神经退行性疾病相关蛋白病理性聚集和液液相分离研究进展.pdf

2023 年 第 4 卷 第 3 期|Synthetic Biology Journal 2023，4（3）：590-610神经退行性疾病相关蛋白病理性聚集和液液相分离研究进展唐一鸣，姚逸飞，杨中元，周运，王子超，韦广红（复旦大学物理学系，表面物理国家重点实验室，计算物质科学教育部重点实验室，上海 200438）摘要：蛋白质的错误折叠和聚集与一系列神经退行性疾病密切相关，比如阿尔茨海默病、帕金森病等，其主要病理特征是以蛋白质异常聚集形成的淀粉样纤维为主要成分的包涵体。近期研究表明疾病相关蛋白大多能够发生液液相分离，形成动态可逆的液态凝聚物（亦称无膜细胞器），并参与细胞生理过程，而突变、翻译后修饰以及微环境等因素则能促进其发生不可逆液固相变形成病理性纤维。本文以几种神经退行性疾病相关蛋白为例，重点介绍蛋白质病理性聚集和液液相分离的实验研究方法和前沿进展，蛋白质相互作用、聚集和相分离微观机理的理论和计算研究，以及预测蛋白相分离能力的机器学习方法。这些研究对深入理解蛋白质病理性聚集、相变和相分离的微观机制，以及相关疾病致病机理具有重要的科学意义，并对治疗药物的设计和开发具有潜在应用价值。关键词：神经退行性疾病；病理性聚集；纤维化；液液相分离；蛋白质相互作用；微观机理中图分类号：Q816 文献标志码：A Pathological aggregation and liquid-liquid phase separation of proteins associated with neurodegenerative diseasesTANG Yiming，YAO Yifei，YANG Zhongyuan，ZHOU Yun，WANG Zichao，WEI Guanghong（Department of Physics，State Key Laboratory of Surface Physics，and Key Laboratory of Computational Physical Sciences（Ministry of Education），Fudan University，Shanghai 200438，China）Abstract:Protein misfolding and aggregation are closely related to the development of neurodegenerative diseases.Their main pathological hallmark is protein inclusion bodies,whose major components are amyloid fibrils formed by abnormal protein aggregation.For example,Alzheimers disease is related to the amyloid plaques formed by-amyloid proteins and the neurofibrillary tangles formed by tubulin-associated unit(tau)proteins.The pathological feature of Parkinsons disease is Lewy bodies formed by aggregation of-synuclein.In addition,recent studies have shown that a majority of neurodegenerative disease-related proteins including Tau,-synuclein,and TDP-43 can undergo liquid-liquid phase separation to form liquid condensates or membrane-free organelles.These condensates are involved in a 收稿日期：2023-01-12 修回日期：2023-03-28基金项目：国家自然科学基金（12074079）引用本文：唐一鸣，姚逸飞，杨中元，周运，王子超，韦广红.神经退行性疾病相关蛋白病理性聚集和液液相分离研究进展 J.合成生物学，2023，4（3）：590-610Citation：TANG Yiming，YAO Yifei，YANG Zhongyuan，ZHOU Yun，WANG Zichao，WEI Guanghong.Pathological aggregation and liquid-liquid phase separation of proteins associated with neurodegenerative diseases J.Synthetic Biology Journal，2023，4（3）：590-610DOI:10.12211/2096-8280.2023-005特约评述第 4 卷 number of cellular physiological processes,such as regulating signal transduction.Pathological fibrosis and liquid-liquid phase separation are two forms of protein aggregation,and protein liquid-liquid phase separation may be a driving force for misaggregation and fibrosis.Disease-related mutations,post-translational modifications including truncations,acetylations,and phosphorylations,and microenvironments such as pH,ion strength,and temperature can promote or inhibit liquid-solid phase transitions and the formation of pathological fibrils.Uncovering molecular mechanism underlying pathological protein aggregation and liquid-liquid phase separation is crucial to understanding the pathogenic process and developing effective therapeutic drugs as well.This review focuses on recent progress in experimental and computational studies on the pathological aggregation and liquid-liquid phase separation of neurodegenerative disease-related proteins,including -amyloid,-synuclein,TDP-43,tau,and FUS proteins.We briefly introduce the application of experimental methods(nuclear magnetic resonance,X-ray diffraction,and cryo-electron microscopy)for studying protein aggregation and determining fibril structure with cutting-edge techniques(differential interference contrast and fluorescence recovering after photobleaching)to explore protein phase separation.Advances in the conformational ensemble of proteins using enhanced sampling methods such as replica-exchange molecular dynamics simulations,and studies of the phase behavior of proteins using field-theoretic simulation and multiscale simulations are summarized.Machine learning in predicting protein phase separation ability is also addressed.Keywords:neurodegenerative diseases;pathological aggregation;fibrillization;liquid-liquid phase separation;protein-protein interactions;molecular mechanism蛋白质是生物功能的主要执行者，它们通过折叠成特定的空间结构来发挥生理功能，但在一定的条件下会发生错误折叠和聚集并导致疾病。神经退行性疾病就是一类以蛋白质异常相互作用和聚集为病理特征的疾病，如阿尔茨海默病与淀粉样蛋白（amyloid-，A）形成的淀粉样斑块以及微管相关蛋白（tubulin associated unit，Tau）异常聚集而形成的神经纤维缠结有关1；帕金森病591合成生物学 第 4 卷的病理特征是-突触核蛋白（-synuclein，Syn）聚集成的路易小体2；肌萎缩侧索硬化症与TDP-43蛋白包涵体有关3。除此之外，最新研究表明：很多神经退行性疾病相关蛋白（包括 Tau4、Syn5、TDP-436）亦能发生液液相分离并组装成液态凝聚物（在体内被称为无膜细胞器），进而发挥调控信号传导和异染色质转录等生理功能7。病理性纤维化与液液相分离是蛋白质聚集的两种形式，蛋白质液液相分离可能是下一步错误聚集和纤维化的驱动力8-9。在细胞微环境（如pH、温度）改变或氨基酸突变等情况下，蛋白质液态凝聚物会进一步发生液-固相变，形成病理性纤维10。表1列出了部分能发生纤维化和/或相分离的神经退行性疾病相关蛋白。研究蛋白质分子间相互作用以及聚集的微观机理，对于进一步理解蛋白质的生理功能和病理过程，以及相关疾病的药物研发具有非常重要的科学意义和应用价值。目前对于神经退行性疾病相关蛋白的毒性机理和纤维化机制已经有广泛和深入的研究。利用X射线衍射、核磁共振、冷冻电镜等实验方法，研究人员解析出了大量蛋白的纤维结构，它们具有cross-的结构特征，即由主链间氢键稳定的折叠结构。多种实验方法已经被用来表征蛋白质的纤维形貌和纤维化过程28；计算模拟被用来研究纤维的热力学性质、揭示蛋白-蛋白以及纤维-抑制剂之间的相互作用机理29-30。与此相比，蛋白质液液相分离微观机制的研究尚处于起步阶段。目前普遍认为蛋白质固有无序区域之间的多价相互作用是相分离的主要驱动力31-32，但对于凝聚物内部的蛋白构象特征、蛋白-蛋白、蛋白-RNA之间的相互作用模式等，尚知之甚少。本文将以神经退行性疾病相关蛋白为切入点，综述它们病理性聚集和液液相分离的前沿进展，介绍表征蛋白质聚集体形貌和空间结构的实验手段，研究蛋白质相互作用、聚集和相分离微观机理的理论和计算方法，以及预测相分离能力的机器学习方法。1 神经退行性疾病相关蛋白病理性聚集的实验研究方法为了理解神经退行性疾病的病理过程，揭示相关蛋白病理性聚集的物理机制，国内外实验工作者已经开展了大量研究，包括解析纤维的空间结构和形貌、表征纤维化的动力学过程等。表2列出了主要实验方法（主要包括谱学方法和显微方法两大类）以及它们各自的适用范围。圆二色谱法（circular dichroism spectroscopy，即CD谱）33和傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）34等谱学方法常用来测定蛋白质链中的二级结构含量。这些方法具有操作简便、测定时间短等优点，但不能表征二级结构在蛋白质链上的分布。根据核磁共振方法（nuclear magnetic resonance，NMR）测得的特定原子化学位移，可以得到每个氨基酸形成的二级结构类型46。跟踪荧光强度的时间演化是实验表征蛋白质纤维化过程以及抑制剂分子干预的主要手段，如 ThT 荧光光谱法（ThT fluorescence spectroscopy，ThT-FS）35。例如根据在Tau255-411溶液中加入硫酸化的肝素后的 ThT信号的增长速度快慢，判定肝素对 Tau 蛋白片段的纤维化的影表表1代表性神经退行性疾病相关蛋白的聚集和相分离能力Table 1Aggregation and phase separation of proteins associated with neurodegenerative diseases蛋白质淀粉样蛋白(-amyloid)微管相关蛋白(Tau)普里昂蛋白(Prion)-突触核蛋白(-synuclein)反式激活核酸结合蛋白-43(TDP-43)融合肉瘤蛋白(FUS)亨廷顿蛋白(Huntingtin)相关疾病阿尔茨海默病阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、帕金森病疯牛病、家族性致死性失眠症、羊瘙痒症、库鲁病帕金森病肌萎缩侧索硬化症、额颞叶变性运动神经元疾病肌萎缩侧索硬化症、额颞叶痴呆亨廷顿病相关文献纤维化能力11-1213-141619-20212224-25相分离能力暂无报道8,1517-18562326-27592第 4 卷 响47。值得注意的是，一些外源性化合物本身会导致ThT荧光信号产生偏差48。扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）36、透射电镜（transmission electron microscope，TEM）37、原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）38等方法是用于表征淀粉样纤维空间形貌的常用方法。如 Islam 等49结合 TEM 和 SEM 观测到 A淀粉样纤维具有螺旋状缠结的形貌；Makky等50通过TEM发现Tau蛋白能形成6种具有不同形貌的纤维，并通过AFM给出了这6种纤维的高度。由于淀粉样纤维不溶于水，又很难结晶，常规的解析蛋白质结构的方法，如晶体X射线衍射和液体核磁共振不能用于解析纤维的结构。X射线衍射只能得到主链的骨架信息，即cross-结构。例如Salveson等51通过X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）方法解析出了具有 cross-结构的 A16-36纤维。解析纤维原子分辨空间结构的主要方法包括固体核磁共振（solid-state NMR，ssNMR）40-41和冷冻电镜43方法。如Tuttle等52通过ssNMR解析出了全长A40的纤维结构。Gremer等53、Fitzpatrick等13以及Li等21分别通过冷冻电镜解析出了全长 A42蛋白、Tau306-378和 TDP-43 低复杂度结构域（low-complexity domain，LCD）的 纤 维 结构。这些纤维结构的解析为药物研发提供了结构基础。用于表征蛋白质纤维化过程中蛋白分子内/分子间相互作用的实验方法有交联质谱（chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry，简称CXMS或XL-MS）44、核磁共振40-41、荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）45方法等。例如Daniele Ubbiali等54采用交联质谱的方法跟踪Syn蛋白聚集过程中相互作用的演化，观察到蛋白质链随着聚集进程逐渐伸展；Yoh课题组55使用固体核磁共振方法观察到了Syn蛋白在纤维化过程中单体构象逐渐伸展并形成折叠结构的过程。Meng等56使用单分子荧光共振能量转移方法研究了 A40和 A42的单体构象，发现两者单体结构均呈现高度无序的状态。上述这些实验手段为揭示蛋白质聚集机理提供了重要帮助。2 神经退行性疾病相关蛋白自聚集和共聚集的实验研究神经退行性疾病通常伴随着神经系统中的不溶性淀粉样蛋白斑块，这些斑块通常由一种或多种蛋白质聚集而成57。研究相关蛋白质的聚集和共聚集，对深入理解神经退行性疾病的复杂病理学成因至关重要。本节以 Syn、TDP-43、A、Tau、FUS等疾病相关蛋白为例，简要介绍实验上对它们形成的纤维结构的表征，并以Syn和A蛋白为例，介绍它们与其他蛋白质共聚集的研究工作。上述五个蛋白中，Syn、A和Tau蛋白是固表表2研究蛋白质病理性聚集的主要实验方法Table 2Major experimental methods for studying protein pathological aggregation实验方法圆二色谱(CD spectra)傅里叶红外光谱(FTIR)ThT荧光光谱(ThT-FS)扫描电子显微镜(SEM)透射电子显微镜(TEM)原子力显微镜(AFM)微分干涉差显微镜(DIC)固体核磁共振(ssNMR)X射线衍射(XRD)冷冻电镜(Cryo-EM)化学交联质谱(XL-MS)荧光共振能量转移(FRET)研究内容解析空间结构x表征二级结构x表征空间形貌表征蛋白内/间相互作用参考文献3334353637383940-4142434445593合成生物学 第 4 卷有无序蛋白，而TDP-43和FUS蛋白则分别包含了长为148、165个氨基酸的固有无序区域，它们均具有高亲水性、高带电性和结构无序的特征。图1给出了A、Syn、TDP-43、Tau和FUS代表性的纤维结构及对应的PDB ID。除了PDB ID为2M4J和2LNQ的A纤维结构与PDB ID为5W3N的FUS纤维结构由ssNMR解出，PDB ID为5XSG的FUS纤维结构由X射线衍射解出外，图中其余结构均由冷冻电镜解出。该图的最左边给出了每种蛋白或其LCD的氨基酸占比（“其他”包含了所有低于5%含量的氨基酸）。2.1 阿尔兹海默病与A、Tau蛋白阿尔茨海默病是全球第一大神经退行性疾病，它的病理进程与大脑中淀粉样蛋白（-amyloid，A）和微管相关蛋白（Tau）形成的神经纤维缠结有关。A是最早被关注和研究的淀粉样蛋白之一，全长的A共有42个氨基酸，存在多个氨基酸数目少于42的异构体，其中A40和A42是两种被广泛研究的重要异构体。在过去的二十多年里，研究人员已经通过核磁共振、冷冻电镜等方法解析出了全长A及其多个片段的空间结构，如2M4J58、图图1神经退行性疾病相关的五种蛋白的氨基酸组成和代表性纤维结构Fig.1Amino acid composition and fibril structures of neurodegenerative disease-related proteins594第 4 卷 5OQV53等。Tau蛋白是一种主要在脑细胞中表达的微管相关蛋白，由441个氨基酸组成，主要具有稳定轴突微管的生理功能，其微管结合域由4个重复单元组成（R1R4）。早在1963年和1981年，研究人员就找到了2种不同形貌的Tau蛋白的纤维双螺旋细丝形态（PHF）和直丝形态（SF）59-60，但直到2017年这2种纤维结构才被冷冻电镜解出（PDB ID：5O3T，5O3L）13。从不同的神经退行性疾病患者大脑中提取的Tau蛋白纤维空间结构不同，如从皮质基底节变性患者大脑内提取的两种纤维结构（PDB ID：6TJO、6TJX）61，不同于从眼颈肌张力障碍病人体内提取的两种纤维结构（PDB ID：7P66、7P67）62。这些结构的解析为进一步理解蛋白质错误折叠/纤维化与不同神经退行性疾病的关系提供了新的视角，并为这些疾病的药物研发提供了新的线索。2.2 帕金森病与-突触核蛋白帕金森病是全球第二大神经退行性疾病，其病理特征是大脑中主要由Syn蛋白聚集成的淀粉样斑块（路易小体）63。Syn共有140个氨基酸，由 N端结构域、纤维核心域（NAC）和 C端结构域组成。目前已有多个全长Syn或其片段的纤维结构被解析出来，其中 2016 年 Tuttle 等采用固体核磁共振（ssNMR）方法解析出的全长纤维，2018年采用冷冻电镜方法，Li、Stahlberg和Ye三个课题组分别解析出了Syn片段的纤维结构。这4 个结构均具有希腊钥匙（Greek-key）的结构特征，即单体由多段折叠在空间蛇形排列，它们的PDB ID 分 别 是 2N0A52、6A6B64、6H6B65、6CU766。2019年Guerrero-Ferreira等19解出了两个单体结构类似但原纤维间界面不同的Syn片段纤维结构；2020年Schweighauser等20解析了2种从病人体内提取的Syn片段纤维结构。而这4个结构没有Greek-key的结构特征。除此之外，氨基酸突变、翻译后修饰等会影响Syn的分子内/间相互作用模式，从而使纤维结构不同于野生型纤维。例如H50Q、G51D、A53T这三个突变均会改变原纤维间的界面，从而改变纤维形貌（PDB ID：6PES67、7E0F68、6LRQ69）。N端截短（如1-40）和磷酸化（如pY39）等翻译后修饰都会改变纤维的空间结构（PDB ID：7LC970、6L1U71）。2.3 肌萎缩侧索硬化症与 TDP-43 蛋白、FUS蛋白肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）也称渐冻人症，其病理特征是大脑组织中由多种蛋白聚集形成的不溶性蛋白质包涵体，TDP-43和FUS蛋白是其主要成分。TDP-43蛋白由414个氨基酸组成，包括 3 个结构域：N 端结构域、RNA识别结构域和C端低复杂度结构域（LCD）。其中LCD结构域对TDP-43的聚集具有至关重要的作用，且其单独也能够发生纤维化。近年来LCD区域多个片段的纤维结构被解出，2019 年 Cao等72通过冷冻电镜解出了5个长度不同的LCD短肽片段纤维结构，其形貌各不相同（PDB ID：6N37、6N3B、5O3L、5O3T、6GX5）。Guenther等73找出了LCD区域中6个能独立形成空间拉链结构的片段（PDB ID：5WKD、6CEW、6CB9、5WIQ、5WIA、5WHN）。全长LCD纤维结构于2021年被Li等21通过冷冻电镜方法首次解析出来，该纤维（PDB ID：7KWZ）包含一个由139个残基堆叠而成的纤维核。LCD包含了TDP-43蛋白约90%的病理性突变，大部分突变能够加速纤维化过程或改变纤维形貌。例如野生型LCD312-317片段能够形成动态可逆的纤维，但 A315E/T突变会导致固态不可逆纤维的形成73；A315T 突变会使 LCD286-331片段在体外形成的纤维神经毒性增强74；G335D突变能促进LCD发生从螺旋到折叠的结构转变从而促进其聚集75。LCD片段及全长LCD纤维结构的成功解析，为进一步理解TDP-43蛋白质的异常聚集和纤维化奠定了基础。FUS蛋白由526个氨基酸组成，它在生物体内参与转录调节、RNA代谢和DNA损伤修复等多种生理功能76。FUS蛋白包含两个结构域：位于N端的低复杂结构域（LCD）和位于C端的RNA结合域，其中LCD对FUS蛋白的聚集具有至关重要的作用。2017年Murray等22在大肠杆菌中表达，并进一步得到了 FUS 全长 LCD（氨基酸 1214）的纤维，并通过 ssNMR 方法解出了其核心片段（FUS37-97）的纤维空间结构；2018 年 Luo 等77采595合成生物学 第 4 卷用X射线衍射方法解出了FUS37-42与FUS54-59片段的纤维结构（PDB ID：5XSG、5XRR）。这些研究发现FUS形成的纤维具有热可逆性（升高温度纤维溶解，降低温度纤维重新形成）。2020年Lee等78采用冷冻电镜方法得到了 FUS112-150片段的纤维结构（PDB ID：6XFM），其形貌具有U型的特征。最近Sun等79采用冷冻电镜方法，解析出了LCD区域34-124片段的纤维结构（PDB ID：7VQQ），该纤维片段由具有V型、S型和N型特征的3个区域组合而成。TDP-43 LCD 片段和 FUS LCD 片段以及全长TDP-43 LCD 纤维结构的成功解析，为进一步理解 TDP-43、FUS 蛋白质的异常聚集和纤维化以及肌萎缩侧索硬化症等疾病的分子机制奠定了基础。2.4 多种神经退行性疾病相关蛋白的异质相互作用研究表明，两种不同神经退行性疾病相关蛋白的错误折叠和聚集存在关联。例如，Syn和Tau蛋白存在强病理性关联：在患有路易小体痴呆的病人中，编码Syn和Tau蛋白的基因（SNCA和MAPT）具有强相关性80；错误折叠的Syn和Tau蛋白均具有细胞间传递的能力81；在患有阿尔兹海默病、ALS等多种神经退行性疾病的患者脑组织中 Syn和 Tau蛋白存在共定位82-83。研究人员已经通过体外实验深入研究了Syn和Tau的相互作用模式：如将Syn加入到Tau蛋白液态凝聚物中时，Syn带负电的C端能与Tau带正电的聚脯氨酸结构域P2（198-243残基）结合，加速凝聚物向固态纤维转变（图 2）84。A 的 N 端可以与图图2神经退行性疾病相关的四种蛋白的单体、淀粉样纤维和共聚集形成的异质凝聚体84-87Fig.2Monomer conformations,amyloid fibrils of proteins related to neurodegenerative diseases and their heterogeneous aggregates84-87596第 4 卷 Syn的N/C端结构域相互作用形成异质二聚体85。另外，阿尔茨海默病和 Prion 疾病也存在病理关联86，病理学研究表明Prion蛋白能与阿尔茨海默病患者脑组织中的A淀粉样蛋白发生免疫共沉淀现象87。淀粉样纤维的多形性，以及多种蛋白质异质相互作用的实验发现，为神经退行性疾病的机理研究和药物开发带来了新的挑战。3 神经退行性疾病相关蛋白构象分布、相互作用和病理性聚集微观机理的模拟研究虽然实验研究在纤维结构解析方面取得了重大进展，但通常只能得到纤维的静态结构，再加上蛋白质低聚体构象高度动态变化及其不稳定性，因此实验方法很难识别纤维的最小稳定单元、揭示抑制剂分子与纤维相互作用的微观机理，以及表征聚集早期蛋白质的构象变化和低聚体结构特征。随着蛋白质力场的发展与完善，分子动力学等计算机模拟方法能够在原子/分子水平研究蛋白质/多肽的聚集过程88。基于分子动力学模拟的轨迹，一方面，计算二级结构含量和分布可以与实验给出的 CD 谱、化学位移结果对比，而计算氨基酸间距离能与 FRET 实验结果等对比，验证模拟结果的可靠性；另一方面，可以实现对纤维热力学和动力学性质、蛋白质相互作用以及聚集机理的表征。分子动力学模拟的流程见图3。3.1 纤维最小稳定单元的确定和纤维-抑制剂相互作用的计算模拟以纤维结构为初始构型作分子动力学模拟可以用来确定纤维最小稳定单元，表征纤维热力学和动力学性质、纤维内部分子间/内相互作用以及纤维与溶剂之间相互作用。如针对A42的L-S型纤维结构，全原子分子动力学模拟发现四聚体是其最小稳定单元89；而对于TDP-43288-319片段的纤维结构，模拟表明七聚体是其最小稳定单元90。针对同种蛋白不同纤维结构的模拟，可以比较它们各自的稳定性，给出稳定它们空间构型的重要物理相互作用类型。例如，Natesh等91针对三种A纤维结构（PDB ID：2M4J、2LMN、2LMP）进行了分子动力学模拟，发现这三种纤维具有不同的稳定性，并揭示了稳定各自纤维结构的分子间相互作用。另外，针对抑制剂（如小分子、抗体等）抑制纤维化或破坏纤维结构的实验发现，研究人员开展了一系列模拟工作，旨在揭示相应的抑制和破坏机理，为进一步筛选或设计新型药物分子提供理论指导。比如利用常规或增强采样的分子图图3通过计算模拟研究蛋白质相互作用及病理性聚集的流程图Fig.3Flow sheet for studying protein interactions and pathological aggregation by computational simulation597合成生物学 第 4 卷动力学模拟，研究了不同分子对A原纤维的破坏机制，发现：桑黄素破坏盐桥和氢键92；辣椒提取物wgx-50通过疏水相互作用93、aducanumab抗体通过特异性结合纤维N端94来破坏纤维；手性小分子（+）-Catechin和（）-Catechin构象差异引起空间位阻效应的不同，呈现出对A原纤维不同的破坏效果95。最近本文作者所在的课题组采用分子动力学模拟研究了黄芩素对多种不同形貌Syn纤维的破坏，发现黄芩素对不同纤维具有不同的破坏效果和机理96。这些模拟结果为相关疾病药物的筛选和设计提供理论指导。3.2 蛋白质寡聚体构象分布的模拟研究模拟蛋白质分子的自发聚集过程和低聚体构象分布，是理解蛋白质聚集微观机理的有效手段。限于模拟时间尺度和计算资源，很难从全原子水平直接模拟大量蛋白分子自发组装成纤维的过程，目前研究主要侧重于聚集早期低聚体的构象分布和蛋白间相互作用模式。以A及其短肽为例，国内外多个课题组分别采用副本交换分子动力学研究了A40和A42的二聚体构象分布，发现二聚体构象结构多样，既包含无序结构，也包含多种富含片层的构象，并给出了稳定二聚体的相互作用类型97-98。除了构象热力学特性，Cao等99将分子动力学模拟与马尔可夫态模型结合，研究了 A 蛋白二聚化的动力学过程。与A相比，Syn、Tau等蛋白的氨基酸序列较长，现有工作大都针对它们的重要片段进行研究。例如，Yamauchi等100通过增强采样方法给出了NAC核心短肽片段68GAVVTGVTAVA78二聚体的构象分布；Yoon等101采用常规分子动力学模拟揭示了短肽71VTGVTAVAQKTV82四聚体的自发组装过程。微管结合域是 Tau 蛋白纤维化的关键区域。Ganguly等102通过副本交换方法揭示了位于微管结合域的R2和R3片段形成的同源和异源二聚体的分子间相互作用模式和构象分布。最近，我们针对R3片段二聚体和肝素的混合物开展了副本交换分子动力学模拟，结果表明肝素能增强PHF6片段（306VQIVYK311）之间疏水、芳香堆积相互作用，从而促进R3的自聚集103。3.3 机器学习方法结合分子动力学模拟实现对蛋白构象的高效采样近年来，随着蛋白质数据库的不断增大，以及计算机算力的提升，机器学习方法也开始被用于研究神经退行性疾病相关蛋白的构象特性。例如周焕祥课题组104以聚谷氨酰胺Q15、A40和细胞壁水解酶 ChiZ 三种天然无序蛋白为研究对象，根据短时间分子动力学模拟得到的构象，利用神经网络和自编码器方法生成更加完整的构象空间，其预测结果得到了长时间分子模拟结果的验证104。Jin等105结合分子动力学模拟、主成分分析和机器学习方法预测了聚丙氨酸Ala13和钙调蛋白在原训练集中不存在的合理构象。这些工作为进一步利用机器学习方法实现蛋白质（尤其是无序蛋白）构象空间高效采样迈出了重要一步。4 神经退行性疾病相关蛋白液液相分离的研究进展蛋白质除了能够聚集形成固态病理性纤维外，还能发生液液相分离形成液态凝聚物。生物分子的液液相分离是细胞核仁、应激颗粒等多种无膜细胞器形成的主要驱动力，具有重要生物学意义。2009年，Brangwynne等106发现重要细胞器P颗粒具有流动、融合、荧光恢复等液态性质。2012年Li等107和Kato等108分别在体外实验中观察到了蛋白质和RNA通过液液相分离形成的小液滴。之后，该领域迎来了爆发式发展，越来越多的蛋白被发现具有相分离能力。此外，蛋白质相分离的生理功能被不断发现，例如适应性和先天性免疫信号传导、应激颗粒组装、异染色质形成和转录等109。除此之外，越来越多的研究表明，神经退行性疾病相关蛋白（如 Syn、TDP-43、Tau 等）具有较强的液液相分离能力，且它们的液态凝聚物会在病理条件下发生液固相变，形成有细胞毒性的固态淀粉样纤维。蛋白质的液液相分离及其与病理性聚集的关系已成为当今物理学和生命科学等交叉领域的研究前沿和热点。图4给出了几种无膜细胞器及几种典型蛋白形成的小液滴的形貌。598第 4 卷 4.1 研究蛋白质液液相分离的实验方法判断蛋白质溶液发生相分离的常见实验方法包括浊度（turbidity）试验和微分干涉差（differential interference contrast，DIC）显微镜。浊度可以用于表征蛋白分子形成凝聚物的能力，而 DIC常用于观察蛋白质相分离形成的小液滴形貌。在这些实验中，通常需要添加例如聚蔗糖（ficoll）、聚乙二醇（PEG）、葡聚糖（dextran）等聚合物作为拥挤剂，以模拟细胞中的拥挤环境116。浊度和显微实验操作简单，可以实现高通量筛选特定蛋白发生液液相分离的环境条件。例如，刘聪课题组117建立了一种高通量筛选蛋白质相分离能力的方法（HiPPS），并系统研究了溶液环境对30多种蛋白质相分离能力的影响。TEM、AFM等方法不仅能用于观察小液滴形貌，还能在纳米尺度精确测量其尺寸。随着共聚焦显微（confocal microscopy）和超分辨率成像（super-resolution imaging）技术的不断发展，可以直接观察细胞中形成的蛋白质凝聚物的位置和形貌，例如 hnRNPA1118、C9orf72编码的二肽重复片段（PR20、GR20）119、FUS115、Tau120、TDP-43121-122、Syn123等。值得注意的是，上述方法要求冷凝物中的蛋白质必须先经过抗体染色或荧光标记。表征蛋白质液态凝聚物的物化性质（包括黏度、表面张力、流动性、密度、蛋白质的二级结构等），对理解蛋白质液液相分离的物理机制具有重要意义。在体外实验中，确定聚集体物态性质的最直接的途径是测量小液滴的黏度和表面张力124。光成像的技术可以用来表征凝聚物流动性的强弱，例如光漂白荧光损失实验（fluorescence loss in photobleaching，FLIP）、光漂白荧光恢复实验（fluorescence recovering after photobleaching，FRAP）、荧光关联光谱（fluorescence correlation spectroscopy，FCS）等10。其 中 最 常 用 的 是FRAP实验125，它已经被广泛应用于区分蛋白质聚集形成的液态和固态聚集体，以及表征小液滴的成熟（即由液态向固态转变）过程109，126。FRET方法常用来表征蛋白质发生相分离过程中的构象变化；ThT荧光和CD谱用来研究蛋白质在发生相分离过程中二级结构的变化。此外，拉曼光谱127-128也被用于表征蛋白质在发生相分离前后的构象转变。4.2 神经退行性疾病相关蛋白液液相分离的实验研究多种神经退行性疾病相关蛋白既能发生病理性聚集形成固态淀粉样纤维，也能发生液液相分离形成液态凝聚物。例如Syn、TDP-43和Tau蛋白均同时具有纤维化和相分离能力。生理条件下Syn蛋白以富含螺旋的单体形式与神经囊泡结合，参与囊泡形状调节、神经递质释放、化学信号传递等生理功能；在病理情况下它会发生异常聚集，形成具有毒性的寡聚体或纤维。2020年 Ray等5首次在体外实验中观察到了 Syn形成