滩羊FTO基因编码区克隆、分子特征及表达模式.pdf

克隆滩羊脂肪肥胖相关基因的编码区序列，采用生物学软件和在线预测工具对 基因进行分子特征分析，通过实时荧光定量 检测 基因 在滩羊各组织以及不同绵羊群体背最长肌中的表达水平，为研究 基因在滩羊及其杂交后代的生产性能以及新品种选育提供参考数据。结果表明：滩羊 基因 全长 ，编码 个氨基酸，存在 个错义突变，导致缬氨酸突变为蛋氨酸；滩羊 蛋白为亲水性蛋白，不存在跨膜结构，在第 氨基酸残基处具有信号肽；构建的系统发育进化树显示，滩羊与山羊的亲缘关系最为接近。基因 在滩羊背最长肌中的表达水平最低，在不同绵羊群体背最长肌中的表达水平存在显著差异，表达水平表现为：杜泊羊杜滩寒杂交一开放科学（资源服务）标识码（）代滩羊小尾寒羊；肉用绵羊（杜泊羊）基因 的表达水平相对高于其他非肉用品种。关键词：基因；滩羊；脂肪沉积；组织表达中图分类号：文献标识码：文章编号：（）：（），（，）：（），（），：；脂肪肥胖相关基因（，）是一种蛋白质编码基因，编码的蛋白是酮戊二酸依赖的核酸脱甲基酶。全基因组关联研究表明，基因与机体体重指数和肥胖相关，机体内 基因表达水平上调会导致儿童肥胖和严重的成人肥胖。基因缺失或部分功能丧失会导致小鼠严重的生长迟缓、脂肪减少以及大脑尺寸和体重下降，过表达则会导致小鼠脂肪和体重增加。据报道，基因沉默处理会抑制猪肌内脂肪细胞的增殖和分化，而 基因过表达可显著促进细胞增殖与脂质沉积。基因功能的发挥可能主要依赖于 和 信号通路调节脂肪沉积，。此外，基因还与动物采食行为和机体代谢有关，如 基因可以通过调节机体的饱腹感和瘦素水平来调节食欲，进而影响能量代谢。福建农林大学学报（自然科学版）第 卷 第 期 （）年 月滩羊以生产特征鲜明的二毛裘皮著称，同时肉质优良、肉膻味小、肌纤维细、风味独特，但相比于其他肉用品种，滩羊产肉量低，肌内脂肪含量低，从而影响其整体经济效益。截至目前还没有有关滩羊杂交后代 基因遗传多态性的报道。据此，本研究基于前期对 个绵羊群体肉用性能及肉质特性的比较，以宁夏本地滩羊为研究对象，利用 技术克隆 基因编码区序列（，），并使用生物学软件和在线预测工具进行分子特征分析，通过实时荧光定量 检测 基因 在滩羊不同组织以及不同绵羊群体（滩羊、小尾寒羊、杜泊羊、杜滩寒杂交一代）背最长肌中的表达水平。为了进一步探究滩羊肉质特征，提高滩羊产肉量，从遗传学角度开展滩羊 基因分析，有助于后续滩羊新品种（系）的选育。材料与方法 试验动物及样品采集 个群体的试验用羊均选自宁夏某肉羊繁育场，每个群体选取的 只公羊均在 月龄时被屠宰。屠宰后采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌等组织。采集的组织样品置于液氮中并带回实验室，下放置备用。方法 引物的设计与合成 参考其他近缘物种 基因引物信息设计 基因 区特异性引物并进行 扩增。参考 数据库中的绵羊 基因序列，利用 软件设计实时荧光定量 引物，引物序列如表 所示。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。表 滩羊 基因引物扩增信息 引物类别或名称引物序列上游引物下游引物产物长度 退火温度 扩增引物 实时荧光定量 引物 基因 区的克隆与测序以滩羊背最长肌组织 为模板进行 扩增。反应体系：含 模板，上、下游引物各 ，加水至 。反应程序：预变性；变性 ，退火 ，扩增 个循环；延伸 。产物用 琼脂糖凝胶电泳检测，特异性好的扩增产物使用 纯化回收试剂盒回收后送公司测序。滩羊 基因分子特征分析 滩羊 基因的分子特征采用在线软件（表）进行分析；系统发育进化树使用 软件进行构建。基因表达特征的检测采用实时荧光定量 检测 基因 在滩羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌中以及不同绵羊群体背最长肌中的相对表达量。严格按照 试剂盒说明书的步骤进行操作，用 试剂盒进行实时荧光定量 检测。每个样品重复测定 次。使用 法计算相对表达量，使用 软件进行数据统计，使用 软件进行差异显著性分析。当 时，认为差异显著；当 时，认为差异极显著。结果与分析 滩羊 基因 区的克隆与测序利用提取的滩羊肌肉组织总 进行 扩增，扩增产物用 琼脂糖凝胶电泳检测，获得了与预期长度一致的条带（图）。扩增产物使用 纯化回收试剂盒回收后送公司测序，得到滩羊 基福建农林大学学报（自然科学版）第 卷因 区的扩增片段。结果（图）表明，滩羊 基因 长 ，编码 个氨基酸。表 滩羊 基因分子特征分析软件信息 软件名称用途网址理化性质分析：多序列比对：磷酸化位点预测：疏水性预测：跨膜结构预测：亚细胞定位：信号肽预测：蛋白质二级结构预测：？蛋白质三级结构预测：蛋白质互作分析：心脏；：肝脏；：脾脏；：肺脏；：肾脏；：滩羊；：小尾寒羊；：杜滩寒杂交一代；：杜泊羊。图 滩羊不同组织及不同绵羊群体背最长肌 基因 扩增电泳图谱 滩羊 基因的分子特征 理 化 性 质 在 线 软 件 分 析 显 示，滩 羊 基 因 编 码 氨 基 酸 的 分 子 式 为，相对分子质量为 ，正电荷残基（赖氨酸、精氨酸）总数为 个，负电荷残基（天冬氨酸、谷氨酸）总数为 个，不稳定系数为，脂肪系数为，总平均疏水性为。推测该蛋白为亲水性蛋白。核苷酸序列同源性比对和系统进化关系 与绵羊参考基因序列（）进行比对发现，滩羊 基因 区存在两处碱基突变，第 处的 突变为，为同义突变；第 处的 突变为，为错义突变，导致第 位缬氨酸突变为蛋氨酸。同时与 数据库中 个物种相应的核苷酸序列进行同源性比对，发现滩羊 基因与黑猩猩、长江海豚、双峰驼、猪、人、羊驼、野牛、山羊、牛的同源性分别为、（图）；而在亲缘关系远近方面，滩羊 基因在各物种间具有较高的保守性，与山羊的亲缘关系最近（图）。磷酸化位点、亚细胞定位和蛋白质跨膜结构 采用 在线软件预测磷酸化位点的结果显示：蛋白有 个丝氨酸、个苏氨酸、个酪氨酸可能成为蛋白激酶磷酸化位点（附件图，扫 码可见），表明滩羊 蛋白能催化磷酸基团从磷酸供体转移到受体蛋白的酶。亚细胞定位表明，滩羊 基因主要分布在线粒体、细胞质和细胞核中，分别占、。将标分值大于 定义为是可能性较高的跨膜结构域，则蛋白质跨膜结构预测结果显示滩羊 蛋白不存在跨膜结构。第 期马应等：滩羊 基因编码区克隆、分子特征及表达模式图 滩羊 基因 全长序列及对应的氨基酸序列 图 不同物种 基因核苷酸序列同源性比对（）和构建的系统发育进化树（）（）（）疏水性和信号肽 利用 在线软件对 基因编码的氨基酸进行疏水性预测。疏水性正值越大表示蛋白质疏水性越强，负值越大表示蛋白质亲水性越强，介于 的主要为两性氨基酸（附件图，扫 码可见）。其中，疏水性最大值为，最小值为，平均值为，推断 基因编码的蛋白可能为亲水性蛋白。这与氨基酸理化性质预测的结果相一致。使用 在线软件对蛋白质信号肽进行预测，发现 蛋白属于分泌蛋白，编码产物 值为，值为，值为，推断滩羊 蛋白在第 氨基酸残基处具有信号肽（附件图，扫 码可见）。蛋白质二级结构和三级结构 基于蛋白质数据库，采用在线软件 对滩羊 基因编码蛋白的二级结构进行预测。结果（附件图，扫 码可见）显示，该蛋白质二级结构中的 螺旋占，无规则卷曲占，延伸链占，转角占。由此推测，螺旋是滩羊 基因最大的二级结构元件，无规则卷曲、转角和延伸链散布于其中。采用 平台对滩羊 蛋白的三级结构进行预测。结果（附件图，扫 码可见）显示，蛋白以 螺旋和无规则卷曲为主。蛋白质的相互作用利用 交互式数据库构建滩羊 蛋白互作网络（条件限制在 个蛋白质内）。结果显示，蛋白可能与甲基转移酶样蛋白（，）、细福建农林大学学报（自然科学版）第 卷胞周期依赖性蛋白激酶 调控相关蛋白 类似物（，）、易洛魁家族（，）、胰岛素样生长因子（，）、瘦素基因（，）、黑素细胞皮质激素受体（，）等存在相互作用（附件图，扫 码可见）。如：基因的缺乏可以导致棕色脂肪组织线粒体功能受损；小鼠出生后 基因是控制棕色脂肪组织和能量平衡的重要调节因子；内含子区域的超级增强子调控 基因的表达，表达水平的变化通过改变食物摄入量及能量消耗来影响机体的脂肪沉积；在牛肌肉和脂肪组织中 基因 的表达水平与日增重呈正相关，而肝脏组织中 基因 的表达水平与日增重呈负相关。基因表达的差异采用实时荧光定量 检测 基因 在滩羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌 个组织中及在不同绵羊群体（滩羊、杜泊羊、小尾寒羊、杜滩寒杂交一代）中的表达水平。结果（图）显示，以滩羊心脏为对照，基因 的表达在肝脏中最为丰富，在背最长肌中的表达水平最低，肝脏中的表达水平显著高于其他 个组织。图 显示，基因 在杜泊羊背最长肌中的表达水平最高，杜滩寒杂交一代次之，随后是滩羊和小尾寒羊。表明 基因 在杜滩寒杂交一代的表达水平升高。图柱上标注不同字母表示差异显著（），标注相同字母表示差异不显著（）。图 滩羊不同组织（）及不同绵羊群体背最长肌（）基因 的表达水平 （）（）讨论本课题组前期研究表明，基因 位点的 突变与杜泊羊、滩寒杂交一代群体体重呈显著正相关。研究指出，黔北麻羊 基因、多态位点与不同基因型血清天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶含量存在显著差异。表明 基因多态性与机体的生长发育和脂肪沉积存在密切关联。本研究将滩羊核苷酸序列与参考序列进行比对发现，滩羊 基因第 位点的 突变，导致缬氨酸突变为蛋氨酸，但鉴于样本量较小，这一结果需要进一步扩大样本量进行核实。研究表明，基因 位点的 突变，会破坏富含 的交互域（，）抑制基因的保守序列，导致 基因远端的两个基因 和 过表达，使脂肪细胞从棕色脂肪细胞转变为白色脂肪细胞，从而引起脂质存储增加及线粒体产热降低。研究表明：基因通过调节机体肝细胞中 甲基腺嘌呤（）的水平影响线粒体含量和脂肪代谢；同时，基因表达的下调会抑制线粒体的能量产生，使线粒体质量和线粒体 含量降低。表明 基因在线粒体和细胞质上均发挥着重要的生物学功能，也提示 基因可能通过调节线粒体功能并参与机体能量代谢和脂肪沉积过程。多项研究指出 基因在不同动物中的表达有相似也有不同。如：基因在人、小鼠和大鼠下丘脑中的表达水平明显增加，能够调节食欲、能量代谢和记忆水平，；基因在山羊不同组织中均能表达，在皮下脂肪、脾脏和肺脏中的表达水平最高，而在背最长肌中的表达水平最低；基因在猪皮下脂肪组织中的高表达可显著促进脂质沉积；基因在肉鸡肝脏中的表达水平最高，在蛋鸡下丘脑和 第 期马应等：滩羊 基因编码区克隆、分子特征及表达模式小脑中的表达水平相对较高。此外，基因在不同月龄黔北麻羊中的表达水平也具有差异性，在、和 月龄这 个生长阶段，基因 分别在下丘脑、肝脏和脾脏中的表达水平最高，在背最长肌中的表达水平最低；周龄肉仔鸡与成年肉鸡相比，基因在成年肉鸡肝脏和内脏脂肪中的表达水平较高。本研究结果表明，基因在滩羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌中均有表达，且表达水平存在差异，其在肝脏中的表达水平最高，在背最长肌中的表达水平最低。为了进一步明确 基因在不同绵羊群体间的表达差异，本研究对不同群体背最长肌 基因的表达水平进行定量分析，发现该基因在不同群体背最长肌的表达水平存在差异，表明 基因的表达具有种间特异性。基因在杜泊羊中的表达水平最高，杜滩寒杂交一代次之，随后是滩羊和小尾寒羊，也提示该基因在不同组织和物种中可能发挥着不同的生物学功能。本研究中，经软件预测 蛋白可能与、和 基因相互作用并参与脂代谢。基因表达水平的增大与脂肪细胞的褐变呈正相关，基因的敲除可以降低解偶联蛋白 的表达，并影响机体棕色脂肪细胞的增殖和分化；高脂饮食后 基因的缺乏可上调 基因的表达水平；基因与 基因启动子区具有很强的相关性；基因的多态性可以调控大脑中 基因的表达水平。基因表达水平的上调会提高肥胖儿童脂肪细胞 基因的表达水平；而 基因通过激活 信号通路负调控脂肪细胞分化，该基因的缺乏可导致小鼠棕色脂肪组织线粒体功能受损。上述研究结果表明，基因可能与、基因共同调节机体的生长发育和脂肪沉积。因此后续有待于进一步研究、基因在滩羊群体的表达机制，为阐明 基因与、基因在滩羊群体中的表达关系提供参考。结论滩羊 基因存在 个错义突变，导致缬氨酸突变为蛋氨酸，基因的表达模式除了与组织特征有关外，也与品种或群体特征相关。肉用绵羊（杜泊羊）基因的表达水平相对高于其他非肉用品种（或群体）。参考文献 ，：，（）：，（），（）：，：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（），（）：福建农林大学学报（自然科学版）第 卷 ，（）：李昊，葛翠翠，冯帆，等脂肪酸在育肥滩羊、小尾寒羊及滩寒杂交羊肌肉组织中的含量特征食品研究与开发，（）：张稳，李新海，张天闻，等宁夏地区 个绵羊群体肉用性能及肉质特性比较分析西北农业学报，（）：林亚秋，廖红海，贺庆华，等山羊 基因克隆及其表达谱畜牧兽医学报，（）：，（）：，（）：，：，：康晓龙，张莉莉，王昊升，等 基因多态性及其与 个绵羊群体生长性状的相关性西南农业学报，（）：翁吉梅黔北麻羊 基因多态性及其表达与肉质性状的关联性研究贵阳：贵州大学，（）：，（）：庄英粮 对成年小鼠海马神经发生的调控作用及分子机制研究杭州：浙江大学，：，：，（）：，：，：，：，？，（）：（责任编辑：施晓棠）第 期马应等：滩羊 基因编码区克隆、分子特征及表达模式