基于网络药理学和分子对接研究“白花蛇舌草-半枝莲”药对治疗前列腺癌的作用机制.pdf

广东化工2023年 第16期第50卷 总第498期基于网络药理学和分子对接研究“白花基于网络药理学和分子对接研究“白花蛇舌草蛇舌草-半枝莲”药对治疗前列腺癌的作用机制半枝莲”药对治疗前列腺癌的作用机制白娟，洪术霞*(西安国际医学中心医院药学部，陕西 西安710100)摘要目的：通过网络药理学、分子对接方法研究“白花蛇舌草-半枝莲”药对对前列腺癌的潜在药理作用靶点及作用机制，为基础研究及临床应用提供依据。方法：利用TCMSP数据库，查找到“白花蛇舌草-半枝莲”药对的药物活性成分，并对其进行靶点预测，预测数据库为SwissTargetPrediction。同时，应用DisGeNet、GeneCards、OMIM及DRUGBANK数据库获取前列腺癌疾病靶点，利用Uniprot数据库对靶点进行校正；并利用VENNY 2.1网站绘制韦恩图，取得化合物-疾病交集。分别使用Cytoscape3.7.2、STRING数据库平台构建活性成分-靶点网络图和共有靶点蛋白互作网络(PPI)，通过相互关系大小来确定核心靶标。利用DAVID对关键靶点进行GO和KEGG富集分析。对主要活性成分与靶点，使用AutoDock软件进行分子对接。结果：“白花蛇舌草-半枝莲”药对共收集到33个有效成分，网络分析得到38个靶点基因与前列腺癌密切相关，这些靶点主要涉及信号转导、凋亡过程的正向调控、蛋白酪氨酸激酶活性，并主要富集在PI3K-Akt信号通路上。分子对接结果表明，“白花蛇舌草-半枝莲”药对主要活性成分与ESR1、CCND1和SRC具有良好的结合能力。结论：“白花蛇舌草-半枝莲”药对治疗前列腺癌具有多成分、多靶点、多途径的特点，为基础研究和临床应用提供了科学依据。关键词白花蛇舌草；半枝莲；前列腺癌；网络药理学；分子对接；作用机制中图分类号TQ文献标识码A文章编号1007-1865(2023)16-0040-05Analysis of Mechanisms of Hedyotis Diffusa-Scutellaria Barbata Herb Pair in theTreatment of Prostatic Cancer Based on NetworkPharmacology and Molecular DockingBai Juan,Hong Shuxia*(Department of Pharmacy,Xian International Medical Center Hospital,Xian 710100,China)Abstract:Objective:To study the potential pharmacological target and mechanism of Hedyotis diffusa-Scutellaria barbata herb pair(HS)on prostatic cancerbased on network pharmacology and molecular docking methods,in order to provide basis for its basic research and clinical application.Methods:The activeingredients of HS were obtained from TCMSP,and these active ingredients were predicted by SwissTargetPrediction database.At the same time,the disease target ofprostatic cancer was obtained by OMIM,DisGeNet,DRUGBANK and GeneCards database,and the target was corrected by Uniprot database,and the Waynediagram was drawn by VENNY2.1 website to obtain the ingredient-disease intersection.The ingredient-target network diagram was constructed by Cytoscape 3.7.2,and the protein-protein interaction network(PPI)was constructed by String database platform,and the core targets were selected according to the correlation.DAVID was used to analyze the enrichment of key targets by GO and KEGG.AutoDock software was used for verification of main active compounds via moleculardocking with targets.Results:A total of 33 active ingredients of HS were collected.Network analysis showed that 57 target genes were closely related to prostaticcancer.These targets were mainly related to the positive regulation of kinase activity,transmembrane receptor protein tyrosine kinase signal pathway and cellproliferation,and were mainly enriched in PI3K-Akt signal pathway.The results of molecular docking showed that the main active ingredients of HS have goodbindingabilitywithESR1,CCND1andSRCtothecoretargets.Conclusion:ThisstudyreflectsthecharacteristicsofHSon“multi-ingredient-multi-target-multi-pathway”and provides a scientific basis for its treatment of prostatic cancer.Keywords:hedyotis diffusa；scutellaria barbata；prostatic cancer；network pharmacology；molecular docking；mechanism前列腺癌是影响男性的恶性肿瘤之一，并显着导致全球男性死亡率上升。根据世卫组织(WHO)GLOBOCAN2020年数据显示，全球估计有1930万例新发癌症病例和近1000万例癌症死亡，新发癌症病例中前列腺癌仅次于乳腺癌、肺癌、结直肠癌，位居第四位，死亡病例在36种癌症中排名第八位1。复发或出现转移性前列腺癌的治疗包括接受雄激素剥夺治疗(ADT)、挽救性放疗和化疗，然而，由于抗肿瘤药物耐药性及不良反应，一直在研究寻找其他治疗方法，例如使用传统医学，纳米技术和基因疗法来对抗前列腺癌2。中药作为中国传统药材，由于具有高效、低毒、多靶点、特异性强等特点3，在抗肿瘤方面得到广泛的关注。白花蛇舌草-半枝莲药对含有多种抗肿瘤活性成分，例如黄酮类、萜类、多糖类等4-5。并且白花蛇舌草-半枝莲药对已被应用于乳腺癌6、结肠癌7、胶质瘤8、胃癌9、胰腺癌10等癌症治疗的研究，显示较好抗肿瘤活性。由于目前缺乏对该药对在前列腺癌中作用的研究，在前列腺治疗中的效用靶点、分子机制尚不清楚。本研究拟基于网络药理学方法，对“白花蛇舌草-土半枝莲”药对治疗前列腺癌的潜在机制，为后续基础研究的开展提供理论。1材料与方法材料与方法1.1药物活性成分及靶点预测将检索词“白花蛇舌草”“半枝莲”输入TCMSP数据平台，检 索 活 性 成 分，筛 选 标 准 为：口 服 利 用 度(oralbioavailability，OB)30%，联合 类药性(drug-likeness，DL)0.18。将活性成分输入Pubchem数据库，找到CanonicalSMILES，再利用SwissTargetPrediction进行靶点预测，预测条件为：物种Homo sapiens，probability0.1。1.2前列腺癌疾病靶点筛选以“Prostate cancer”为关键词，分别通过DisGeNet数据库、GeneCards数据库、OMIM数据库及DRUGBANK数据库筛选出前列腺癌的疾病相关靶点。1.3共有靶点筛选对药对活性成分和前列腺癌疾病靶点使用Uniprot数据库进行统一规范。通过VENNY 2.1网站绘制韦恩图，得到化合收稿日期2023-02-15基金项目西安国际医学中心医院青年基金(2021QN006)作者简介白娟(1990-)，女，陕西西安人，硕士，主管药师，主要研究方向为临床药学。*为通讯作者。2023年 第16期广东化工第50卷 总第498期41物-疾病交集，映射筛选出共同靶点。1.4“白花蛇舌草-半枝莲”药对与前列腺癌共有靶点PPI网络构建利用STRING数据库，筛选条件：总得分0.4和“Homosapiens”，删除无交互作用的单一蛋白，其余均为默认设置，利用Cytoscape 3.7.2软件将共有靶点PPI网络可视化，分析筛选出核心靶点。1.5 GO功能分析和KEGG通路富集分析将筛选出的“白花蛇舌草-半枝莲”药对与前列腺癌共有靶点录入DAVID数据库，设置P0.05，分析其主要的生物学过程与代谢通路并进行富集分析，结果以条形图或气泡图形式呈现，根据核心通路富集程度探究“白花蛇舌草-半枝莲”药对治疗前列腺癌的可能作用机制。1.6分子对接验证使用分子对接验证“白花蛇舌草-半枝莲”药对的主要活性成分和靶点。活性成分和靶点使用Pymol和AutoDockTools进行修饰。结合能可用于评价化合物与目标物的结合程度。结合能小于-5 kj/mol，表明目标物与组分结合效果较好18。2结果结果2.1“白花蛇舌草-半枝莲”药对主要活性成分及靶点预测结果通过TCMSP数据库初步获得“白花蛇舌草-半枝莲”药对的活性成分共131个，经过筛选去重后得到白花蛇舌草活性成分6个，对应靶点274个；半枝莲活性成分27个，对应靶点286个。主要活性成分共33个(见表1)。表表1“白花蛇舌草“白花蛇舌草-半枝莲”药对活性成分半枝莲”药对活性成分Tab.1The active ingredient of Hedyotis diffusa-Scutellaria barbata herb pairMol IDChemical nameMol IDChemical nameMOL0016462,3-dimethoxy-6-methyanthraquinone(2,3-二甲基-6-甲基蒽醌)MOL012266rivularinMOL001659Poriferasterol(多孔甾醇)MOL001973Sitosteryl acetateMOL001663(4aS,6aR,6aS,6bR,8aR,10R,12aR,14bS)-10-hydroxy-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydropicene-4a-carboxylic acidMOL012269Stigmasta-5,22-dien-3-ol-acetateMOL0016702-methoxy-3-methyl-9,10-anthraquinoneMOL012270Stigmastan-3,5,22-trieneMOL000449StigmasterolMOL000173wogoninMOL000358beta-sitosterolMOL001735DinatinMOL000098QuercetinMOL00175524-Ethylcholest-4-en-3-oneMOL001040(2R)-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-oneMOL002714baicaleinMOL0122455,7,4-trihydroxy-6-methoxyflavanoneMOL0027196-HydroxynaringeninMOL0122465,7,4-trihydroxy-8-methoxyflavanoneMOL002915SalvigeninMOL0122485-hydroxy-7,8-dimethoxy-2-(4-methoxyphenyl)chromoneMOL000351RhamnazinMOL0122507-hydroxy-5,8-dimethoxy-2-phenyl-chromoneMOL000359sitosterolMOL012251Chrysin-5-methyletherMOL005190eriodictyolMOL0122529,19-cyclolanost-24-en-3-olMOL005869daucostero_qtMOL002776BaicalinMOL000006LuteolinMOL012254campesterolMOL008206MoslosooflavoneMOL000953CLR2.2前列腺癌相关靶点的获取检索Disgenet、GeneCards、OMIM、DRUGBANK数据库分别得到前列腺癌疾病靶点58个、198个、88个、20个，筛选并去除重复值后得到疾病相应靶点319个。2.3交集靶点韦恩图绘制活性成分与疾病靶点交集为38个(图1)。注：紫色圆为活性成分，黄色圆为疾病靶点图图1活性成分与疾病靶点韦恩图活性成分与疾病靶点韦恩图Fig.1Venn diagram of active component and disease targets2.4 PPI蛋白互作网络分析将交集靶点导入STRING数据库，获得PPI蛋白互作网络信息，利用Cytoscape 3.7.2软件绘制靶蛋白PPI网络(图2)。图 中 共 有38个 节 点，295条 边 缘。根 据Degree值 和ClosenessCentrality进行排序，PPI核心靶点前5位分别为ESR1、AKT1、EGFR、CCND1和SRC(表2)。degree值越大，图形越大，颜色越深(红)；combine scores越大，颜色越浅(蓝)，线条越粗图图2“白花蛇舌草“白花蛇舌草-半枝莲”药对半枝莲”药对治疗前列腺癌潜在靶点的治疗前列腺癌潜在靶点的PPI网络图网络图Fig.2PPI network diagram of potential targets of Hedyotisdiffusa-Scutellaria barbata herb pair for prostatic cancer广东化工2023 年 第 16 期第 50 卷 总第 498 期表表 2PPI 网络核心靶点网络核心靶点Tab.2PPI network core target基因名称注释DegreeCloseness CentralityESR1Estrogen receptor300.84AKT1AKT Serine/ThreonineKinase 1280.80EGFREpidermal GrowthFactor Receptor270.79GO 功能分析得到“白花蛇舌草-半枝莲”药对治疗前列腺癌可能的作用机制。GO 富集分析分别是生物过程(BiologicalProcess,BP)、细胞成分(Cellular Component，CC)和分子功能(Molecular Function，MF)3 大类。GO 功能分析得到 210 个 BP，主要富集在信号转导、凋亡过程的正向调控、对外来生物刺激的反应等；23 个 CC，主要富集在大分子复合物、受体复合物、等离子体膜等；48 个 MF，主要富集在蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性等。对排名前10 的 GO 功能分析进行展示(图 3)。Factor ReceptorCCND1G1/S-specific cyclin-D1270.77SRCProto-oncogene tyrosine-protein kinase Src270.772.5 GO 功能分析10 的 GO 功能分析进行展示(图 3)。2.6 KEGG 通路富集分析KEGG 通路富集分析得到 117 个结果，主要涵盖前列腺癌、非小细胞肺癌和 PI3K-Akt 信号通路等，将排名前 20 的KEGG 通路富集分析结果进行展示(图 4)。图图 3GO 功能分析图功能分析图Fig.3GO functional analyzes graphs图图 4KEGG 通路富集分析图通路富集分析图Fig.4KEGG pathway enrichment analysis graphs2.7“活性成分-靶点-通路”的网络构建及可视化分析使用 Cytoscape 3.7.2 软件构建 30 个主要活性成分，38 个共同靶点，在 8 条信号通路中发挥作用可视化网络图(图 5)。紫色六边形代表活性成分，黄色椭圆形代表靶点，橘色倒三角形代表通路，灰色线条代表相互作用关系图图 5“白花蛇舌草白花蛇舌草-半枝莲半枝莲”药对中活性成分药对中活性成分-靶点靶点-通路可视化网络图通路可视化网络图Fig.5Active compound-target-pathway visualization network diagram of Hedyotis diffusa-Scutellaria barbata herb pair2.8 分子对接验证分别将有效成分querceti 和rhamnazi 与前列腺癌潜在药表表 3核心化合物和核心靶蛋白的结合能核心化合物和核心靶蛋白的结合能Tab.3Binding energy of core compound and core target protein分别将有效成分quercetin和rhamnazin与前列腺癌潜在药物核心靶点 ESR1、CCND1 和 SRC 进行分子对接，结果显示结合能小于-5 kj/mol，提示具有有良好的结合能力，结果见表3。借助 PyMOL 软件三维可视化展示，为进一步研究药物靶点提供重要的参考依据，见图 6 所示。Tab.3Binding energy of core compound and core target protein活性成分靶点结合能/(kj/mol)quercetinESR15.68CCND15.78SRC5.55rhamnazinESR15.42CCND15.62SRC5.132023年 第16期广东化工第50卷 总第498期43注：A为quercetin-ESR1对接，B为quercetin-CCND1对接，C为quercetin-SRC对接，D为rhamnazin-ESR1对接，E为rhamnazin-CCND1对接，F为rhamnazin-SRC对接图图6“白花蛇舌草“白花蛇舌草-半枝莲”药对活性成分与核心靶点的对接结果可视化分析半枝莲”药对活性成分与核心靶点的对接结果可视化分析Fig.6Visual analysis of the docking results of the active components ofHedyotis diffusa-Scutellaria barbata herb pair and the core targets3讨论讨论本研究通过网络药理学研究药对“半枝莲-白花蛇舌草”对前列腺癌的作用机制，发现了4个重要的活性成分，槲皮素(quercetin)、鼠李素(rhamnazin)和两种黄酮类化合物(Luteolin、Moslosooflavone)。癌细胞代谢受多种途径的调节，包括磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、促分裂素原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶1/2(MAPK/ERK1/2)12、核转录因子(NF-B)和线粒体活性氧(ROS)13。一些研究已经证实槲皮素通过对癌细胞生长的多个环节，发挥抗炎14和抗增殖作用15。在正常的生理条件下，过量的活性氧(ROS)具有细胞毒性，癌细胞具有更高的ROS水平16。PI3K/Akt通路通过激活Akt的信使转导信号，从而调节细胞血管生成、代谢、生长、增殖、存活、蛋白质合成、转录和凋亡等生物活性。Akt参与多种生物活性，包括细胞存活、增殖、侵袭、细胞凋亡和血管生成等。槲 皮 素 通 过 调 节 癌 细 胞ROS17、PI3K/Akt18、MAPK/ERK1/212、NF-B17途径发挥其对前列腺癌抗癌作用。有大量研究19明确表明了营养素和食品对前列腺癌病因和预防的影响，食用某些营养素(饱和脂肪酸和反式脂肪酸)和食品(例如加工肉制品)会导致前列腺激素调节中断，诱导氧化应激和炎症，以及改变生长因子信号传导和脂质代谢，这些都会导致前列腺癌变。另一方面，大量食用蔬菜、水果、鱼类和全谷物产品会产生保护和/或治疗作用20。这些特殊的生物活性功能化合物有类黄酮、二甲苯和番茄红素21。类黄酮是为一大类多酚化合物，具有两个芳环(A和B)和一个中央杂环C。有学者研究发现黄酮类化合物有预防和治疗前列腺癌的作用22。血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)是血管内皮生长因子(VEGF)细胞表面受体，在血管生成、血管发育中起着至关重要的作用，靶向VEGFR2抑制剂，抗血管生成已成为癌症治疗的重要工具。有研究发现鼠李素是一种新型VEGFR2抑制剂，抑制肿瘤血管生成和生长。鼠李素抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的人脐血管内皮细胞(HUVECs)中VEGFR2及其下游信号调节因子的磷酸化，在体外和体内可直接抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖。口服鼠李糖苷剂量为200 mg/kg/d可显著抑制人肿瘤异种移植物生长，降低肿瘤切片微血管密度(MVD)23。还有研究发现鼠李素通过谷胱甘肽过氧化物酶4依赖性铁死亡(细胞程序性死亡方式)在体外抑制肝细胞癌细胞侵袭性24。鼠李素有望作为一种新型抗肿瘤制剂，在前列腺癌中的作用有待更多的学者进一步研究。以上结果显示“半枝莲-白花蛇舌草”药对可以通过多种成分，多种途径治疗前列腺癌。本研究获得了5个核心靶基因(ESR1、AKT1、EGFR、CCND1和SRC)。目前，已经确定与前列腺癌存在风险关联的多种基因，例如AR，CYP17/19，NOS，PSA，ESR1/2等25。其中雌激素受体1(ESR1)通过刺激前列腺异常生长、控制前列腺细胞生长和编程前列腺细胞死亡与前列腺癌易感性有关26。AKT是原癌基因c-AKT表达编码的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是体内重要的凋亡抑制蛋白，并且还参与了细胞的增殖、分化。AKT的持续激活与肿瘤的发生、发展密切相关，在多种肿瘤中高表达。通过荧光原位杂交发现在前列腺癌中检测到AKT1在前列腺癌中扩增(2.6%)，未观察到AKT2和AKT3的遗传变化27。EGFR的突变和表达水平的升高与多种癌症相关，EGFR也成为前列腺癌治疗的靶目标28。细胞周期蛋白广东化工2023年 第16期第50卷 总第498期D1(CCND1)已被揭示为细胞周期(G1期)的关键调节蛋白，在促进肿瘤发展中起着关键作用。LOXL1-AS1是一种长非编码RNA，在多种癌症细胞中高表达，也是前列腺癌细胞增殖和细胞周期进展所必需的。发现LOXL1-AS1通过细胞周期调节因子(CCND1)调节前列腺癌细胞增殖和细胞周期进展，揭示了一种控制前列腺癌细胞增殖和细胞周期进程的新信号通路29。越来越多的证据表明，SRC(一种原癌基因酪氨酸蛋白激酶)在涉及前列腺肿瘤进展的多种肿瘤和骨转移过程中普遍发挥作用，推动癌细胞增殖、存活、迁移和向雄激素非依赖性生长的过渡，Src抑制可作为前列腺癌骨转移治疗方向30。GO结果显示，相关靶基因在各种生物过程、细胞成分和分子功能方面富集显著，如信号转导、受体复合物和蛋白激酶活性等。代谢异常是癌症的主要标志，如有氧糖酵解和合成代谢途径增加，在肿瘤发生、转移、耐药和癌症干细胞中具有重要作用。致癌信号通路，如PI3K/AKT、Myc和Hippo通路，介导代谢基因表达并增加代谢酶活性31。机体细胞间信号传递依赖蛋白质，细胞表面有接受相应蛋白质信号的受体，将细胞外信号传递到细胞内，诱导一系列生化反应，癌细胞形成的主要原因是细胞信号调节紊乱。蛋白激酶在细胞生物学各个方面都起着主要的调节作用，蛋白质磷酸化可以增加或减少酶活性，并且可以改变其他生物活性，如转录和翻译。由于蛋白激酶的突变和失调在人类疾病中特别是癌症起着至关重要的作用，因此蛋白激酶家族已成为过去多年年来最重要的药物靶标之一32。KEGG分析显示，靶基因与前列腺癌信号通路关系密切，其中PI3K-Akt信号通路广泛参与其中。分子对接结果显示白花蛇舌草和半枝莲药对的活性成分槲皮素和鼠李素与多个细胞凋亡相关核心靶基因如ESR1、CCND1和SRC成功对接，可作用于前列腺癌的多条信号通路，从而抑制前列腺癌的发生发展。综上所述，本研究采用多种数据分析和处理方法，分析了与“白花蛇舌草-半枝莲”有关的主要化学成分、主要靶基因和信号途径，并就其组成，多靶点、多途径治疗前列腺癌功能特点进行了阐述，为前列腺癌的治疗提供了基本思路，也为后续的系统研究奠定了理论基础。参考文献参考文献1Hyuna Sung，Jacques Ferlay，Rebecca L Siegel，et alGlobal CancerStatistics 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