适制宁红茶茶树品种的可溶态...膜结合态多酚氧化酶特性比较_占坤.pdf

茶叶科学 2023，43（3）：356366 Journal of Tea Science www.tea- 收稿日期：2023-02-12 修订日期：2023-04-20 基金项目：江西省教育厅科技计划项目（GJJ190167）、国家自然科学基金项目（32160725）作者简介：占坤，男，在读本科生，主要从事茶树生理生化方向研究。*通信作者： 适制宁红茶茶树品种的可溶态和膜结合态 多酚氧化酶特性比较 占坤1，杨正利1，徐子怡1，赖章凤1，李军2，陈罗君2，周四喜3，李明玺1，甘玉迪1*1.江西农业大学农学院，江西 南昌 330045；2.修水县茶叶科学研究所，江西 九江 332400；3.江西省宁红集团有限公司，江西 九江 332400 摘要：为探究适制宁红茶茶树品种多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）的酶学性质，提高宁红茶茶黄素含量，以宁州群体种、宁州 2 号、大叶龙品种的一芽二叶鲜叶为试验材料，获取膜结合态多酚氧化酶（Membrane-bound polyphenol oxidase，mPPO）和可溶态多酚氧化酶（Soluble polyphenol oxidase，sPPO）粗酶，并进行酶学性质分析。以邻苯二酚为底物，3 个茶树品种 mPPO 比活力均高于 sPPO 比活力，大叶龙 mPPO比活力最高，为(542.5925.13)Umg-1，宁州 2 号的 sPPO 比活力最低，为(112.5714.01)Umg-1。mPPO 最适反应温度在 4060，sPPO 最适反应温度在 3050，宁州 2 号和大叶龙的 mPPO 最适反应温度最高均为55，宁州 2 号和宁州群体种的 sPPO 最适反应温度最低为 35。sPPO 最适 pH 值在 7.008.50，有 1 个峰，而 mPPO 最适 pH 值在 5.008.00，有 2 个峰，宁州群体种的 sPPO 最适 pH 值为 8.00，宁州 2 号 mPPO 最适 pH为 5.50。mPPO 和 sPPO 对二羟基酚有较强亲和力，其中宁州 2 号 mPPO 对邻苯二酚亲和力最强，催化效率最高。抗坏血酸对宁州群体种 sPPO 抑制效果最好，卤化物抑制剂对适制宁红茶茶树品种 sPPO 与 mPPO 活性均无抑制作用，EDTA 对适制宁红茶茶树品种 mPPO 均有活化作用。适制宁红茶茶树品种 sPPO 和 mPPO 的热失活遵循一级反应动力学规律，大叶龙 mPPO 耐热性最好，热敏感性最差，对温度敏感性最弱，而宁州群体种sPPO 耐热性最差，热敏感性最强，对温度敏感性最强。结果表明，不同茶树品种间 sPPO 和 mPPO 酶特性有一定差异，大叶龙品种 mPPO 比活力最高，耐热性最好，可为高茶黄素宁红茶加工提供合适酶源。关键词：宁红茶；多酚氧化酶；酶学性质 中图分类号：S571.1，TS272.5+2 文献标识码：A 文章编号：1000-369X(2023)03-356-11 Comparison of Soluble and Membrane-bound Polyphenol Oxidase from Cultivars Suitable to Ninghong Tea Production ZHAN Kun1,YANG Zhengli1,XU Ziyi1,LAI Zhangfeng1,LI Jun2,CHEN Luojun2,ZHOU Sixi3,LI Mingxi1,GAN Yudi1*1.College of Agronomy,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China;2.Xiushui Tea Science Research,Jiujiang 332400,China;3.Jiangxi Ninghong Group Limited Company,Jiujiang 332400,China Abstract:In order to investigate the enzymatic properties of polyphenol oxidase(PPO)in cultivars suitable for DOI:10.13305/ki.jts.2023.03.0033 期 占坤，等：适制宁红茶茶树品种的可溶态和膜结合态多酚氧化酶特性比较 357 Ninghong tea production,as well as to increase the theaflavin content in Ninghong tea,one bud and two fresh leaves from Ningzhou population,Ningzhou 2 and Dayelong were used as raw materials to obtain membrane-bound polyphenol oxidase(mPPO)and soluble polyphenol oxidase(sPPO)crude enzymes and to analyze the enzymatic properties.Using catechol as the substrate,the mPPO specific activity of each cultivar was higher than sPPO specific activity.mPPO specific activity of Dayelong was the highest(542.5925.13 Umg-1),and sPPO activity of Ningzhou 2 was the lowest(112.5714.01 Umg-1).The optimum reaction temperature for mPPO was 40-60,the optimum reaction temperature for sPPO was 30-50,and the highest optimum reaction temperature for mPPO of Ningzhou 2 and Dayelong was 55.The lowest sPPO optimum reaction temperature for Ningzhou 2 and Ningzhou population was 35.The optimum pH of sPPO ranged from 7.00-8.50 with one peak,while the optimum pH of mPPO ranged from 5.00-8.00 with two peaks.The optimum pH of sPPO in Ningzhou population was 8.00,and the optimum pH of mPPO in Ningzhou 2 was 5.50.mPPO and sPPO had strong affinity for dihydroxy phenols,and mPPO in Ningzhou 2 had the strongest affinity for catechol and the highest catalytic efficiency.Ascorbic acid had the best inhibitory effect on sPPO in Ningzhou population.While halide inhibitors had no inhibitory effect on both sPPO and mPPO activities in tea cultivars suitable for Ninghong tea production.EDTA had an activating effect on mPPO.The thermal deactivation of sPPO and mPPO in these tea cultivars followed the primary reaction kinetics,with mPPO in Dayelong having the best thermal resistance,the worst thermal sensitivity,and the weakest sensitivity to temperature.While sPPO in Ningzhou population had the worst thermal resistance.The sPPO of Ningzhou population was the worst heat-resistance,the highest heat-sensitivity and temperature-sensitivity.The results show that there were some differences in the sPPO and mPPO enzyme properties among the cultivars.Tea cultivar Dayelong had the highest mPPO specific activity and the best heat resistance,which provided a suitable enzyme source for the processing of high theaflavin Ninghong tea.This study also provided a theoretical reference for the actual Ninghong tea production.Keywords:Ninghong tea,polyphenol oxidase,enzymatic properties 宁红茶是江西省茶叶“四绿一红”中的“一红”，也是我国最早的传统工夫红茶之一，具有滋味甜醇，香高持久，叶底红亮等品质特征，受到众多消费者青睐1。在红茶加工过程中，多 酚 氧 化 酶（Polyphenol oxidase，PPO，EC1.10.3.1）是参与茶叶变色的关键酶2，能够催化多酚类物质生成茶黄素类物质，对红茶品质形成起着重要作用3-4。茶树品种是决定茶叶品质重要因素之一，茶树良种是茶叶优质、高产的基础5。宁红茶主产区九江市修水县，适制茶树品种有国家级良种宁州群体种和宁州 2 号，以及修水县茶叶科学研究所宁州群体种品种园突变的无性系繁殖株系大叶龙6等，分析适制宁红茶茶树品种 PPO 酶学特性对茶叶品质提升具有实际生产意义。PPO 是由多基因控制的蛋白酶，不同品种间 PPO 存在较高遗传多样性，有大量单核苷酸多态性（SNP）位点，品种间含有差异突变位点，可能导致品种间 PPO 活性和酶学性质存在较大差异7-8。已有研究表明，不同葡萄品种 PPO 对邻苯二酚亲和力存在差异性9，不同品种马铃薯 PPO 最适温度、pH 等都有差异10，不同品种苹果 mPPO 表现出显著不同的特性11。不同茶树品种 PPO 性质已有诸多研究，如福鼎大白茶和金观音 PPO 活性显著高于英红 9 号、槠叶齐12；春季采摘期，福鼎大白茶 PPO 活性呈现显著上升趋势，白叶 1号 PPO 活性偏低，黄金芽、紫鹃、龙井 43 的PPO 活性变化趋势一致13。PPO 在细胞中以可溶态（sPPO）和膜结合态（mPPO）两种形式存在14。sPPO 和 mPPO的合成和运输是一个非常复杂的过程，PPO 进入叶绿体前会在细胞质中合成 PPO 前体肽，PPO 前体肽先依赖 ATP 导入叶绿体基质，再358 茶 叶 科 学 43 卷 通过基质肽酶将其进一步加工，然后依靠光进入到管腔形成成熟的 PPO，即 sPPO，而前体肽 则 被 转 运 肽 转 运 至 内 囊 体 膜 上 形 成mPPO15-17。植物体内 sPPO 直接参与酚类物质化学反应，mPPO 要在细胞膜结构被破坏后才能被释放出来进行反应18。sPPO 和 mPPO酶学性质差异较大，两者对不同底物、不同抑制剂等都有较大差异。宁红茶风味独特，但目前对宁红茶品质形成机理相关研究较少，适制宁红茶茶树品种的 sPPO 和 mPPO 酶学活性比较也鲜见报道。本研究拟通过对适制宁红茶茶树品种的 sPPO 和 mPPO 进行酶学性质分析，确定高 PPO 酶活性宁红茶茶树品种，助力高茶黄素宁红茶生产。1 材料与方法材料与方法 1.1 材料与仪器 宁州群体种、宁州 2 号、大叶龙茶树品种鲜叶于 2022 年 7 月 19 日上午 8 时采摘自九江市修水茶叶生态科技园种质资源圃，宁州群体种树龄 60 a、大叶龙树龄 20 a、宁州 2 号树龄40 a，鲜叶采摘标准均为一芽二叶，采摘后立即用液氮冷冻并置于80的冰箱冷藏。醋酸钠、交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、抗坏血酸、氯化钠、乙二胺四乙酸（EDTA）、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、苯甲基磺酰氟、Triton X-100、Tris-HCl、硫酸铵、叔丁醇、邻苯二酚、绿原酸、愈创木酚、没食子酸、咖啡酸、冰醋酸等均为分析纯，购自于北京索莱宝科技有限公司。SpectraMax-M2 酶标仪，美谷分子仪器（上海）有限公司；Centrifuge 5920 R 冷冻离心机，德国 Eppendorf 公司；DK-98-IIA 型恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；pH400 台式 pH 计，安莱立思仪器科技（上海）有限公司。1.2 mPPO 和 sPPO 粗酶提取 取茶树鲜叶 10 g，按照料液比 12 加入含有 2%（W/V）PVPP、30 mmolL-1抗坏血酸、1 mmolL-1 EDTA 的 50 mmolL-1磷酸盐缓冲液（pH 6.80），冰浴充分研磨，所得浆液在 4 浸提12 h，随后在4、8 000 rmin-1离心30 min。收集的上清液即为 sPPO 粗酶液。PPO 粗酶提取参考刘芳等19方法，用去离子水冲洗提取的 sPPO 滤渣 5 次，然后将其溶解于含有0.25%Triton X-100的50 mmolL-1 Tris-HCl 缓冲液（pH 6.8）中；将混合物搅拌2 min，进行 10 min 超声处理，在 4 下培养1 h，并在 8 000 rmin-1下离心 15 min。4 环境下静置 30 min，然后 35 水浴锅保温 15 min，在 25、8 000 rmin-1下离心 15 min。透明上清液即为 mPPO 粗酶液。1.3 酶含量与酶活性的测定 1.3.1 酶含量的测定 使用 Bradford 蛋白质浓度测定试剂盒，根据 BSA 蛋白标样制作标准曲线，并计算样品中的蛋白质浓度。利用 BSA 标样制作的标准曲线方程为 Y=3.04X0.51（R2=0.999）。1.3.2 酶活性的测定 反应混合物由 0.15 mL 0.20 molL-1邻苯二酚、1.25 mL 0.05 molL-1磷酸盐缓冲液（pH 6.80）和 0.10 mL 酶溶液组成。在 37 下静置 5 min，1 个单位的 PPO 酶活性（U）被定义为在 420 nm 波长条件下的吸光度每分钟0.001 单位的变化20。1.4 不同条件下适制宁红茶茶树品种酶学性质比较试验 1.4.1 最适温度测定 按照 1.3.2 章节方法，其他条件不变，将反应温度分别调整为 25、35、45、55、65、75、85，测定 mPPO 和 sPPO 酶活性。1.4.2 最适 pH 值测定 按照 1.3.2 章节方法，其他条件不变，分别在浓度为 50 mmolL-1的醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 分别为 3.50、4.00、4.50、5.00、5.50），磷酸盐缓冲液（pH 分别为 6.00、6.50、7.00、3 期 占坤，等：适制宁红茶茶树品种的可溶态和膜结合态多酚氧化酶特性比较 359 7.50），Tris-HCl 缓冲液（pH 8.00 和 pH 8.50）条件下，测定 sPPO 和 mPPO 酶活性。1.4.3 酶动力学参数的测定 分别配制浓度为 6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 mmolL-1和 200.00 mmolL-1的邻苯二酚溶液，测定不同底物浓度下酶的活性，绘 制 米 氏 曲 线，并 参 照 双 倒 数（Lineweaver-Burk）作图，得出直线 Y1=axb，其中纵截距值为 1/Vmax，斜率为 Km/Vmax，即 a/b21。1.4.4 底物特异性比较试验 分别配制 0.20 molL-1的邻苯二酚、绿原酸、愈创木酚、没食子酸和咖啡酸 5 种底物溶液与提取酶液反应，将底物为邻苯二酚时测定的活力大小设置为 100%，并按照 1.3.2 章节方法测定 sPPO 和 mPPO 酶活性。1.4.5 不同抑制剂条件下酶学性质比较试验 分别配制 5.00、50.00、100.00 mmolL-1的抗坏血酸、EDTA、草酸、柠檬酸、碘化钾、氯化钠，将 1.15 mL 0.05 molL-1磷酸盐缓冲液（pH 6.80）和 0.10 mL mPPO 或 sPPO 与 0.15 mL 0.20 molL-1邻苯二酚及 0.10 mL 抑制剂混合，按照 1.3.2 章节方法测定 sPPO 和 mPPO 酶活性。1.4.6 mPPO 和 sPPO 热失活动力学分析试验 在不同温度（45、55、65 和 75）和不同时间（10、20、30、40、50 min 和 60 min）下，将 0.10 mL mPPO 或 sPPO 装入试管中进行处理。待样品温度恢复室温后，通过公式16 测定残余活性22。Ra=AtA0 100%（1）logAA0=k2.303t（2）t1/2=ln2k（3）D=2.303k（4）lnk=lnk0+EaR（1T01T）（5）logD=logD0（T-T0）ZT（6）式中，A0是初始多酚氧化酶活性；At是时间 t 时的剩余多酚氧化酶活性；t1/2为多酚氧化酶的失活半衰期（min）；k 为热失活速率（min-1）；D 是酶降低至 10%活性所需要的时间（min）；ZT值表示 D 值对温度的敏感性，即 D 值变化一个对数时对应的温度变化；T值为热力学温度（K）；Ea表示多酚氧化酶的反应活化能（kJmol-1）；R 是理想气体常数（8.314 Jmol-1K-1）。1.5 统计分析 采用 Origin 8.0 绘图，SPSS 20.0 进行统计学分析，数据以平均值标准差（xSD）表示。采用邓肯法进行多重差异比较，当 P0.05 认为有统计学显著差异。2 结果与分析结果与分析 2.1 不同茶树品种 PPO 比活力比较 如表 1 所示，以邻苯二酚为底物，不同茶树品种 mPPO 比活力均高于 sPPO 比活力。不同品种间 mPPO 比活力相差较大，大叶龙mPPO 比活力最高，分别约为宁州 2 号和宁州群体种 mPPO 比活力的 2.02 倍和 2.15 倍。不同品种间 sPPO 比活力相差较小，大叶龙 sPPO比活力最高，为(262.7112.59)Umg-1，宁州2号sPPO比 活 力 最 低，为(112.57 14.01)Umg-1。2.2 不同茶树品种 PPO 最适温度比较 如图 1 所示，不同茶树品种 mPPO和 sPPO酶活性随温度的升高呈现先升后降的变化趋势。mPPO 最适反应温度在 4060，宁州 2号 和 大 叶 龙 的 mPPO 最 适 反 应 温 度 均 为55，宁州群体种 mPPO 最适反应温度为45。75 时，宁州群体种和宁州 2 号 mPPO均出现小峰。sPPO 最适反应温度在 3050。宁州 2 号和宁州群体种 sPPO 酶活性变化趋势360 茶 叶 科 学 43 卷 基本一致，最适反应温度为 35，大叶龙sPPO 最适反应温度为 45。2.3 不同茶树品种 PPO 最适 pH 比较 mPPO 与 sPPO 在 pH 3.009.00 范围内酶活变化分别如图 2 所示。mPPO 酶活性随 pH 升高，先上升后下降，再上升后下降，呈现出双峰型，最适 pH 在 5.008.00。宁州群体种和大叶龙 mPPO 最适 pH 均为 6.00，宁州 2 号mPPO 最适 pH 为 5.50，大叶龙和宁州 2 号mPPO 在 pH 7.00 出现第二个峰值，宁州群体种 mPPO 在 pH 7.50 出现第二个峰值。sPPO 表 1 不同茶树品种 mPPO 与 sPPO 比活力比较 Table 1 Comparison of the specific vitalities of mPPO and sPPO in different tea cultivars 品种 Cultivar 酶 Enzyme 蛋白含量/mgg-1 Protein content 酶活/U Enzyme activity 比活力/Umg-1 Enzyme specific activity 宁州群体种 Ningzhou population sPPO(27.931.16)10-3 5.100.43 182.7319.59 mPPO(19.170.34)10-3 4.840.22 252.697.27 大叶龙 Dayelong sPPO(30.271.16)10-3 7.950.07 262.7112.59 mPPO(20.077.52)10-3 10.890.09 542.5925.13 宁州 2 号 Ningzhou 2 sPPO(39.043.71)10-3 4.400.50 112.5714.01 mPPO(20.130.46)10-3 5.410.08 268.922.31 图 1 不同茶树品种在不同温度下 mPPO 和 sPPO 酶活性的比较 Fig.1 Comparison of mPPO and sPPO enzyme activities of different tea cultivars under different temperatures 宁州群体种 NingZhou popul 大叶龙 Da Yelong 宁州2号 Ningzhou 2B 20 30 40 50 60 70 80 90 酶活性/Amin-1mL-1 Enzymatic activity 0.180.160.140.120.100.080.060.040.020温度 Temperature/sPPOA 宁州群体种 NingZhou popula 大叶龙 Da Yelong 宁州2号 Ningzhou 2 20 30 40 50 60 70 80 90酶活性/Amin-1mL-1 Enzymatic activity 0.400.350.300.250.200.150.100.050温度 Temperature/mPPO 宁州群体种 Ningzhou population大叶龙 Dayelong 宁州 2 号 Ningzhou 2 图 2 不同茶树品种在不同 pH 下 mPPO 和 sPPO 酶活性的比较 Fig.2 Comparison of mPPO and sPPO enzyme activities of different tea cultivars under different pH 宁州群体种 NingZhou popula 大叶龙 Da Yelong 宁州2号 Ningzhou 2A 3 4 5 6 7 8 9酶活性/Amin-1mL-1 Enzymatic activity 0.180.160.140.120.100.080.060.040.020pH mPPO 大叶龙 Da Yelong 宁州2号 Ningzhou 2B 宁州群体种 Ningzhou population大叶龙 Dayelong 宁州 2 号 Ningzhou 2 3 4 5 6 7 8 9酶活性/Amin-1mL-1 Enzymatic activity 0.140.120.100.080.060.040.020pH sPPO3 期 占坤，等：适制宁红茶茶树品种的可溶态和膜结合态多酚氧化酶特性比较 361 酶活性随 pH 升高先上升再下降，呈现单峰型，sPPO 最适 pH 值在 7.008.50，大叶龙和宁州2 号 sPPO 最适 pH 值为 7.50，宁州群体种最适 pH 值为 8.00。2.4 不同茶树品种 PPO 的底物特异性 如图 3 所示，各茶树品种 sPPO 和 mPPO对二羟基酚亲和力较高，其中，对邻苯二酚亲和力最强，宁州 2 号 mPPO 对邻苯二酚亲和力最强。以咖啡酸为底物，宁州 2 号、宁州群体种和大叶龙的 mPPO 酶活性相对较高。以绿原酸和没食子酸为底物，mPPO 和 sPPO 的酶活性比以咖啡酸为底物低。各茶树品种 sPPO 和mPPO 对一羟基酚愈创木酚亲和力较弱。2.5 抑制剂对不同茶树品种 PPO 活性的影响 如表 2 所示，在不同抑制剂作用下 PPO活性差异显著，在抗坏血酸和草酸作用下 PPO活性差异较显著。抗坏血酸对 sPPO 抑制效果最好，尤其是宁州群体种 sPPO，半抑制浓度（Half maximal inhibitory concentration，IC50）值为(2.980.13)。螯合剂类型的抑制剂，EDTA、草酸、柠檬酸对酶活性的抑制效果有较大的差别，EDTA 对大叶龙 sPPO 抑制效果最弱，IC50值为(25.740.05)，而 EDTA 对适 制宁红茶茶树品种 mPPO 均有活化作用。草酸、柠檬酸对各品种 sPPO 与 mPPO 酶活性有不同程度的抑制作用。卤化物抑制剂碘化钾、氯化钠对 sPPO 与 mPPO 活性均无抑制作用。2.6 不同茶树品种的 PPO 动力学分析 图 4、图 5 分别为以邻苯二酚为底物，mPPO 与 sPPO 活性倒数与底物浓度倒数的线性回归结果，宁州群体种 mPPO 和 sPPO 米氏方程分别为 Y=1 613.24X+15.95、Y=952.55X+18.90，大叶龙 mPPO 和 sPPO 米氏方程分别为 Y=6 188.95X+27.62、Y=4 396.45X+20.88，宁州 2 号 mPPO 和 sPPO 米氏方程分别为 Y=376.09X+10.87、Y=2 161.55X+20.45。表 3 为mPPO 与 sPPO 的酶动力学参数，Km数值反应酶和底物亲和能力大小，Km越小亲和力越强，不同品种 mPPO 与 sPPO 的 Km差别较大，宁州 2 号 mPPO 的 Km最小为 34.60 mmolL-1，大叶龙 mPPO 的 Km最大为 224.04 mmolL-1，宁州 2 号 mPPO 与邻苯二酚结合能力最强。宁州 2 号 mPPO 的 Vmax最大为 9.2010-2 Amin-1，大叶龙 mPPO 的 Vmax最小为 3.6210-2 Amin-1。宁州 2 号 mPPO 的 Vmax/Km值最大为 265.89，催化效率最高。邻苯二酚绿原酸咖啡酸没食子酸愈创木酚0.00.51.01.5酶的活性/%Enzyme activity 宁州群体种（mPPO）NingZhou population(mPPO)宁州群体种（sPPO）NingZhou population(sPPO)大叶龙（mPPO）Da Yelong(mPPO)大叶龙（sPPO）Da Yelong(sPPO)宁州2号（mPPO）Ningzhou(mPPO)宁州2号（sPPO）Ningzhou(sPPO)Catechol Chlorogenic acid Caffeic acid Gallic acid Guaiacol图 3 不同茶树品种在不同底物下酶活性的比较 Fig.3 Comparison of enzyme activities in different tea cultivars under different substrates 底物 Susbstrate 362 茶 叶 科 学 43 卷 表 2 抑制剂对不同茶树品种酶活力的抑制参数比较 Table 2 Comparison of inhibition parameters of inhibitors on enzyme activity in different tea cultivars 抑制剂类型 Inhibitor type 抑制剂 Inhibitor IC50/mmolL-1 mPPO sPPO 宁州群体种 大叶龙 宁州 2 号 宁州群体种大叶龙 宁州 2 号 还原剂 Reducing agent 抗坏血酸 11.280.08b10.980.15a10.860.31a2.980.13d 3.470.04c 3.190.25d 螯合剂 Chelating agent EDTA+24.690.36a25.740.05a 24.930.18a草酸 10.690.54b10.070.36b10.200.19a8.760.13c 9.310.45b 8.320.16c 柠檬酸 12.890.13a11.670.52a10.980.54a11.670.55b9.910.31b 10.060.28b卤化物 Halide 碘化钾 氯化钠 注：“+”表示在试剂作用下酶活性增加，“”表示即使在 100 mmolL-1的浓度下仍无抑制作用 Note:“+”means enzyme activity increases under the action of reagents.“”means no inhibition detected even at the concentration of 100 mmolL-1 表 3 不同茶树品种中 sPPO 与 mPPO 的酶动力学参数 Table 3 Enzyme kinetic parameters of sPPO and mPPO in different tea cultivars 品种 Cultivar 酶 Enzyme Km/mmolL-1 Vmax/Amin-1 Vmax/Km 宁州群体种 Ningzhou population sPPO 50.39 5.2910-2 104.9810-5 mPPO 101.15 6.2710-2 61.9810-5 宁州 2 号 Ningzhou 2 sPPO 105.70 4.8910-2 46.2610-5 mPPO 34.60 9.2010-2 265.8910-5 大叶龙 Dayelong sPPO 210.59 4.7910-2 22.7410-5 mPPO 224.04 3.6210-2 16.1510-5 2.7 不同茶树品种 PPO 的热失活动力学比较 不同茶树品种 sPPO 与 mPPO 热失活的一级动力学模型参数如表 4 所示，4575 各品种 sPPO 与 mPPO 的失活速率常数 k、半衰期t(1/2)存在显著差异。sPPO 与 mPPO 的 k 值随着温度升高而增大，表明 sPPO 和 mPPO 随温度升高失活速率越快，sPPO 和 mPPO 高温条件下不耐热。半衰期 t(1/2)、D 值是酶稳定性的重要参数23，75 时，sPPO 的 k 值均比 mPPO大，sPPO 的半衰期 t(1/2)、D 值均比 mPPO 小，mPPO 比 sPPO 耐热性更好。大叶龙 mPPO 失活速率常数 k 最低为(41.883.16)10-3 min-1，图 4 不同茶树品种的 mPPO 活性的米氏曲线（A）和 Lineweaver-Burk（B）图 Fig.4 Michaels curves(A)and Lineweaver-Burk plots(B)of mPPO activity of different tea cultivars宁州2号 Ningzhou 2大叶龙 Da YelongA0 50 100 150 200反应速度 V/Amin-1 0.0400.0350.0300.0250.0200.0150.0100.0050底物浓度 S/mmolL-1A Y=376.09X+10.87(R2=0.9977)Y=1613.24X+15.95(R2=0.9976)Y=6188.95X+27.62(R2=0.9985)大叶龙 Da Yelong 宁州2号 Ningzhou 2B宁州群体种 Ningzhou population宁州 2 号 Ningzhou 2 大叶龙 Dayelong 0 0.04 0.08 0.12 0.161/反应速度 1/V 100080060040020001/底物浓度 1/S/Lmmol-1 B3 期 占坤，等：适制宁红茶茶树品种的可溶态和膜结合态多酚氧化酶特性比较 363 宁州群体种 sPPO 失活速率常数 k 最高，比大叶龙 mPPO 失活速率常数 k 高 2 倍，为(92.429.31)10-3 min-1。大叶龙 mPPO 半衰期t(1/2)=(17.684.61)min，D=(58.735.31)min 均为 最 高，而 宁 州 群 体 种sPPO半 衰 期t(1/2)=(8.963.66)min，D=(29.762.15)min 均为最低，表明大叶龙 mPPO 耐热性最好，宁州群体种 sPPO 耐热性最差。Ea值反映酶构象结构稳定性，ZT值表明酶对温度的敏感性24-25。不同品种 sPPO 的Ea值在 59.24131.86 kJmol-1，mPPO 的 Ea值在 39.3579.38 kJmol-1，sPPO 比 mPPO 热稳定性更强，宁州群体种 sPPO 的 Ea值最高为131.86 kJmol-1，大叶龙 mPPO 的 Ea值最低为39.35 kJmol-1，宁州群体种 sPPO 热敏感性最强，大叶龙 mPPO 热敏感性最差。mPPO 的ZT值在 38.9361.50，sPPO 的 ZT值在19.2647.57，sPPO 比 mPPO 对温度敏感性更强，大叶龙 mPPO 的 ZT值为 61.50，表明大叶龙 mPPO 对温度敏感性最弱，宁州群体种 sPPO 对温度敏感性最强。表 4 不同茶树品种 sPPO 与 mPPO 失活的一级动力学模型参数 Table 4 First-order kinetic model of sPPO and mPPO inactivation in different tea cultivars 热失活参数 Thermal deactivation parameter 温度/Temperature mPPO sPPO 宁州群体种 大叶龙 宁州 2 号 宁州群体种 大叶龙 宁州 2 号 失活速率常数 k/10-3 min-1 45 19.092.09c 12.623.81c 22.563.38b 12.631.96c 19.654.96c 21.032.87b 55 35.913.86b 16.585.03c 23.118.24b 21.032.87c 33.222.64bc 24.046.37b 65 40.473.99b 32.104.50b 32.497.16b 41.747.71b 40.1714.50ab 29.187.28b 75 69.613.15a 41.883.16a 47.237.53a 92.429.31a 56.749.30a 52.446.68a 半衰期 t(1/2)Half-life/min 45 36.684.36a 46.025.57a 33.335.06a 56.059.66a 37.179.68a 33.464.61a 55 19.492.26b 45.867.23a 32.8910.60ab33.464.61c 23.047.45b 30.196.46a 65 19.117.22b 21.953.17ab22.114.39bc 18.465.65c 18.6