真核生物基因表达调控.ppt

,Click to edit Master title style,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Chapter7.,基因的表达与调控 -真核基因表达调控模式,1,本章所讲述内容：1、真核生物的基因结构与转录活性；2、真核基因的转录水平调控；3、反式作用因子的调控作用；4、真核基因转录调控的主要模式；5、其他水平的基因调控；本节课所讲述内容：真核生物的基因结构与转录活性:,1、简述真核生物基因表达调控总论；2、真核基因组的一般构造特点；,3、,基因的典型结构及特点；4、真核生物,DNA,水平上的基因表达调控;5、,DNA,甲基化与基因活性的调控;,2,真核生物和原核生物由于基本生活方式不同所决定基因表达调控上的巨大差别。,原核生物,的调控系统就是要在一个特定的环境中为细胞创造高速生长的条件，或使细胞在受到损伤时，尽快得到修复，所以，原核生物基因表达的开关经常是通过控制转录的起始来调节的。,真核生物,（除酵母、藻类和原生动物等单细胞类之外）主要由多细胞组成，每个真核细胞所携带的基因数量及总基因组中蕴藏的遗传信息量都大大高于原核生物。人类细胞单倍体基因组就包含有310,9,bp,总,DNA，,约为大肠杆菌总,DNA,的1000倍，是噬菌体总,DNA,的10万倍左右！,3,真核基因表达调控的最显著特征是能在,特定时间和特定的细胞中,激活特定的基因，从而实现预定的、有序的、不可逆转的分化、发育过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常功能。,4,真核生物基因调控，根据其性质可分为两大类,：,第一类是,瞬时调控,或称可逆性调控，它相当于原核细胞对环境条件变化所做出的反应，包括某种,底物或激素水平升降,及,细胞周期不同阶段中酶活性和浓度,的调节。,第二类是,发育调控,或称不可逆调控，是,真核基因调控的精髓,部分，它决定了真核细胞生长、分化、发育的全部进程。,5,在真核生物中基因表达的调节其特点是:,（1）多层次;,（2）无操纵子和衰减子;,（3）个体发育复杂;,（4）受环境影响较小;,6,研究基因调控主要应回答3个问题：,什么是诱发基因转录的信号？,基因调控主要是在哪一步（模板,DNA,的转录、,mRNA,的成熟或蛋白质合成）实现的？,不同水平基因调控的分子机制是什么？,7,真核基因组的一般构造特点,在真核细胞中，一条成熟的,mRNA,链只能翻译出一条多肽链，不存在原核生物中常见的多基因操纵子形式。,真核细胞,DNA,都与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分,DNA,是裸露的。,高等真核细胞,DNA,中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。,真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行,DNA,片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。,8,在真核生物中，基因转录的调节区相对较大，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对，这些调节区一般通过改变整个所控制基因5上游区,DNA,构型来影响它与,RNA,聚合酶的结合能力。,在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于启动子上游不远处，调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑制,RNA,聚合酶与它的结合。,9,真核生物的,RNA,在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严格的空间间隔。,许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程（,maturation and splicing,），,才能顺利地翻译成蛋白质。,10,7.1.1 基因的典型结构及特点,(1)染色体结构复杂,由,DNA、,组蛋白、非组蛋白等大分子组成。,其基本结构物质是,DNA,和组蛋白。,核小体,是染色质的基本单位。,真核染色体上三要素：,DNA,复制起始点、着丝点(,centromere),和端粒(,telomere)。,目前通用的,酵母人工染色体(,YAC),以及正在研制的,哺乳动物细胞人工染色体(,MAC,),就是以此为基础,再加自主复制序列(,ARS)、,选择标记和插入位点组建的。,11,(2),DNA,顺序重复,轻度、中度、高度重复序列三种：,轻度重复序列：,单拷贝基因；一个基因组中有一个或几个拷贝的序列；例如结构基因基本上属于不重复序列，如蛋清蛋白、蚕的丝心蛋白等。,中度重复序列：,l0,个至几百个拷贝的序列;各种,rRNA、tRNA,及某些结构蛋白基因（如组蛋白基因）。,高度重复序列：,从几百到几百万个，通常说的卫星,DNA,就属于高度重复序列。,重复序列的存在是真核生物,DNA,区别于原核生物,DNA,的一个重要特征。,12,(3)基因不连续性(,interrupted gene),基因的编码序列在,DNA,分子上是不连续的，为不编码的序列所隔开。,不连续基因是通过,mRNA,和,DNA,杂交试验发现的。,外显子(,exon),：,编码序列,内含子(,intron),：,非编码序列,外显子和内含子的概念与是否编码氨基酸的概念并不相对应。,从不连续基因到成熟,mRNA,之间存在着一个基因转录的中间体,叫做初级转录物，叫做,不均一核,RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA),这个基因的初级转录物既含有外显子又含有内合子序列，,从不均一核,RNA,到成熟,mRNA,要经过一转录后的加工拼接过程。,真核生物基因的不连续性和转录后加工是真核基因有别于原核基因的又一重要特征。,13,在真核生物中也有些基因是不含内含子的，如组蛋白基因及,型、,型干扰素基因、大多数酵母蛋白基因等。,在一个结构基因中，编码某一蛋白质不同区域的各个外显子并不连续排列在一起，而常常被长度不等的内含子所隔离，形成镶嵌排列的断裂方式。所以，真核基因有时被称为,断裂基因(,interrupted gene,),。,目前尚不清楚内含子的生理功能。研究发现，只有真核生物具有切除基因中内含子，产生功能型,mRNA,和,蛋白质的能力，原核生物一般不具有这种本领。,如果要在原核细胞里表达真核基因，必须首先构建切除内含子的重组基因，才有可能得到所研究的蛋白质。,14,15,(4)存在许多基因家族(,gene family),来源相同、结构相似、功能相关的基因组成为单一的,基因簇或称基因家族。,同一家族中的成员有时紧密地排列在一起，成为一个基因簇；更多的时候，它们却分散在同一染色体的不同部位，甚至位于不同的染色体上，具有各自不同的表达调控模式。,16,简单多基因家族,简单多基因家族中的基因一般以串联方式前后相连。在大肠杆菌中，,16,S，23S,和5,S rRNA,基因联合成一个转录单位，各种,rRNA,分子都是从这个转录单位上剪切下来的。,在真核生物中，,前,rRNA,转录产物的分子量为45,S，,包括18,S，28S,和5.8,S,三个主要,rRNA,分子。前,rRNA,分子中至少有100处被甲基化（主要是核糖的2-,OH,甲基化），原始转录产物也被特异性,RNA,酶切割降解，产生成熟,rRNA,分子。5,S rRNA,作为一个独立的转录单位，由,RNA,聚合酶,III（,而不是聚合酶,I）,完成转录。,17,复杂多基因家族,复杂多基因家族一般由几个相关基因家族构成，基因家族之间由间隔序列隔开，并作为独立的转录单位。现已发现存在不同形式的复杂多基因家族。,海胆的组蛋白基因家族,串联单位中的每一个基因分别被转录成单顺反子,RNA，,这些,RNA,都没有内含子，而且各基因在同一条,DNA,链上按同一方向转录，每个基因的转录与翻译速度都受到调节。,研究还表明，在一个特定的细胞中，并不是所有串联的单位都得到转录。胚胎发育的不同阶段或不同组织中，有不同的串联单位被转录，暗示可能存在具有不同专一性的组蛋白亚类和发育调控机制。,18,(5)存在串联重复基因,其特点是各成员之间有高度的序列一致性甚至完全相同，拷贝数高、非转录的间隔区短而一致。组蛋白基因、,rRNA,基因、,tRNA,基因都是串联重复基因，这些基因的产物在细胞中都是大量需要的。,19,7.1.3,真核生物,DNA,水平上的基因表达调控,分子生物学的最新研究表明，在个体发育过程中，用来合成,RNA,的,DNA,模板也会发生规律性变化，从而控制基因表达和生物体的发育。,高度重复基因的形成通常与个体分化阶段,DNA,的某些变化有关。例如，一个成熟的红细胞能产生大量的可翻译出成熟珠蛋白的,mRNA，,而其前体细胞却不产生珠蛋白。许多情况下，这种变化是由于基因本身或它的拷贝数发生了永久性变化。,这种,DNA,水平,的调控是真核生物发育调控的一种形式，它包括了基因丢失、扩增、重排和移位等方式，通过这些方式可以消除或变换某些基因并改变它们的活性。这些调控方式与转录及翻译水平的调控是不同的，因为它使基因组发生了改变。,20,7.1.3.1“,开放,”,型活性染色质（,active chromatin,）,结构对转录的影响,真核基因的活跃转录是在常染色质上进行的。转录发生之前，染色质常常会在特定的区域被解旋松弛，形成自由,DNA。,这种变化可能包括核小体结构的消除或改变，,DNA,本身局部结构的变化等，这些变化可导致结构基因暴露，促进转录因子与启动区,DNA,的结合，诱发基因转录。,用,DNA,酶,I,处理各种组织的染色质时，发现处于活跃状态的基因比非活跃状态的,DNA,更容易被,DNA,酶,I,所降解。,鸡成红细胞（,erythroblast,）,染色质中，,-,血红蛋白基因比卵清蛋白基因更容易被,DNA,酶,I,切割降解。,鸡输卵管细胞的染色质中被,DNA,酶,I,优先降解的是卵清蛋白基因，而不是,-,血红蛋白基因。,21,存在于,“,灯刷型,”,染色体（,lamp brush,）,上的环形结构可能与基因的活性转录有关。“灯刷型”染色体只有在两栖类动物卵细胞发生减数分裂时才能被观察到，它是染色体充分伸展时的一种形态。高倍电镜下观察发现，灯刷型染色体上存在许多突起的“泡”状或“环”状结构，有时还能看到,RNP,沿着这些突起结构移动，表明这些,DNA,正在被,RNA,聚合酶所转录,。,22,1.基因的扩增,（,amplification）,两栖类和昆虫卵母细胞,rRNA,基因的扩增非洲爪蟾的染色体上有约450拷贝编码18,Sr RNA,和28,S rRNA,的,DNA，,在卵母细胞中它们的拷贝数扩大了1000倍.,一旦卵母细胞成熟，多余的,rDNA,就没有用了，将被逐渐降解。受精之后，染色体,DNA,开始复制，并通过有丝分裂的方式，不断扩大细胞群体。在此期间，多余的,rDNA,继续被降解，直到分裂产生几百个细胞时，,rDNA,的,过剩现象就不复存在了。,7.1.3.2,基因扩增,基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，它使细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要，是基因活性调控的一种方式。,23,7.1.3.3,基因重排,将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。,真核生物,最典型的例子是免疫球蛋白在成熟过程中的重排以及酵母的交配型转变.,24,通过基因重排调节基因活性的典型例子是免疫球蛋白结构基因和,T-,细胞受体基因的表达，前者是由,B,淋巴细胞合成的，而后者则由,T-,淋巴细胞合成。,抗体有100万种以上，一种淋巴细胞只产生一种抗体,25,免疫球蛋白的肽链主要由可变区（,V,区）、恒定区（,C,区）以及两者之间的连接区（,J,区）组成,26,V、C,和,J,基因片段在胚胎细胞中相隔较远。编码产生免疫球蛋白的细胞发育分化时，通过染色体内,DNA,重组把4个相隔较远的基因片段连接在一起，从而产生了具有表达活性的免疫球蛋白基因,。,27,本节课所讲述内容：,真核生物的基因结构与转录活性：1、真核基因表达调控的最显著特征是什么？2、真核生物基因调控根据其性质可分为哪两大类？3、,真核生物中基因表达的调节特点是,什么？4、相对于原核生物，真核基因组的一般构造特点是什么？5、基因的典型结构及特点？6、真核生物,DNA,水平上的基因表达调控：掌握几个概念：开放性活性染色体对基因转录的影响；基因扩增；基因重排；真核基因的转录水平调控；本节课所讲述内容：1、真核生物的基因结构与转录活性:,DNA,甲基化与基因活性的调控;2、真核基因的转录；3、,反式作用因子,28,7.1.4,DNA,甲基化与基因活性的调控,DNA,甲基化是最早发现的修饰途径之一，这一修饰途径可能存在于所有高等生物中并与基因表达调控密切相关。,大量研究表明，,DNA,甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。,DNA,甲基化能引起染色质结构、,DNA,构象、,DNA,稳定性及,DNA,与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。研究证实，,CpG,二核苷酸中胞嘧啶的甲基化导致了人体1/3以上由于碱基转换而引起的遗传病。,DNA,甲基化修饰现象广泛存在于多种有机体中。,实验证明，这个过程不但与,DNA,复制起始及错误修正时的定位有关，还通过改变基因的表达参与细胞的生长、发育过程及染色体印迹、,X,染色体失活等的调控。,29,CpG,岛,（,CpG islands,）是指,DNA,上一个区域，此区域含有大量相联的,胞嘧啶,（,C,）、,鸟嘌呤,（,G,），以及使两者相连的,磷酸酯键,（,p,）。,哺乳类,基因,中的,启动子,上，含有约,40%,的,CpG,岛（人类约,70%,）。一般,CpG,岛的长度约,300,到,3000,个,碱基对,（,bp,）。,常用的正式定义是指一个至少含有,200bp,的区域，其中,GC,所占比例超过,50%,，且,CpG,的观察值,/,预测值比例必须高于,0.6,。,CpG,岛可与基因相连，可用来作为,限制酶,的辨识位置。,30,7.1.4.1,DNA,的甲基化,DNA,甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶（5-,mC）,和少量的,N,6,-,甲基腺嘌呤（,N,6,-mA）,及7-甲基鸟嘌呤（7-,mG）,。,在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在,CpG,序列、,CpXpG、CCA/TGG,和,GATC,中。因为高等生物,CpG,二核苷酸序列中的,C,通常是甲基化的，极易自发脱氨，生成胸腺嘧啶。,由于这些,CpG,二核苷酸通常成串出现在,DNA,上，这段序列往往被称为,CpG,岛。,31,真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性：一种被称为,日常型,甲基转移酶，另一种是,从头合成型,甲基转移酶，前者主要在甲基化母链（模板链）指导,下使处于半甲基化的,DNA,双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化。该酶催化特异性极强，对半甲基化的,DNA,有较高的亲和力，使新生的半甲基化,DNA,迅速甲基化，从而保证,DNA,复制及细胞分裂后甲基化模式不变。后者催化未甲基化的,CpG,成为,mCpG，,它不需要母链,指导，但速度很慢。,32,7.1.4.2,DNA,甲基化抑制基因转录的机理,DNA,甲基化导致某些区域,DNA,构象变化，从而影响了蛋白质与,DNA,的相互作用，抑制了转录因子与启动区,DNA,的结合效率。,研究表明，当组蛋白,H1,与含,CCGG,序列的甲基化或非甲基化,DNA,分别形成复合体时，,DNA,的构型存在着很大的差别，甲基化达到一定程度时会发生从常规的,B-DNA,向,Z-DNA,的过渡。由于,Z-DNA,结构收缩，螺旋加深，使许多蛋白质因子赖以结合的元件缩入大沟而不利于基因转录的起始。,有实验用序列相同但甲基化水平不同的,DNA,为材料，比较其作为,RNA,聚合酶转录模板的活性，发现甲基的引入不利于模板与,RNA,聚,合酶的结合，降低了其体外转录活性。,33,5-甲基胞嘧啶在,DNA,上并不是随机分布的，基因的5 端和3 端往往富含甲基化位点，而启动区,DNA,分子上的甲基化密度与基因转录受抑制的程度密切相关。对于弱启动子来说，稀少的甲基化就能使其完全失去转录活性。当这一类启动子被增强时（带有增强子），即使不去甲基化也可以恢复其转录活性。若进一步提高甲基化密度，即使增强后的启动子仍无转录活性。因为甲基化对转录的抑制强度与,MeCPl（,methyl CpG-binding protein l,）,结合,DNA,的能力成正相关，甲基化,CpG,的密度和启动子强度之间的平衡决定了该启动子是否具有转录活性,。,34,7.1.4.3,DNA,甲基化与,X,染色体失活,X,染色体失活是发育过程中独特的调节机制。,雌性胎生哺乳类动物细胞中两条,X,染色体之一在发育早期随机失活，以确保与只有一条,X,染色体的雄性个体内,X,染色体基因的剂量相同。一旦发生,X,染色体失活，这个信息便能够稳定地传递给子代细胞，使该细胞有丝分裂所产生的后代都保持同一条,X,染色体失活。,35,x,染色体失活或里昂化（,lyonization,）。是指雌性哺乳类细胞中两条,X,染色体的其中之一失去活性的现象，过程中,X,染色体会被包装成异染色质，进而因功能受抑制而沉默化。,里昂化可使雌性不会因为拥有两个,X,染色体而产生两倍的基因产物，因此可以像雄性般只表现一个,X,染色体上的基因。对胎盘类，如老鼠与人类而言，所要去活化的,X,染色体是以随机方式选出；对于有袋类而言，则只有源自父系的才会发生,x,染色体失活。,36,所有老鼠细胞中的父系,X,染色体，都会在胚胎发育早期过程中的双细胞到四细胞阶段，经历因铭印而失去活性的过程。其中属于胚外组织（,extraembryonictissue,，未来的胎盘）中的,X,染色体，将会持续保留,x,染色体失活状态，因此在此部位只有母系,X,染色体具有活性。,而属于内细胞团（,innercellmass,，未来的胚胎）的,X,染色体，将会在囊胚（,blastocyst,）时期再度恢复活性，此时这些部位内的两条染色体皆有作用。之后两条染色体的其中之一，将会独立且随机地失去活性，而且包括此细胞后代的,X,染色体在内，其活性将再也不会恢复。,37,7.2,真核基因的转录,顺式元件：,(1)核心启动子成分，如,TATA,框；,(2）上游启动子成分，如,CAAT,框,GC,框;,（3）远上游顺序：如增强子，酵母的,UAS,（,upstream activator sequences,）,等。,（4）特殊细胞中的启动子成分：如淋巴细胞中的,Oct(,octamer,）,和,B,。,真核基因调控主要也是在转录水平上进行的，受大量特定的顺式作用元件,（,cis-acting element,，,又称顺式作用元件）和反式作用因子（,transacting factor,，,又称跨域作用因子）的调控，,真核生物的转录调控大多数是通过顺式作用元件和反式作用因子复杂的相互作用来实现的。,38,一个完整的基因，不但包括编码区（,coding region,），,还包括5和3端长度不等的特异性序列，它们虽然不编码氨基酸，却在基因表达的过程中起着重要作用。所以，,“基因”的分子生物学定义是：产生一条多肽链或功能,RNA,所必需的全部核苷酸序列,。,39,增强子及其对转录的影响,增强子是指能使和它连锁的基因转录频率明显增加的,DNA,序列。作为基因表达的重要调节元件，增强子通常具有下列性质：,1、增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10-200倍。2、增强效应与其位置和取向无关，不论增强子以什么方向排列（53或35），甚至和基因相距3,kb，,或在基因下游，均表现出增强效应；3、大多为重复序列，一般长约50,bp，,适合与某些蛋白因子结合。其内部常含有一个核心序列：（,G）TGGA/TA/TA/T（G），,是产生增强效应时所必需的；4、增强效应有严密的组织和细胞特异性，说明只有特定的蛋白质（转录因子）参与才能发挥其功能；5、没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应；6、许多增强子还受外部信号的调控，如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应。,Enhancer,Gene,5,3,direction of transcription,Enhancer,Enhancer,40,增强子可能有如下3种作用机制：,影响模板附近的,DNA,双螺旋结构，导致,DNA,双螺旋弯折或在反式因子的参与下，以蛋白质之间的相互作用为媒介形成增强子与启动子之间“成环”连接，活化基因转录；,将模板固定在细胞核内特定位置，如连接在核基质上，有利于,DNA,拓扑异构酶改变,DNA,双螺旋结构的张力，促进,RNA,聚合酶,II,在,DNA,链上的结合和滑动；,增强子区可以作为反式作用因子或,RNA,聚合酶,II,进,入染色质结构的,“,入口,”,。,增强子的作用原理是什么呢？,41,增强子的功能是可以累加的。,SV40,增强子序列可以被分为两半，每一半序列本身作为增强子功能很弱，但合在一起，即使其中间插入一些别的序列，仍然是一个有效的增强子。因此，要使一个增强子失活必须在多个位点上造成突变。对,SV40,增强子而言，没有任何单个的突变可以使其活力降低10倍。,42,真核生物启动子和增强子是由若干,DNA,序列元件组成的，由于它们常与特定的功能基因连锁在一起，因此被称为顺式作用元件。这些序列组成基因转录的调控区，影响基因的表达。在转录调控过程中，除了需要调控区外，还需要反式作用因子,。,一般认为，如果某个蛋白是体外转录系统中起始,RNA,合成所必需的，它就是转录复合物的一部分。根据各个蛋白成分在转录中的作用，能将整个复合物分为3,部分：,反式作用因子,是能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质。,参与所有或某些转录阶段的,RNA,聚合酶亚基，不具有基因特异性。,与转录的起始或终止有关的辅助因子，不具有基因特异性。,与特异调控序列结合的转录因子。它们中有些被认为是转录复合物的一部分，因为所有或大部分基因的启动区都含有这一特异序列。更多的则是基因或启动子特异性结合调控蛋白，它们是起始某个（类）基因转录所必需的。,7.3,反式作用因子,43,反式作用因子可以分为3类；,(1),通用反式作用因子,，主要识别启动子的核心启动成分，如,TBP；,（2）,特殊组织与细胞中的反式作用因子，如淋巴细胞中的,Oct-2；,（3）,和,反应性元件,（,response elenents）,相结合的反式作用因子。,如,HSE,（,热休克反应元件，,heat shock response element），,GRE,（,糖皮质激素反应元件,glucocorticoid response element）；,MRE,（,金属反应元件，,metal response element）；,TRE,（,肿瘤诱导剂反应元件，,tumorgenic agent response element);,44,(一)蛋白质直接和,DNA,结合,螺旋转角螺旋,锌指结构,亮氨基拉链,螺旋环螺旋,同源异形结构域,45,1.,螺旋转角螺旋,（,Helix-turn-helix,HTH）：,最初在,噬菌体的阻遏蛋白中发现的一种,DNA,结合结构域。,在阻遏蛋白氨基端有5段,螺旋，每段螺旋之间折转成一定角度相连接，其中两段负责同,DNA,结合。,螺旋3由9个氨基酸组成，与前面的由7个氨基酸组成的。螺旋2形成一个角度。,螺旋3通过氨基酸侧链同,DNA,碱基之间的氢键同,DNA,序列相结合，所以,螺旋,被称为识别螺旋(,recognition helix)。,螺旋2则是通过氢键同,DNA,的磷酸骨架相接触。这种相互作用对于同,DNA,结合是必需的，但并不控制对靶序列识别的专一性。,46,2.,锌指结构（,zinc fimger,）,是一个蛋白质结构域，由重复的半胱氨酸和组氨酸或重复的半胱氨酸在一个金属锌离子四周形成一个四面体的排列。,长约30个,aa，,其中4个氨基酸（,Cys,或2个,Cys，,两个,His）,与一个,Zinc,原子相结合。与,Zinc,结合后锌指结构较稳定。,47,最初是在爪蟾(,Xenopus laevis),的,RNA,聚合酶,III,转录因子(,TFIIIA),中发现的。9个串联重复的锌指区组成，每个单位大约由30个氨基酸残基组成。,基序因在锌结合位点上突出的氨基酸环的形状如同手指，所以称为,“,指状,”,结构。这种蛋白质结构域是同,DNA,或,RNA,结合的部位。,单个的锌指保守序列是：,Cys-X,2-4,-Cys-X,3,-Phe-X,5,-Leu-X,2,-His-X,2,-His,这里,x2、x5,代表2个和5个任何一种氨基酸残基。根据锌指结构中与锌配位的半胱氨酸(,C),和组氨酸(,H),的数目和位置，可将指状结构分为2类。,型:2,Cys/2His:TF IIIA,SP1,型:2,cys/2cys :GAL4,48,亲脂性（,amphipathic,）,的,螺旋，包含有许多集中在螺旋一边的疏水氨基酸，两条多肽链以此形成二聚体。每隔6个残基出现一个亮氨酸。由赖氨酸（,Lys,）,和精氨酸（,Arg,）,组成,DNA,结合区。,（,Leucine ziipper）,同二聚体,（,honwdimers）,异二聚体,（,hefercdimers）,C-Jun,C-Fos,Myc,3.亮氨酸拉链,49,亮氨酸是疏水性氨基酸，排列在双螺旋的一侧，所有带电荷的氨基酸残基排在另一侧。当2个蛋白质分子平行排列时，亮氨酸之间相互作用形成二聚体，形成,“,拉链,”,。,由于这类蛋白质都以二聚体形式与,DNA,结合，两个蛋白质,螺旋上的亮氨酸一侧是形成拉链型二聚体的基础。然而，亮氨酸拉链区并不能直接结合,DNA，,只有肽链氨基端2030个富含碱性氨基酸结构域与,DNA,结合。,在,“,拉链,”,式的蛋白质分子中，亮氨酸以外带电荷的氨基酸形式同,DNA,结合。,不形成二聚体，该碱性区对,DNA,的亲和力明显降低。所以，这类蛋白质的,DNA,结合结构域实际是以碱性区和亮氨酸拉链结构域整体作为基础的。,50,该调控区长约50个,aa,残基，同时具有,DNA,结合和形成蛋白质二聚体的功能，其主要特点是可形成两个亲脂性,-,螺旋，两个螺旋之间由环状结构相连，其,DNA,结合功能是由一个较短的富碱性氨基酸区所决定的。,在,HLH,中带有碱性区的肽链称为 碱性,HLH（bHLH，protein）。bHLH,又分为两类。,A,类是可以广泛表达的蛋白，包括哺乳动物的,E12/E47（,可和免疫球蛋基因增强子中的元件结合）和果蝇,da,（daughterless,性别控制的总开关基因）的产物；,B,类是组织特异性表达的蛋白，包括哺乳动物的,MyoD(,肌浆蛋白（,myogen）,基因的转录因子,果蝇的,AC-S（achaete-scute,无刚毛基因的产物）,4.,螺旋一环一螺旋（,HLH）,51,DNA,结合蛋白的共同特性：,（1）具有一些与,DNA,结合的螺旋区，,（2）能形成二聚体，,（3）有一个共同的基序。,基序由40,50个氨基酸组成，含有2个两亲的(,amphipathic，,既有极性基也有非极性基)螺旋，由2个长度不等的连接区(环)相连。,通过两条螺旋对应位置上的疏水性氨基酸残基之间的相互作用，可以生成同源二聚体或异源二聚体。每个螺旋区长15一16个氨基酸，其中有几个氨基酸残基是保守的。两个螺旋区之间的环使两个螺旋区可以彼此独立地相互作用。,52,复习上,节课所讲述内容：,1、DNA,甲基化抑制转录的机理;2、,DNA,甲基化与,X,染色体失活；3、,增强子通常具有下列性质；,4、反式作用因子的概念；5、转录激活蛋白结构域与,DNA,结合的几种形式；6、结论：真核生物的转录调控大多数是通过顺式作用元件和反式作用因子复杂的相互作用来实现的；,本节课所讲述内容：1、蛋白质磷酸化、信号转导及基因表达；,2、激素及其影响；3、热激蛋白诱导的基因表达；4、金属硫蛋白基因的多重调控；,53,7.4.1,蛋白质磷酸化、信号转导及基因表达,蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程是生物体内普遍存在的信息传导调节方式，几乎涉及所有的生理及病理过程，如糖代谢、光合作用、细胞的生长发育、神经递质的合成与释放甚至癌变等等。,蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把,ATP,或,GTP,上,位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，,其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。,蛋白质的磷酸化反应是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。,已经发现在人体内有多达,2000,个左右的蛋白质激酶和,1000,个左右的蛋白质磷酸酶基因。,54,细胞表面受体与配体分子的高亲和力特异性结合，能诱导受体蛋白构象变化，使胞外信号顺利通过质膜进入细胞内，或使受体发生寡聚化而被激活。一般情况下，受体分子活化细胞功能的途径有两条：一是受体本身或受体结合蛋白具有内源酪氨酸激酶活性，胞内信号通过酪氨酸激酶途径得到传递；二是配体与细胞表面受体结合，通过,G,蛋白介异的效应系统产生介质，活化丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸激酶，从而传递信号。,55,1,蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用,(1).,在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点。与信号传递有关的蛋白激酶类主要受控于胞内信使，如,cAMP,，,Ca2+,，,DG,（,二酰甘油，,diacyl glycerol,）,等，这种共价修饰调节方式显然比变构调节较少受胞内代谢产物的影响。,(2).,蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的酶,“,活性,”,。与酶的重新合成及分解相比，这种方式能对外界刺激做出更迅速的反应。,(3).,对外界信号具有级联放大作用；,(4).,蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信号的持续反应。,被磷酸化的主要氨基酸残基：,丝氨酸,、,苏氨酸,和,酪氨酸,。,组氨酸,和,赖氨酸,残基也可能被磷酸化。,56,2.,真核细胞主要跨膜信号转导途径,57,58,3.,蛋白激酶的种类与功能,根据底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基的种类可分为三大类：,第一类为丝氨酸,/,苏氨酸型。这类蛋白激酶使底物蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化。,第二类为酪氨酸型。被磷酸化的是底物的酪氨酸残基。,第三类是,“,双重底物特异性蛋白激酶（,dual-specificity protein kinase,），,既可使丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化又可使酪氨酸残基磷酸化。,细胞受刺激以后，通过蛋白质磷酸化及一系列级联放大过程将胞外信号转化为细胞内信号，从而引,起广泛的生理反应。,59,根据是否有调节物来分又可分成两大类：信使依赖性蛋白质激酶（,messenger-dependent protein kinase,），,包括胞内第二信使或调节因子依赖性蛋白激酶及激素（生长因子）依赖性激酶两个亚类；,非信使依赖型蛋白激酶。,60,61,4.,受,cAMP,调控的,A,激酶,被,A,激酶磷酸化的蛋白质其,N,端上游往往存在两个或两个以上碱性氨基酸，特异氨基酸的磷酸化（,X-Arg-Arg-X-Ser-X,）,改变了这一蛋白的酶活性。这一酶活性代表了绝大多数细胞中,cAMP,所引起的全部反应。,PKA,全酶由,4,个亚基组成,(,R,2,C,2,）,包括两个相同的调节亚基（,R,）,和两个相同的催化亚基（,C,）。,全酶的分子量为,150-170,kD,。,62,C,亚基具有催化活性，,R,亚基具有调节功能，有两个,cAMP,结合位点。,R,亚基对,C,亚基具有抑制作用，所以，,R,和,C,聚合后的全酶（,R,2,C,2,）,无催化活性。,R,亚基与,cAMP,的结合导致,C,亚基解离并表现出催化活性。,63,激素与其受体在肌肉细胞外表面相结合，诱发细胞质,cAMP,的合成并活化,A,激酶，再将活化磷酸基团传递给无活性的磷酸化酶激酶，活化糖原磷酸化酶，最终将糖原磷酸化，进入糖酵解并提供,ATP,。,64,5.,C,激酶与,PIP,2,、,IP,3,和,DAG,磷酸肌醇级联放大的细胞内信使是磷脂酰肌醇,-4,，,5-,二磷酸（,PIP,2,）,的两个酶解,产物：肌醇,1,，,4,，,5-,三磷酸（,IP,3,）,和二酰基甘油（,DAG,）。,C,激酶（,PKC,）,是依赖于,Ca,2+,的蛋白质激酶。由于,IP,3,所引起的细胞质,Ca,2+,浓度升高，导致,C,激酶从胞质转运到靠原生质膜内侧处，并被,DAG,和,Ca,2+,的双重影响所激活。,C,激酶的活性也受磷脂酰丝氨酸的影响，原因是后者大大提高了,C,激酶对于,Ca,2+,的亲和力，从而使得,C,激酶能被生理水平的,Ca,2+,离子所活化。,C,激酶主要实施对丝氨酸、苏氨酸的磷酸化，它具有一个催化结构域和一个调节结域。,65,66,6.,CaM,激酶及,MAP,激酶,Ca,2+,的细胞学功能主要通过钙调蛋白激酶（,CaM-kinase,）,来实现，它们也是一类丝氨酸,/,苏氨酸激酶，但仅应答于细胞内,Ca,2+,水平。,MAP,激酶（,mitogen-activated proteinkinase,MAP-kinase,，,又称为,extracellular-signal-regulated kinase,，,ERKS,）,活性受许多外源,细胞生长、分化因子的诱导，也受到酪氨酸蛋白激酶及,G,蛋白受体系统的调控。,MAP-,激酶的活性取决于该蛋白中仅有一个氨基酸之隔的酪氨酸、丝氨酸残基是否都被磷酸化。科学家把能同时催化这两个氨基酸残基磷酸化的酶称为,MAP-,激酶,-,激酶，它的反应底物是,MAP,激酶。,MAP-,激酶,-,激酶本身能被,MAP-,激酶,-,激酶,-,激酶所磷酸化激活，后者能同时被,C,激酶或酪氨酸激酶家族的,Ras,蛋白等激活，从而在信息传导中发挥功能。,67,68,7.,酪氨酸蛋白激酶,对于许多生长因子受体的研究表明，跨膜的酪氨酸蛋白激酶在信息传递过程中起着重要作用。表皮生长因子（,EGF,）、,胰岛素样生长因子（,IGF,）、,成纤维细胞生长因子（,FGF,）、,神经生长因子（,NGF,）、,血小板衍生生长因子（,PDGF,）,和血管内皮细胞生长因子（,VEGF,）,受体都拥有定位于胞内的酪氨酸激酶功能区域和膜外区。,69,具有受体功能的酪氨酸,蛋白激酶,(,receptor protein tyrosine kinase,RPTK),。,包括三个结构域：胞外的配体结合区，细胞内部具有酪氨酸蛋白激酶活性的区域和连接这两个区域的跨膜结构。,70,8.,蛋白质磷酸化与基因表达,处于信号传递链终端的蛋白质磷酸化既能对许多酶蛋白及生理代谢过程起直接的调节作用，又能通过使转录因子磷酸化来调节基因活性。,71,7.4.2,激素及其影响,许多类固醇激素（如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮质激素和雄激素,）以及一般代谢性激素（如胰岛素）的调控作用都是通过启始基因转录而实现的。,靶细胞具有专一的细胞质受体，可与激素形成复合物，导致三维结构甚至化学性质的变化。经修饰的受体与激素复合物通过核膜进入细胞核内，并与染色质的特定区域相结合，导致基因转录的起始或关闭。,研究发现，体内存在的许多糖皮质类激素应答基因都有一段大约20,bp,的顺式作用元件（激素应答元件，简称,HRE,），,该序列具有类似增强子的作用，其活性受激素制约。,靶细胞中含有大量激素受体蛋白，而非靶细胞中没有或很少有这类受体，这是激素调节转录组织特异性的根本原因。,72,所有固醇类激素的受体蛋白分子都有相同的结构框架，包括保守性极高的,、位于分子中央的,DNA,结合区，位于,C,端的有较强同源性的激素结合区和保守性较小的,N,端。该区的具体功能不详，但它的存在保证了转