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“生物技术实践”模块中若干问题探讨 江苏省中小学教学研究室（210013）吴举宏1、能简要介绍一下嫩肉粉、红曲粉、海藻酸钠等实验材料吗？嫩肉粉又称嫩肉晶，为肉类嫩化剂，一般肉类嫩化剂配方为木瓜蛋白酶，葡萄糖，味精及食盐等，其主要功效成分是蛋白酶。嫩肉粉中的蛋白酶制剂，多是用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或米曲霉蛋白酶制成的。目前蛋白酶的提取多源于植物性原料，如木瓜、生姜、菠萝等。其命名一般也是根据提取原料而确定，例如从生姜中提取的叫生姜蛋白酶，从木瓜中提取的叫木瓜蛋白酶。以时下嫩肉粉中常用的木瓜蛋白酶为例，其加工工艺是，先将未成熟的木瓜果实割口，收集其乳液，然后通过一系列加工得到木瓜蛋白酶，再添加一定比例的其他辅助剂，即制成了嫩肉粉。蛋白酶能对肉中的弹性蛋白和胶原蛋白进行部分水解，使肉类制品口感达到嫩而不韧、味美鲜香的效果。由于其嫩化速度快且效果明显，因此目前已广泛应用于餐饮行业。由于嫩肉粉所含蛋白酶的活性与温度、pH等有关，因此使用时最适温度为左右，最适p大约在范围内，而在高温、过酸或过碱的环境中，蛋白酶会变性失活，从而难以发挥作用。红曲粉是将红曲米经粉碎后加工形成，而红曲米则以籼稻、粳稻、糯米等稻米为原料，用红曲霉菌发酵而成，红曲米外皮呈紫红色，内心呈红色。红曲霉，属子囊菌纲曲霉目曲霉科红曲霉属真菌，菌丝体初期在米粒内部生长，无色，后渐变为紫红色。无性生殖时，菌丝分枝顶端形成单独的或一小串球形或梨形的分生孢子。有性生殖时，产生球形、红色闭囊果，内生含有八个子囊孢子的子囊。红曲米是中国独特的传统食品，距今已经有千年历史，早在李时珍所著本草纲目中就有记载。本世纪七十年代末，日本学者远藤章教授等人从红曲中分离出一种能降低人体血液中胆固醇的有效物质，并且命名为Monacolin-k，为红曲具有降血压、降血脂作用提供了科学依据。红曲用途广泛，在烹饪中用于烧菜染色，如江苏名菜樱桃肉、无锡排骨的制作；用于烧腊、酱卤食品，如广东叉烧和某些卤水的制作；用于制作红腐乳和红肠上色，以及配制糖醋等复合味时调色；粥饭、面食、腐乳、糕点、糖果、蜜饯等在制作中也经常用到红曲粉；红曲还可作为中医药材，具有降低血脂、健脾消食、活血化淤等特殊功效。海藻酸钠又名褐藻酸钠、海带胶、褐藻胶、藻酸盐，为白色或淡黄色不定形粉末，无臭、无味，易溶于水，不溶于酒精等有机溶剂，是由海带中提取的一种天然多糖。海藻酸钠(C6H7O8Na)n主要由海藻酸的钠盐组成，由a-L-甘露糖醛酸(M单元)与b-D-古罗糖醛酸(G单元)通过1，4-糖苷键连接并由不同GGGMMM片段组成的聚合物。1881年，英国化学家E.C.Stanford首先对褐色海藻中的海藻酸盐提取物进行科学研究，他发现该褐藻酸的提取物具有浓缩溶液、形成凝胶和成膜的能力。现广泛应用于食品、医药、纺织、印染、造纸、日用化工等产品加工中，作为增稠剂、乳化剂、稳定剂、粘合剂、上浆剂等使用。自20世纪80年代以来，褐藻酸钠在食品应用方面得到新的拓展，被广泛应用于食品工业，美国人称之为“奇妙食品添加剂”，日本人誉之为“长寿食品添加剂”。在人造仿型食品加工中，海藻酸钠是海藻蜇皮、海藻蜇丝、人造葡萄、人造樱桃的主要原料；在冷食品加工中，海藻酸钠作为冰淇淋、大雪糕的稳定剂，其组织致密，溶解速度缓慢，也是爽口凉粉、果冻的主要原料；在糕点食品加工中，海藻酸钠作为点心稳定成型剂(饼干、面包、挂面、巧克力等)和面包上光剂，使饼干等香脆而不易破碎，使面条滑韧，减少面条的折断和面包的破碎；海藻酸钠是果酱、辣酱、果子冻、番茄酱、鱼糕、布丁、色拉调味汁的良好增稠剂；海藻酸钠可做啤酒稳定剂和酒的澄清剂；在冷藏保鲜中，在水果、鱼肉等食品上涂上一层海藻酸钠薄膜，与空气不直接接触，可阻止细菌侵入，抑制食品本身的水分蒸发，延长贮藏时间。褐藻酸钠不仅是一种安全的食品添加剂，而且可作为仿生食品或疗效食品的基材，可减缓脂肪糖和胆盐的吸收，具有降低血清胆固醇、血中甘油三酯和血糖的作用，可预防高血压、糖尿病、肥胖症等疾病，在肠道中还能抑制有害金属如锶、镉、铅等在体内的积累。另外，牛肉膏是用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。牛肉膏中含有肌酸、肌酸酐、多肽、氨基酸、核苷酸、有机酸、无机盐及维生素等物质。该产品广泛应用于生物制药发酵及各种培养基的制备，其主要作用是补充氮源、碳源、生长因子等营养物质。而酵母膏（酵母浸膏）是采用新鲜酵母为原料，经酵母酶解自溶、分离过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有酵母自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色至浅棕色，较澄清。酵母浸膏富含蛋白质、氨基酸类、肽类、核苷酸、B族维生素、微量元素等。在培养微生物方面的主要作用是补充氮源和提供微生物生长所需的氨基酸及各种维生素等生长因子，一般用量为0.2%2.0%。在医药制品、生物工程、科研、卫生防疫、细菌检验等方面应用十分广泛，效果显著。在工业化生产中，广泛应用于生物发酵菌种必不可少的菌种培养基，可大大提高菌种的生存率和繁殖率，从而提高产品的质量档次和收得率。2、添加蛋白酶的洗衣粉不能洗涤毛丝织物，而添加纤维素酶的洗衣粉为何能洗涤棉织品？蛋白质类纤维（羊毛、蚕丝等）织物不能使用添加碱性蛋白酶的洗衣粉进行洗涤，因为碱性蛋白酶能水解蛋白质，使羊毛、蚕丝等纤维受到破坏。但是纤维素酶却能使织物增艳出新，这是为什么呢？成熟棉纤维的主要成分是纤维素，纤维素是天然高分子化合物，由葡萄糖分子按-1，4糖苷键连接而成。棉纤维中大分子的排列比较复杂，纤维内某些区域由于大分子的横向吸引使大分子排列比较整齐密实，缝隙孔洞较少，这称为结晶区。相反，另一些区域大分子排列比较紊乱，堆砌比较疏松，其中有较多的缝隙孔洞，密度较低，这称为非结晶区或无定形区。因此，在一根棉纤维中，同时存在着结晶区和无定形区，棉纤维的结晶度约为70%，即棉纤维内大约有30%的无定形区。纤维素酶包括内切酶（Cx酶）、外切酶（C1酶）和葡萄糖苷酶。内切酶作用于无定形的纤维素区域，使纤维素断裂成片断；外切酶又叫纤维二糖水解酶，它作用于纤维素的结晶区或小片段纤维素，从糖链末端开始切掉两个葡萄糖分子，产生纤维二糖；葡萄糖苷酶则将纤维二糖分解成葡萄糖。20世纪80年代，日本的一家公司首先推出含有碱性纤维素酶制剂的洗衣粉。碱性纤维素酶本身不能去除衣物上的污垢，它的作用主要是去除棉纺织品表面的浮毛以及表面附着的沉积性顽渍，同时可以使纤维的结构变得蓬松，从而使渗入到纤维深处的尘土和污垢能够与洗衣粉充分接触，从而达到更好的去污效果。因此使用含有碱性纤维素酶制剂的洗衣粉可以使洗涤后的棉纺织品增艳出新、柔软蓬松，织纹清晰，色泽更加鲜艳，穿着更加舒适。当然过量、超时、反复使用含有碱性纤维素酶制剂的洗衣粉，也会损伤棉麻等天然纤维织物。3、“DNA的粗提取与鉴定”实验中预冷酒精的作用是什么？在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，若提取的DNA量少、杂质多，就会出现实验现象不明显的结果。为了使本实验取得良好效果，可以通过多种方法对DNA进行纯化。利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的不同，通过调节NaCl溶液浓度去除杂质，因为2mol/LNaCl溶液可溶解DNA，但可除去在高盐溶液中不溶的杂质，0.14mol/LNaCl溶液可析出DNA，但能除去溶解于低盐溶液中的杂质。在滤液中加入嫩肉粉可以分解杂质蛋白，因为嫩肉粉中含有木瓜蛋白酶能够催化水解蛋白质。将滤液放在6075的恒温水浴箱中保温而使杂质蛋白变性，因为大多数蛋白质不能忍受6080的高温，而DNA在80以上才会变性。而将处理后的滤液加入与滤液体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%）的作用主要有四：一是利用低温抑制核酸水解酶的活性，防止DNA的降解；二是低温条件下降低分子运动，易于DNA沉淀析出而形成白色丝状物；三是低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少丝状物的断裂；四是利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，将DNA与杂质蛋白进一步分离，因为DNA不溶于酒精而某些蛋白质则溶于酒精。因此加入预冷的酒精后悬浮于溶液中的DNA相对杂质较少而析出的DNA丝状物则较多。4、DNA含量的计算公式中数字“50”是什么意思？教材中DNA含量的计算公式为：DNA含量（mg/mL）=50（260 nm的读数）稀释倍数，这涉及到DNA含量的测定方法。分光光度法是测定物质浓度的常用方法，DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强的吸收能力，因而在260nm处具有一个强烈的吸收峰；蛋白质中含有的色氨酸和酪氨酸在280nm波段有一强烈的吸收峰，利用上述特点可以测定物质含量。教材的公式中“50”的含义是：在标准厚度为1 cm的比色杯中，OD260（OD是光密度optical delnsity的缩写）为1相当于50 mg/mL的dsDNA（双链DNA），40 mg/mL的RNA，37 mg/mL的ssDNA（单链DNA）以及30 mg/mL的寡核苷酸，因此若是测定RNA的含量，50应该换为40，其他物质以此类推。当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280，计算其比值可以来衡量样品的纯度。实验室中纯DNA的OD260/OD2801.8(OD260/OD2801.9,表明有RNA污染；OD260/OD2801.6，表明有蛋白质、酚等污染） ，纯RNA的OD260/OD280约为1.7 2.0（OD260/OD2801.7时表明有蛋白质或酚污染；OD260/OD2802.0时表明可能有异硫氰酸残存）。5、什么叫PCR反应体系？多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板快速复制出上百万份的DNA拷贝，而这一过程的发生和完成需要一系列的物质条件，这些物质条件共同组成了PCR反应体系。PCR反应体系主要由缓冲液、模板、dNTP，耐热DNA聚合酶、引物及其特定的反应条件。与细胞内DNA复制相比，PCR反应体系中没有解旋酶，而是通过9095的高温使DNA变性解链；PCR反应体系中也没有添加ATP，是由dNTP释放外侧的两个磷酸基团而提供能量；PCR反应体系中的引物不是RNA片段，而通常为一段特定的DNA单链；PCR反应体系中的DNA聚合酶不是常见的普通DNA聚合酶，而是热稳定性很强的耐热DNA聚合酶。缓冲液除了提供一定的pH缓冲能力外，还有一些有助于反应进行的成分。PCR反应缓冲液通常采用10mmol/L的Tris-HCl（pH8.39.0，室温）缓冲液体系，它是两性离子缓冲剂，其中含有可激活DNA聚合酶活性中心的Mg2, Mg2浓度高低还可显著影响PCR扩增产物的特异性。此外，缓冲液中还含有50mmol/L的K,有利于引物与模板的退火。有些缓冲液中还加入明胶或血清蛋白（100g/mL）及去污剂（如Tween20等），对Taq DNA聚合酶起稳定作用。模板中含有待扩增的DNA，其数量直接影响扩增效果。对于一般PCR扩增，104107个模板分子可以达到满意的效果。除了模板数量外，模板的纯度也非常重要，不能有其他DNA、太多的蛋白质的污染，特别是其他DNA的污染，即使是痕量DNA，也会导致非特异性产物的产生。dNTP（脱氧核苷三磷酸）为dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物。dNTP溶于pH为7.0的NaOH贮存液中，最初的贮存液可稀释到10mol/L，分装后存放在-20冰箱保存中。dNTP的4种脱氧核苷三磷酸必须等浓度配合以减少错配误差，使用浓度在20200 mol/L之间，浓度过低则反应速率降低，浓度过高则特异性下降，因为dNTP能络合溶液中的Mg2，从而产生错配或抑制TaqDNA聚合酶的活性。利用PCR技术扩增时，脱氧核苷酸不直接作为反应底物，而是dNTP作为反应底物，在聚合酶作用下dNTP分解释放出外侧的两个磷酸基团，同时提供能量，真正直接参与DNA结构组成的还是脱氧核苷酸。耐热DNA聚合酶必须在90以上的高温下仍具有活性，因为PCR反应的变性、复性和延伸温度条件分别约为9095、5560、7075，正是由于耐热DNA聚合酶的应用才使PCR技术得以实现和应用，而且只需一次性加入反应体系中，不必每次高温变性后再添加酶。目前使用的耐高温DNA聚合酶主要有Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和Pwo DNA聚合酶等。引物是指在PCR反应中与待扩增的靶DNA区段两翼互补的寡聚核苷酸，其本质是单链DNA片段。PCR扩增产物的大小及扩增的靶序列在基因组中的位置是由引物限定的，因此引物的选择具有决定性意义。引物长短与PCR反应特异性高低有关，一般来说，引物长的，特异性高，一般设计的引物由2030个核苷酸组成。引物设计时不仅要考虑引物的长度，而且还要考虑引物中碱基GC的含量、引物对之间不能发生互补等多种因素，引物设计可以借助一些计算机引物设计软件进行。6、什么是变性胶？SDS的作用是什么？聚丙烯酰胺凝胶电泳是常用的一种电泳方法，而聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率取决于蛋白质所带净电荷的多少以及分子的大小等因素，为了消除净电荷对迁移速率的影响，可以在聚丙烯酰胺凝胶中加入SDS（sodium dodecyl sulfate，十二烷基磺酸钠）、DTT（dithiothreitol，二硫苏糖醇）或尿素而使之成为变性胶。所谓变性胶是指在聚丙烯酰胺凝胶中加入SDS、DTT或尿素而制成的凝胶。SDS是一种阴离子表面活性剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象，特别是在强还原剂DTT等存在的情况下，蛋白质分子内的二硫键被还原，这就保证了蛋白质分子与SDS的充分结合从而形成带负电的蛋白质-SDS复合物。蛋白质分子与SDS充分结合后，所带的SDS的负电荷远远大于蛋白质本身的电荷量，因而消除了不同种类蛋白质分子间的电荷差异对电泳迁移速率的影响。此外，蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状类似椭圆长棒状，不同的蛋白质-SDS复合物的椭圆棒短轴长度是相近的，只是长轴长度随蛋白质分子量的大小而成正比变化。这样，蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移速率就不再受蛋白质分子形状和所带净电荷的影响，此时蛋白质电泳迁移速率主要取决于蛋白质的分子量。但是由于SDS能使蛋白质完全变性，特别是由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS-PAGE变性胶（即添加SDS的聚丙烯酰胺凝胶）不仅可以用于检测蛋白质分子量、分离蛋白质和亚基组分，而且还能使DNA和RNA变性，从而准确分离DNA和RNA。如果在聚丙烯酰胺凝胶中没有加入SDS、DTT或尿素等变性试剂而制成的凝胶属于非变性胶。非变性胶中蛋白质迁移的速率不仅取决于蛋白质的大小，还包括其电荷量和分子形状。此种电泳方法对pH的变化较敏感，因为pH影响蛋白质所带的净电荷。目前常用的且唯一一种能够连续分离数千种蛋白质的方法是双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2D-PAGE），该技术由任意两个单向聚丙烯酰胺电泳组合而成，在第一向电泳后再在与第一向垂直的方向进行第二向电泳。第一向大多为等点聚焦（isoelectric focusing，IEF），将蛋白质沿pH梯度分离至各自等电点，通过电荷分离蛋白质；第二向为SDS-PAGE，通过分子量分离蛋白质，这样所得蛋白质二维排列图中每个点代表样品中一个或数个蛋白质。该技术具有很高的分辨率和精确度，已经成为蛋白质组研究中的核心技术之一。