细胞生物学实验-叶绿体和线粒体的分离.pdf

叶绿体和线粒体的分离及活体染色叶绿体叶绿体叶绿体是植物细胞所特有的能量转换器，光合作用就是在叶绿体中进行的，所以在细胞生物学、遗传学、分子生物学中都有很重要的研究地位。叶绿体由叶绿体外被、类囊体和基质三部分组成，叶绿体含有三种不同的膜：外膜、内膜、类囊体膜和三种彼此分开的腔：膜间隙、基质和类囊体腔。外膜内膜基质类囊体类囊体基质基粒类囊体膜间隙线粒体线粒体外膜内膜嵴基质线粒体作为细胞的动力工厂，是细胞内氧化磷酸化和合成ATP的主要场所。线粒体由两层膜包被，外膜平滑，膜向内折叠形成嵴，两层膜之间有腔，线粒体中央是基质。基质内含有三羧酸循环所需的全部酶类，内膜上含有呼吸链酶系及ATP酶复合体。实验目的：1.了解细胞器分离的原理和常用方法2.了解细胞器活体染色的原理和常用方法3.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用实验器材：新鲜的菠菜叶、冷冻离心机、荧光显微镜、普通光学显微镜、纱布、烧杯、胶头滴管、载玻片、盖玻片、刀片、研钵0.35 M氯化钠溶液、0.01吖啶橙（Acridine Orange）小白鼠肝脏、解剖刀剪、冰浴装置、吸管、玻璃匀浆器、冷冻离心机、培养皿匀浆介质I（0.25 M蔗糖；0.035 M EDTA；0.05 M Tris-HCl，pH=7.4）、匀浆介质II（0.21 M甘露醇；0.07 M蔗糖；0.005 M Tris-HCl，pH=7.4；0.001 M EDTA）、0.02%詹纳斯绿（Janus Green B）in 0.25 M蔗糖、70酒精叶绿体和线粒体的分离及活体染色实验原理：1、差速离心（适用于不同沉降速度的颗粒分批分离）采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度及不同的离心时间下分批分离的方法。一个颗粒在一个固定离心力的作用下的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同悬浮颗粒介质的粘稠度有关。当以一定离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加上转速下再进行离心，又得到第二部分较大、较重颗粒的“沉淀”及含较小和较轻颗粒的“上清液”，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好分开。这时所得沉淀是不纯的，需经再悬浮和再离心（23次），才能得到较纯颗粒。差速离心方法较简单，但分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其它分离手段之前的粗制品提取（如细胞和病毒的分离等）。叶绿体和线粒体的分离及活体染色实验原理：2、密度梯度离心（适用于沉降系数较接近的物质分离的方法）不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。常用的介质为蔗糖、甘油等。密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度；离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带。可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分。叶绿体和线粒体的分离及活体染色实验原理：3、等密度离心当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的物质得到分离；离心介质、密度梯度范围与密度梯度离心不同，欲分离的颗粒密度处于离心介质密度范围内。等密度离心常用介质为氯化铯、硫酸铯、溴化铯、三碘苯衍生物等。介质溶液与样品液混合均匀，离心足够长的时间。介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。叶绿体和线粒体的分离及活体染色实验原理：活体染色是指用染料标记生活有机体的细胞或组织但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示活细胞内的某些结构，同时即不影响细胞的生命活动也不会产生任何物理、化学变化导致细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下细胞的形态结构和生理、病理状态。根据所用染色剂的性质和染色方法不同，通常把活体染色分为体内活染和体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此就发生了吸引作用。但不是任何染料都可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料配成稀的溶液来使用。一般以碱性染料最为常用，因为碱性染料具有溶解在类脂质的特性，易于被细胞吸收，如中性红、詹纳斯绿、次甲基蓝、甲苯胺蓝、亮焦油紫等。其中詹纳斯绿和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最常用的染料，分别对线粒体和液泡系有特异性的染色。叶绿体和线粒体的分离及活体染色叶绿体和线粒体的分离及活体染色实验原理：有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发出橘红色荧光。吖啶橙（Acridine Orange，AO）是一种荧光色素，其滤色片激发波长为488 nm。阻断波长515 nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光（即着色特异性）：DNA是个高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，发绿色荧光；而RNA聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，发红色荧光。线粒体的细胞色素氧化酶能使詹纳斯绿染料始终保持在氧化状态而呈蓝色，周围细胞质内的染料却被还原成无色的色基，在进行细胞的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染料中染色15 min后再盖上盖玻片，以使材料充分氧化。实验步骤（叶绿体部分）叶绿体悬浮液：1，选取鲜嫩的菠菜叶，清洗后除去叶梗及粗的叶脉，称适量叶子放于研钵中，加入5ml 0.35M氯化钠溶液，研磨制成匀浆液。2，将匀浆液通过6层纱布过滤到烧杯中。3，取4 ml滤液在1000 rpm 4下离心2 min。弃去沉淀。4，将上清在3000 rpm 4下离心5 min，弃去上清液，所得到的沉淀就是叶绿体。5，沉淀用适量的氯化钠溶液重新悬浮。6，滴此悬液在载玻片上，在普通显微镜和荧光显微镜下观察，再取一份滴加0.01吖啶橙染色后放于荧光显微镜下观察。徒手切片：将菠菜叶置于载玻片上，加上2滴0.35 M氯化钠溶液，用手术刀片与水平方向成30度角将菠菜叶切削成一个斜面（尽可能选择较薄的部分切），用盖玻片轻轻压平后在显微镜下观察边缘部分。滴加吖啶橙染色染色2分钟，洗去余液，加盖盖玻片后用荧光显微镜观察。叶绿体和线粒体的分离及活体染色实验结果（叶绿体部分）普通显微镜下：1，表皮细胞:：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞；2，保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞；3，叶肉细胞：为排列成栅状的长形和椭圆形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。叶绿体和线粒体的分离及活体染色10 X40 X游离叶绿体自发荧光叶绿体和线粒体的分离及活体染色游离叶绿体丫啶橙染色实验结果（叶绿体部分）荧光显微镜下：叶绿体发出火红色荧光，吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光。徒手切片的自发荧光叶绿体和线粒体的分离及活体染色徒手切片吖啶橙染色实验结果（叶绿体部分）荧光显微镜下：叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱,气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少。吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光,气孔仍为绿色。游离叶绿体自发荧光的激光共聚焦照片叶绿体和线粒体的分离及活体染色叶脉自发荧光的激光共聚焦照片实验步骤（线粒体部分）1、小白鼠断颈处死。（注意捕杀老鼠的手法）2、以70乙醇消毒外部后剖腹取肝。3、用预冷到 0 的匀浆介质洗净后将肝脏剪碎、加入适量的匀浆介质后转移到玻璃匀浆器中，冰浴匀浆。（注意玻璃匀浆器的使用方法）4、肝组织匀浆后转移到离心管中，4 3400 rpm离心10min。取上清液。5、上清液4 4000 rpm离心15min。6、弃去上清液，将沉淀以适量匀浆介质悬浮制成线粒体悬浮液，吸滴于载波片上，再加滴詹纳斯绿染色液，室温下静置染色15 min。7、加盖盖玻片，置普通光学显微镜下观察。叶绿体和线粒体的分离及活体染色注意事项：1.染料有毒，如果粘到皮肤上需要尽快用水冲洗干净。2.统一进行离心以尽可能节约时间。3.老鼠的尸体需要集中放置。解剖方法：把小白鼠颈椎脱臼处死，用湿棉球把腹部中线的毛濡湿，提起生殖器前方的皮肤，用剪子剪一小口，沿腹中线剪到颔下，把皮肤向两边分离。再剪开下腹部的肌肉，也沿中线剪开肌肉到胸骨下缘，向左右两侧分别剪断肋骨下端后，向前上方剪，直到断开左边锁骨，打开胸腔。消化系统：用镊子撑开口腔，可以看到：4枚门齿、12枚臼齿和舌。再用镊子提起颈前部的气管，可以看到肌肉质的食管穿过胸部和膈，连接口袋状的胃，胃下是肠，由肠系膜相联系着盘曲在腹腔内，腹腔前上方有紫红色的肝脏，右肝内侧有一个黄绿色的胆囊，胃下方有粉红色的胰脏。呼吸系统：鼻孔里是鼻腔。颈前方有长管状的气管，有不完全的软骨环支持。用指触摸，感觉到有弹性。气管下端分成两条支气管入肺。肺是玫瑰色的，呈海绵状，分左右叶紧贴着肋骨。心脏：位于左右肺叶的中间。小心剪开心包膜，看到圆锥形的心脏。上部是心房，下部是心室。小白鼠的解剖示意图思考题：1.叶绿体实验中，吖啶橙染色的叶绿体和细胞核颜色分别是什么，为什么不同？2.线粒体实验中所用的EDTA作用是什么？EGTA和EDTA在作用上有何不同？是否可以替代？为什么？3.线粒体正常情况下是什么样一个形态？饥饿过后观察又是什么形态？为什么会有如此变化？4.本实验所用小白鼠为什么要经过饥饿处理？对实验有什么好处？叶绿体和线粒体的分离及活体染色