=（规定时间内萌发种子粒数/供试种子粒数）100%.（2）萌发指数=（Gt/Dt）.（3）式中：Gt第t天新萌发的正常幼苗数；Dt萌发的天数。活力指数=（Gt/Dt）幼苗的干质量.（3）1.4.2淹水低氧萌发试验200份自然群体材料，每个材料设 3 次生物学重复，每个重复内份 4 次技术重复，每个技术重复取 5 粒种子（筛选去除空粒、瘪粒的种子），放置在 50 mL透明塑料离心管中，加满超纯水并盖紧盖子造成淹水低氧环境，放置在恒温光照培养箱中培养 6 d，培养箱内温度设置为 30，光照设置为光照 8 h、无光照16 h。6 d后用根系扫描仪测量芽鞘长度及芽鞘直径。1.4.3遗传图谱构建/全基因组关联分析采用琼脂糖凝胶电泳分析 DNA 的纯度和完整性，Nano-drop 检测 DNA纯度，Qubit 进行浓度分析定量。采用GWAS专业分析软件，采用混合线性模型，对群体结构和个体亲缘关系进行校准，同时减少计算时间。并利用已经公布的 SNP 数据，对不同群体的相关性状进行关联分析，查找出潜在的候选的基因点位。1.4.4筛选候选基因/关联位点分析如果某一个 SNP 位点与表型性状呈显著关联，那么就认为这个 SNP 与表型数据存在协同变异关系。根据和水稻基因组注释，查找与其相关的基因作为重要的候选基因。根据己发表的文章，查找己定位的QTL，查找在水稻中存在的同源基因。与 GWAS 显著峰值位点进行比对，查找到候选基因。2试验结果与讨论2.1水稻种子正常萌发表现对200份自然群体材料在正常条件下的10个表型进行调查。其中萌发指数标准误差最大，是0.681 5，正常苗干质量和正常根干质量标准误差最小，是0.000 1；说明萌发指数的离散程度最大，品种间的差异也越大。正常根干质量变异系数最大，是0.393 4，萌发率变异系数最小，是0.051 6。2.2水稻种子水淹低氧萌发表现低氧条件处理200份自然群体材料，对群体材料的芽鞘长、芽鞘直径、苗长、总根长、苗鲜质量、根鲜质量、苗干质量以及根干质量进行调查并进行统计分析。其中总根长标准误差最大，是0.106 7，苗干质量和低氧根干质量最小，接近零说明低氧总根长的离散程度最大，品种间的差异也越大。根干质量变异系数最大，是0.457 6，芽鞘直径变异系数最小，是0.073 2。表1正常萌发与水淹低氧萌发数据对比Tab.1 Comparison of normal germination and waterloggedhypoxic germination data调查项目芽鞘长cm芽鞘直径mm苗长cm总根长cm苗鲜质量g根鲜质量g苗干质量g根干质量g状态低氧低氧低氧正常低氧正常低氧正常低氧正常低氧正常低氧正常极小值0.964 00.454 42.930 62.958 42.324 613.507 10.009 60.011 60.004 90.014 10.000 90.001 10.000 50.001 5极大值3.46220.657 69.433 68.613 911.172 852.430 80.029 40.055 50.040 10.043 00.009 20.010 70.005 20.012 3均值2.301 90.528 75.866 00.081 25.160 25.710 70.018 60.018 50.009 30.022 50.001 90.002 90.001 00.002 7标准差0.457 70.038 71.138 00.020 41.618 60.776 20.003 40.003 80.003 00.004 20.000 70.001 00.000 40.001 1变异系数0.198 80.073 20.194 00.250 70.313 70.135 90.181 80.207 50.327 30.184 60.383 90.361 10.457 60.393 42.3关联位点分析使用 Plink软件，将等位基因频率 MAF0.05和缺失率试验研究农业技术与装备第5期（总第401期）290.1作为阈值，对所选择的200份自然群体材料的 SNP数据进行筛选。群体分层分析主要分为群体进化树分析和主成分分析，两者的结果可以进行相互验证4，5。距离矩阵采用TreeBest软件计算，采用邻接法构建系统进化树。引导值经过达1 000次计算获得；此群体主要可分为两个亚群，第一个亚群共6个材料，另外一个亚群包括其他194材料。利用200份水稻自然群体品种进行简化基因组测序，基因组大小为374424240bp，群体样本平均比对率为96.17%，对基因组的平均测序深度为14.16X，平均覆盖度为11.24%，至少有4四个碱基的覆盖度为5.99%。SAMTOOLS 软件检测共获 得 了 652 457 个 SNP 位 点，经 过 条 件 为 dp2、Miss0.9、Maf0.01的过滤后，最后共获得了161 657个高质量的 SNP 位点用于后续分析。对200份材料的耐淹苗干质量进行全基因组关联分析，共检测到了10个与耐淹苗干质量相关的 SNP位点，基于水稻基因组注释，依据 LD 衰退水平，本研究在关联 SNP位点上下游区域，共检测到227个基因，对其中 9 个与 本 研 究 相 关 的 基 因 进 行 注 释。在 关 联 位 点 Chr01_35309315 附近找到了一个与 WRKY24 转录因子相关的基因；在Chr08_20219220位点附近找到了3个基因，分别为编码含 CCHC型结构域的锌指蛋白基因，编码含PHD型结构域的锌指蛋白基因以及编码含 CAH1结构域碳酸酐酶基因；在Chr08_19427880 位点附近找到了4个基因，分别是编码乙醇脱氢酶基因，编码亮氨酰-tRNA 合成酶基因和两个编码含PHD 型结构域的锌指蛋白基因；在 Chr12_10787959 位点附近找到了一个编码热休克蛋白 DnaJ 的基因。3结论对200份水稻品种的萌发耐淹性检测结果表明，水稻群体内耐淹萌发性状存在广泛的表型变异。主要成分分析说明水稻群体内部存在明显的群体结构，这种结构对于关联分析有着较强的影响。利用主要成分作为关联分析的协变量，可以提高关联分析的准确度。对200份材料的耐淹水稻干重进行全基因组关联分析，共检测到了10个与耐淹水稻干重相关的SNP位点，基于水稻基因组注释，通过LD衰减水平，在的关联SNP位点上下游区域检测到227个基因，对其中9个为关联候选基因。在对更有代表性的核心种质进行评价时，发现粳稻萌发耐淹能力并不是单纯的较强，而是表现出较大的差异，这不同于侯名语（2004）等人的研究，他们提出了粳稻和粳稻萌发耐淹能力不同，粳稻的萌发耐淹能力也不同，而且可能表现出较强的缺氧萌发能力6。这很可能是因为所选择的实验材料的差异。本研究结果还发现胚芽鞘长为2.02.3 cm的种质资源占比最多，达到48.2%，群体变异率为27.9这说明粳稻品种的萌发耐淹性存在着广泛的遗传变异，这与王洋等（2009）研究结果相一致7。在该研究中，发现了一个 QTL位点控制两个或多个性状的现象，曾长英（2006）指出 QTL的“多效性”是指同一 QTL位点同时作用于两个或多个数量性状，并对多个性状起调控作用8，而前期工作也证实了该现象。参考文献1孙凯,李冬秀,杨靖,等.水稻耐淹成苗率相关性状全基因组的关联分析J.中国农业科学,2019,52(3):385-398.2汪杰,李世明,王楚桃,等.水稻育种发展趋势及直播耐淹水萌发研究进展J.中国种业,2020(8):4-7.3孙志广,王宝祥,周振玲,等.水稻萌发耐淹性种质资源筛选及QTL定位J.作物学报,2021(1):61-70.4胡涛,宋佳瑜,吴爱婷,等.东乡野生稻低温发芽力QTL定位及超级稻耐冷改良J.植物遗传资源学报,2018,19(4):627-632.5陈孙禄,王俊敏,潘佑找,等.水稻萌发耐淹性的遗传分析J.植物学报,2012,47(1):28-35.6侯名语,江玲,王春明,等.水稻种子低氧发芽力的QTL定位和上位性分析J.中国水稻科学,2004(6):9-14.7王洋,王盈盈,洪德林.太湖流域水稻种子活力和耐缺氧能力遗传变异研究J.南京农业大学学报,2009,32(3):1-7.8曾长英,徐芳森,孟金陵,等.从QTL到QTG的路还有多远?J.遗传,2006(9):1191-1198.参考文献1朱剑宏.南美藜的化学组成和营养价值J.成都大学学报(自然科学版),2002(2):24-28.2王晨静,赵习武,陆国权,等.藜麦特性及开发利用研究进展J.浙江农林大学学报,2014(2):296-301.3魏玉明,黄杰,顾娴,等.甘肃省藜麦产业现状及发展思路J.作物杂志,2016(1):12-15.4陆敏佳,莫秀芳,王勤,等.藜麦基因组DNA提取方法的比较J.农业科学与技术（英文版）,2015(7):1343-1347+1446.5陈志婧,廖成松.7个不同品种藜麦营养成分比较分析J.食品工业科技,2020(23):266-271.6刘文瑜,杨发荣,谢志军,等.不同品种藜麦幼苗对干旱胁迫的生理响应及耐旱性评价J.干旱地区农业研究,2021(6):10-18.7刘文瑜,杨发荣,黄杰,等.NaCl胁迫对藜麦幼苗生长和抗氧化酶活性的影响J.西北植物学报,2017(9):1797-1804.8杨发荣,黄杰,魏玉明,等.藜麦生物学特性及应用J.草业科学,2017,34(3):607-613.（上接第27页）试验研究李姗：水稻萌发耐淹性的遗传分析30