基于转录组学探讨白屈菜生物碱促进小鼠睡眠障碍免疫修复药效学和机制.pdf

目的 基于转录组学探讨白屈菜生物碱促进小鼠睡眠障碍免疫修复的药效学和机制。方法 将30只昆明小鼠随机分为对照组、模型组和低、中、高剂量组，采用改良多平台水环境法每日14：00次日10：00构建小鼠睡眠剥夺模型，共剥夺 3 d。在睡眠剥夺开始前 5 d，低、中、高剂量组分别按体质量 0.012 mL/（g d）给予0.83、1.67、3.33 mg/mL白屈菜碱药液灌胃，对照组和模型组按体质量0.012 mL/（g d）给予生理盐水灌胃，共8 d。干预后观察小鼠的一般情况；ELISA法测定5组血清白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-（TNF-）、白细胞介素-1（IL-1）、干扰素（IFN-）水平；流式细胞仪检测5组血清CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD4+/CD8+。对对照组、模型组和高剂量组进行转录组测序，采用DESeq 2.0软件包进行两两差异表达基因分析，运用GO数据库和KEGG数据库对差异表达基因进行功能富集分析，构建蛋白互作（PPI）网络，筛选白屈菜碱促进睡眠剥夺小鼠免疫修复的关键基因，采用qPCR检测关键基因mRNA相对表达水平。结果 与对照组比较，模型组小鼠精神状态及毛发较差，饮食量减少，体质量均明显下降（P均0.05），IL-6、TNF-、IL-1和IFN-浓度均明显升高（P均0.05），中剂量组CD4+T细胞、CD4+/CD8+明显升高（P均0.05），高剂量组CD4+T细胞、CD8+T细胞以及CD4+/CD8+均明显升高（P 均0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量组小鼠精神状态、毛发和饮食量有所改善，体质量均明显增加（P均0.05），IL-6、TNF-、IL-1和IFN-水平均明显降低（P均0.05），CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+均明显升高（P均0.05）；与对照组比较，模型组中有15个基因明显上调，9个基因显著下调；高剂量组15个明显上调的基因明显下调，9个明显下调的基因明显上调；高剂量组与模型组之间的差异表达基因主要富集在细胞外区域部分、细胞外空间、细胞外基质、IgA肠道免疫网络等通路；通过PPI网络图以及Degree值确定CD8A为关键基因，与模型组比较，低、中、高剂量组 CD8A mRNA 相对表达水平均明显上调（P 均0.05），与测序结果一致。结论 白屈菜碱可促进睡眠剥夺小鼠免疫修复，且高、中剂量白屈菜生物碱效果优于低剂量白屈菜生物碱，机制可能与上调CD8A有关。关键词：转录组学；白屈菜碱；睡眠障碍；免疫修复睡眠障碍是一种常见的临床症状，主要表现为入睡困难、睡眠维持困难（如易醒、早醒）等，并且影响白天的正常工作、学习和生活，有研究发现有10%50%人群患有睡眠障碍1-2。睡眠障碍会增加细胞因子如白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-（TNF-）和 干扰素（IFN-）等水平，而睡眠延长则与细胞因子的产生减少有关3。研究还发现：睡眠障碍减少了血液中免疫细胞的数量，特别是CD4+和CD8+细胞，而在正常睡眠后，免疫细胞的数量明显增加4。白屈菜 Chelidonium majus出自 救荒本草，为双子叶植物纲罂粟科白屈菜属的 1 个植物种。动物实验发现白屈菜具有镇静、抗感染作用。张宝恒等5用热板法、醋酸扭体法和抖笼法证实了白屈菜注射液具有镇痛、镇静作用，且随着注射量增加，其效果也越好，还与戊巴比妥有协同作用。有研究证实白屈菜具有抗菌活性，可抑制革兰氏阳性菌、白假丝酵母菌、大肠杆菌、结核杆菌等6-7。白屈菜还有抗炎作用，可通过衰减炎性细胞因子以及抑制核因子 B（NF-B）-P65 的表达，对脂多糖诱导内毒素导致休克的小鼠起到保护作用，还可通过一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-（TNF-）治疗乙酸诱导的溃疡性结肠炎小鼠8-9。从以上多项研究可得出白屈菜具有多重作用，同时已有研究探讨了白屈菜镇静、抗感染作用的分子机制。白屈菜主要有效成分白屈菜碱是异喹啉类生物碱10，而异喹啉类化合物制备的药品可用于治疗睡眠障碍11，白屈菜碱对睡眠障碍的免疫调节效果和分子机制仍不明确。本研究采用改良多平台水环境法构建睡眠剥夺小鼠模型，探讨白屈菜碱在小鼠睡眠障碍中免疫修复的药效学和机制，以期为睡眠障碍的免疫调节提供新的候选药物。1实验材料1.1实验动物SPF级健康雄性昆明种小鼠，体质量（252）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2022-0004，饲养于福建省食品药品质量检验研究院，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2020-0010。小鼠于室内温度（23收稿日期：2023-04-22基金项目：福建省自然科学基金面上项目（2020J011094）；福建省卫生健康中青年骨干人才培养项目（2022GGA001）通信作者：王凌，E-mail：DOI：10.13260/ki.jfjtcm.2023.0700825福建中医药第 54 卷2），相对湿度60%80%，12 h昼夜循环光照下饲养，期间自由饮水、进食。1.2试剂与仪器小鼠白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-（TNF-）、白细胞介素-1（IL-1）、干扰素（IFN-）的ELISA试剂盒均购自上海科艾博生物技术有限公司；红细胞裂解液（上海雅吉生物科技有限公司）；PerCP-Cy5.5 小鼠抗 CD3 抗体（上海浩洋生物科技有限公司）；异硫氰酸荧光素标记小鼠抗 CD4 抗体和藻红蛋白标记小鼠抗 CD8 抗体均购自杭州联科生物技术股份有限公司；RNA提取试剂盒、rRNA 去除试剂盒和逆转录试剂盒均购自日本 Takara Bio 公司；TRIzol溶解液、反转录试剂盒和实时定量检测试剂盒均购自美国 ThermoFisher公司；NEBNext Ultra RNA定向文库制备试剂盒（美国Biolabs公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；Agilent 2100 生物分析仪（美国 Agilent 公司）；Hiseq 3000 测序仪（美国 Illumina 公司）；实时荧光定量PCR仪（美国AB公司）。1.3白屈菜碱药液的制备以干燥的白屈菜全草为原料，80%乙醇作为提取剂，分别以质量比1 6、1 5为料液比，提取2次，每次加热回流2 h，抽滤得滤液浓缩至无醇味；用2%HCl调节pH到2，抽滤后用乙醚萃取2次，收集下层溶液；然后用40%NaOH调节pH到11，再用乙醚萃取3次，收集上层乙醚相和下层溶液，将下层溶液用氯仿萃取 3 次，收集下层氯仿相；最后分别将乙醚相和氯仿相浓缩，于水浴60 蒸干，随即放入真空干燥箱干燥至恒重，精密称量，最终得白屈菜碱粗品12；用氯仿-乙醇重结晶 3次，氯仿、乙醇体积比为 1 2，得白屈菜碱精品。采用此方法制备 100 g原料，最终所得生物碱为1.96 g。将白屈菜碱精品溶于蒸馏水，分别配制成3.33、1.67、0.83 mg/mL白屈菜碱药液。2方法2.1分组、给药与取材将 30 只 SPF 级健康雄性昆明种小鼠随机分为对照组、模型组和低、中、高剂量组，每组 6 只。低、中、高剂量组按体质量0.012 mL/（g d）分别给予 0.83、1.67、3.33 mg/mL白屈 菜 碱 药 液 灌 胃，对 照 组 和 模 型 组 按 体 质 量0.012 mL/（g d）给予生理盐水灌胃。灌胃5 d后开始每天对除对照组外的其他组小鼠进行睡眠剥夺3 d，睡眠剥夺期间继续给予白屈菜碱药液灌胃。末次灌胃给药1 h后摘除眼球取血，颈椎脱臼处死。将小鼠血收集于 EP 管中，用离心机以 3 000 r/min离心15 min，收集上层血清保存备用。2.2睡眠剥夺模型的构建采用改良多平台水环境法13进行睡眠剥夺：使用透明水箱（30 cm20 cm15 cm），水箱内放6个圆形平台（高5 cm，直径2 cm），每两个平台之间距离为 4 cm，然后向水箱中注水，使平台高出水面 1 cm；在睡眠剥夺箱中放入小鼠，其可在平台之间活动站立、饮食饮水。但当小鼠进入睡眠时，由于全身骨骼肌张力的下降，颈部肌张力也随之降低，使小鼠每天节律性低头，进而触水清醒。对除对照组外的其他组小鼠进行睡眠剥夺20 h（每日14：00次日10：00），共睡眠剥夺3 d；对照组小鼠使用直径 6 cm 的平台，小鼠可在平台上正常进入睡眠。2.3观察指标2.3.1小鼠一般情况睡眠剥夺期间观察 5 组小鼠的精神状态、毛发状况以及进食量，干预后第9天测量5组小鼠体质量。2.3.2细胞因子水平测定根据 ELISA 试剂盒说明书，分别检测小鼠血清中炎症因子IL-6、TNF-、IL-1、IFN-水平。2.3.3T 淋巴细胞检测取 150 L 小鼠血，加入450 L 红细胞裂解液，轻轻涡旋混匀，冰上放置30 min，在4 低温离心机中以3 000 r/min离心5 min，弃上清，加 100 L PBS重悬细胞；分别加入5 L PerCP-Cy5.5 小鼠抗 CD3 抗体、2 L 异硫氰酸荧光素标记小鼠抗CD4抗体和5 L 藻红蛋白标记小鼠抗CD8抗体，混匀，冰上避光孵育 30 min；加入300 L PBS 洗涤 2 次，在 4 低温离心机中以 3 000 r/min离心 5 min，弃上清；加入 300 L PBS 重悬细胞，过300 目不锈钢滤网后用流式细胞仪检测 5 组小鼠CD4+T细胞、CD8+T细胞以及CD4+/CD8+。2.4RNA 提取和测序选择对照组、模型组和高剂量组进行测序。提取血液样本总 RNA，测定其浓度、纯度和完整度，使用 Agilent Bioanalyzer 2100 记录样本的 A 值和 RIN 值；使用 NEBNext Ultra RNA 定向文库制备试剂盒进行文库构建，并在Illumina HiSeq平台测序，使用Fast-QC软件进行质控和过滤，包括去除含有接头的 Reads，去除低质量的 Reads，从而得到高质量的 RNA 测序数据（clean reads）。2.5 3 组 差 异 表 达 基 因 的 筛 选 采 用 R 语 言（https：/www.r-project.org/）DESeq 2.0 软件包对基因表达进行差异分析，将表达水平差异1（即|log2 差异倍数1）且 P0.05 作为筛选差异表达基因的标准，采用 R 语言 ggplot包绘制差异基因火山图，采用R语言pheatmap包绘制热图。2.6功能富集分析对差异表达基因涉及的生物学过程、细胞组分和分子功能进行 GO 富集分析（数据库：http：/geneontology.org/）；对差异表达基因富集的主要信号通路进行KEGG通路富集分析（数据库：http：/www.kegg.jp/）。2.7蛋白互作（PPI）网络和关键基因的确定将26朱丽萍 等：基于转录组学探讨白屈菜生物碱促进小鼠睡眠障碍免疫修复药效学和机制第 7 期差异表达基因导入 GENEMANIA 数据库（http：/genemania.org/）进行 PPI 网络分析；通过 Cytoscape软件（https：/cytoscape.org）cytoHubba 插件，以 Degree算法计算基因的评分；筛选Degree值前10位的基因，观察各个基因在对照组、模型组与高剂量组表达水平的差异，进一步确定关键基因。2.8关键基因 mRNA 相对表达水平测定采用qPCR 法验证关键基因 CD8A（正向引物：5CCCTT TACTGCAACCACAGG 3；反向引物：5 GTCTCCCG ATTTGACCACAG 3）。提取血液样本中总RNA，逆转录试剂盒逆转录成cDNA，选取-actin为内参基因，采用 qPCR 技术以及 2-CT法计算 CD8A mRNA相对表达水平。2.9统计学方法采用SPSS 23.0软件对数据进行处理。计量资料符合正态分布以（x s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时组间两两比较采用LSD-t检验，方差不齐时组间两两比较采用Tambanes T2检验。P0.05表示差异具有统计学意义。3结果3.15组小鼠一般情况比较与对照组比较，模型组小鼠精神状态及毛发较差，饮食量减少，体质量明显下降（P0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量组小鼠以上症状有所改善，体质量均明显增加（P均0.05），且中、高剂量组小鼠体质量改善明显大于低剂量组（P均0.05）。见表1。3.25组小鼠细胞因子水平比较见表2。3.35组小鼠免疫细胞水平比较见表3。3.43组差异表达基因两两比较与对照组比较，模型组中共有 703个差异表达基因，其中 540个基因表达上调，163个基因表达下调；与模型组比较，高剂量组中共有 355个差异表达基因，其中 246个基因表达上调，109个基因表达下调，见图1。不同组两两比较，存在 24 个相同的差异基因。与对照组比较，模型组中有 15个基因明显上调，9个基因明显下调；与模型组比较，高剂量组中15个明显上调的基因明显下调，9个明显下调的基因明显上调。见图2。3.5功 能 富 集 分 析 对 模 型 组 与 对 照 组 之 间703 个差异表达基因进行 GO 富集分析发现：显著富集的途径包括细胞分泌、细胞信号转导等，见图3A。对高剂量组与模型组之间 355 个差异表达基因进行 GO富集分析发现：表达基因富集到细胞外区域部分（extracellular region）、细胞外空间（extracellular space）、细胞外基质（extracellular matrix）等，见图 3B。对模型组与对照组之间差异表达基因进行 KEGG富集分析发现差异表达基因富集到氮代谢、糖鞘脂生物合成、细胞因子受体相互作用等，见图4A。对高剂量组与模型组之间差异表达基因进行KEGG富集分析发现差异表达基因富集到IgA肠道免疫网络（intestinal immune network for IgA production）等，见图4B。3.6关键基因的确定不同组两两比较所得的24 个交集差异基因构建的 PPI 网络图见图 5。Degree值前10位的基因为HLA-A、CD3D、CD8A、HLA-G、HLA-C、HLA-F、CD3E、LCK、CD8B 和 OPRL1。其中由实验结果得出CD8A在模型组明显下调，而可被白屈菜碱明显反向调控，其余基因为预测的互作蛋白，所以，CD8A为白屈菜碱促进睡眠剥夺免疫修复的关键基因。表15组小鼠体质量比较（x s）g 组别对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组n66666体质量33.492.0725.531.281）27.601.592）30.461.703）29.901.713）注：与对照组比较，1）P0.05；与模型组比较，2）P0.05；与低剂量组比较，3）P0.05。表25组小鼠细胞因子水平比较（x s）pg/mL 组别对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组n66666IL-6 34.842.4267.274.911）45.191.872）42.583.822）39.802.592）3）TNF-21.721.1726.871.111）24.671.392）24.091.322）24.091.412）IL-149.813.42110.018.091）71.374.932）59.704.362）3）55.012.512）3）IFN-29.921.0447.982.851）40.311.832）37.952.812）35.301.972）3）注：与对照组比较，1）P0.05；与模型组比较，2）P0.05；与低剂量组比较，3）P0.05。表35组小鼠免疫细胞水平比较（x s）组别对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组n66666CD4+T细胞/%54.502.5236.913.291）40.032.7643.342.662）45.803.012）3）CD8+T细胞/%35.151.7330.770.891）32.150.9631.801.1834.231.342）3）CD4+/CD8+1.550.091.200.081）1.240.061.360.062）3）1.340.062）3）注：与对照组比较，1）P0.05；与模型组比较，2）P0.05；与低剂量组比较，3）P0.05。27福建中医药第 54 卷ABCD-log10（P value）-log10（P value）注：A 模型组与对照组的火山图；B 高剂量组与模型组的火山图；C 模型组与对照组的热图；D 高剂量组与模型组的热图。Up-regulated：上调；Down-regulated：下调；Fold change：差异倍数；P value：P值。图 1 差异表达基因筛选的火山图和热图52515941549237图 2 3组小鼠之间差异表达基因的交集28朱丽萍 等：基于转录组学探讨白屈菜生物碱促进小鼠睡眠障碍免疫修复药效学和机制第 7 期3.75组CD8A mRNA相对表达水平比较与对照组比较，模型组 CD8A mRNA 相对表达水平明显下调（P0.01）；与模型组比较，低、中、高剂量组CD8A mRNA相对表达水平均明显上调（P均0.01），与测序结果一致。见表4。4讨论本研究通过睡眠剥夺小鼠模型，测定白屈菜碱对睡眠剥夺小鼠的细胞因子水平与免疫细胞水平的影响，并进一步通过RNA测序和qPCR探讨白屈菜碱对睡眠剥夺免疫修复的药效学作用和分子机制。结果表明：白屈菜碱可致细胞因子 IL-6、TNF-、IL-1、IFN-水平降低并明显逆转睡眠剥夺下的CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD4+/CD8+下降。CD4+/CD8+是免疫调节的一项指标，CD4+有抗感染免疫作用，CD8+参与细胞毒反应，CD4+/CD8+比例降低提示感染风险的增加。白屈菜碱干预可以使小鼠体内 CD4+/CD8+比例明显升高，进一步验证了白屈菜碱的抗感染作用。另外，与低剂量组比较，中、高剂量组干预效果更为显著，可见，高浓度白屈菜碱可以更有效地促进睡眠障碍小鼠的修复。进行测序和富集分析发现：白屈菜碱可能通注：A 模型组 vs.对照组；B 高剂量组 vs.模型组。enrichment ratio：富集比；FDR（false discovery rate）：错误发现率。图 3 3组差异表达基因 GO 功能富集分析的两两比较注：A 模型组 vs.对照组；B 高剂量组 vs.模型组。图 4 3组差异表达基因 KEGG 富集分析的两两比较图 5 交集差异基因的 PPI网络图表45组CD8A mRNA相对表达水平比较组别对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组n66666mRNA1.990.060.820.051）0.990.072）1.200.052）3）1.420.072）3）注：与对照组比较，1）P0.01；与模型组比较，2）P0.01；与低剂量组比较，3）P0.01。29福建中医药第 54 卷过细胞外区域部分、细胞外空间、细胞外基质、IgA肠道免疫网络等促进睡眠剥夺的免疫修复。失眠相关的免疫功能障碍的一个可能机制是细胞外区域部分、细胞外空间、细胞外基质中促炎症细胞因子和其他免疫信号分子的失调。研究发现睡眠障碍患者细胞外结构中促炎症细胞因子如 IL-6、TNF-的水平增加14，这可能导致免疫功能障碍和其他负面健康结果15。昼夜节律失调已被证明会影响细胞外基质蛋白质的种类和水平，可因此改变免疫功能16。此外，睡眠障碍会降低IgA抗体水平，同时导致肠道微生态改变，肠道菌群可以“肠、脑轴”为桥梁，将睡眠与免疫网络建立联系17-19。CD8A 是白屈菜碱调节睡眠障碍免疫功能的关键基因。CD8 抗原是一种在大多数细胞毒性 T淋巴细胞上发现的细胞表面糖蛋白，在免疫系统内介导有效的细胞-细胞相互作用。CD8抗原与T淋巴细胞上的 T细胞受体一起作为核心受体，由 2条链组成同源二聚体或由 1条 链和 1条 链组成异源二聚体。CD8A同源二聚体能促进活化淋巴细胞的生存和分化为记忆性 CD8 T 细胞，CD8A 异源二聚体与组织相容复合物、辅酶 Q10 结合，可能在细胞损伤或应激后的免疫反应中发挥作用。与CD8A 相关的疾病包括鼻窦炎、呼吸道感染、肾小球肾炎等，CD8A导致疾病的相关途径有 TCR信号传导和 SARS-CoV-2 信号传导途径等20-22。TOTH 等23发现流感感染后的慢波睡眠（SWS）时间增减受 CD8A 的调控。可见，CD8A 与睡眠和免疫功能都有着密切关系，白屈菜碱可显著提高睡眠剥夺所致的CD8A低表达，是促进睡眠障碍免疫修复的候选药物。综上所述，本研究发现白屈菜碱可通过细胞外区域部分、细胞外空间、细胞外基质、IgA肠道免疫网络等途径修复睡眠剥夺诱发的免疫失衡，逆转细胞因子升高和免疫细胞下降，CD8A可能是白屈菜碱作用的潜在靶点。本研究为后续白屈菜碱调节睡眠剥夺免疫抑制的分子机制研究及市场开发提供参考依据。参考文献1PERLIS M L，POSNER D，RIEMANN D，et al.Insomnia J.Lancet，2022，400（10357）：1047-1060.2FERINI-STRAMBI L，AUER R，BJORVATN B，et al.Insomnia disorder：clinical and research challenges for the 21st century J.Eur J Neurol，2021，28（7）：2156-2167.3IRWIN M R.Sleep and inflammation：partners in sickness and in health 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