巨大侧耳原生质体制备条件的优化.pdf

.():/.:./.骈永茹 李婧怡 李勤奋 等.巨大侧耳原生质体制备条件的优化.广西植物():.():.巨大侧耳原生质体制备条件的优化骈永茹 李婧怡 李勤奋 王 欢 李 玉 杨 阳(.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业农村部热带农业绿色低碳重点实验室 海口 .华中农业大学植物科学技术学院应用真菌研究所 武汉 .国家农业环境儋州观测实验站 海南 儋州.长春中医药大学 长春 .吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心 长春 )摘 要:为优化巨大侧耳原生质体的制备条件该研究以两株不同温型的巨大侧耳菌株 和 为材料采用单因素和正交试验方法对原生质体制备的菌丝体菌龄、稳渗剂种类、溶壁酶浓度、酶解温度和酶解时间进行研究 结果表明:()在单因素实验中巨大侧耳原生质体制备的适宜条件为菌龄 溶壁酶浓度.甘露醇()或 ()酶解 ()正交试验验证并优化了单因素实验结果组合(菌龄 溶壁酶浓度.的甘露醇 酶解 )可同时作为 和 原生质体制备的最适条件原生质体产量分别为.和.()检验中各因素对原生质体制备的影响程度依次为菌龄溶壁酶浓度酶解温度酶解时间()菌龄酶解时间酶解温度溶壁酶浓度()综上所述两株不同温型巨大侧耳菌株的原生质体制备条件基本一致菌龄对两菌株原生质体得率的影响程度最显著 该研究结果可为后续巨大侧耳的杂交育种、遗传转化、全基因组测序等工作奠定基础进一步推动巨大侧耳分子遗传学的发展关键词:巨大侧耳 不同温型 热区 原生质体产量 制备条件中图分类号:文献标识码:文章编号:()(.)收稿日期:基金项目:海南省自然科学基金()中央级公益性科研院所基本科研业务费专项()第一作者:骈永茹()硕士研究生研究方向为食用菌遗传育种().通信作者:杨阳博士助理研究员研究方向为食用菌种质资源评价和遗传育种().:().:().()().().(.).()()().:巨大侧耳()是国内开发的一种珍稀食用菌其口感和风味独特有猪肚般的滑腻因而具有商品名“猪肚菇”(董洪新等 .)巨大侧耳营养丰富富含多糖、蛋白质、粗纤维等营养物质并且具有抗炎、抗肿瘤、抗真菌、保护肝脏等多种药用功效深受消费者喜爱(.)于海龙等()研究发现巨大侧耳环境适应性强、生物学转化率高并且适宜在温度较高的夏季栽培对调节食用菌市场供应和反季节栽培特别是热区食用菌生产具有重要意义随着栽培面积的不断扩大巨大侧耳的遗传育种工作尤为重要(吴碧君)原生质体是指完整细胞去除细胞壁后裸露出的一个具有生理功能的圆球体仍含有整套的遗传信息并且具有较好的生理活性是食用菌分子遗传学研究的良好材料()近年来原生质体单核化技术已成功应用到食用菌生理生化、菌种复壮、遗传转化、遗传育种和全基因组测序等工作 中(.刘海娟)极大地推进了食用菌研究的深入开展 因此对巨大侧耳原生质体制备进行系统研究有助于进一步推进巨大侧耳遗传育种工作的开展目前关于原生质体的制备在糙皮侧耳(.)、刺芹侧耳(.)、黄白侧耳(.)、灵芝(李钦艳等)、木耳(崔玮洁等)和双孢蘑菇(李良敏等)等多个食用菌物种中得到广泛研究崔玮洁等()研究发现原生质体的制备属于一种酶促反应过程其影响因素十分复杂不同菌株甚至同一菌株不同生理状态下其原生质体制备条件也不尽相同 苏文英等()发现菌龄是原生质体制备的重要因素玉木耳菌株在不同菌龄下其原生质体制备条件存在较大差异 彭智华等()基于单一变量原则对 株野生巨大侧耳菌株的原生质体分离条件进行研究发现原生质体产量会受到酶解液、稳渗剂、菌龄和 的影响并筛选到适宜的原生质体制备条件但其制备率和再生率仍不高 邹彰毅和邓百万()、孙佳星等()基于正交试验和响应面法进一步优化了单因素结果分别获得了姬松茸和玉木耳原生质体制备的最优条件极大地提高了原生质体产量和质量 可见原生质体的制备受到多种因素的影响且各因素间的交互作用也十分重要 然而关于巨大侧耳原生质体制备的研究较少各因素对原生质体产量的影响程度及各因素间的交互作用也尚不明确在一定程度上限制了巨大侧耳遗传育种工作的快速发展因此本研究以前期筛选到的两株不同温型 期骈永茹等:巨大侧耳原生质体制备条件的优化的巨大侧耳菌株为材料采用单因素和正交试验的方法对巨大侧耳原生质体制备中的菌丝体菌龄、溶壁酶浓度、稳渗剂种类、酶解温度和时间共 个关键影响因子进行研究 以期明确两株不同温型巨大侧耳菌株的原生质体制备条件及差异针对性提高巨大侧耳原生质体制备效率 本研究结果可为进一步开展巨大侧耳的杂交育种、全基因组测序和品种改良等奠定良好基础进而有效推动巨大侧耳遗传育种工作的深入开展材料与方法.材料两株不同温型的巨大侧耳菌株分别为高温型菌株 和中温型菌株(表)菌种现保存于中国热带农业科学院环境与植物保护研究所菌种保藏中心表 两株巨大侧耳菌株的信息 菌株来源类型出菇温度()序列号 .海南省栽培海南省栽培 液体培养基:麦芽糖 葡萄糖 酵母浸粉 加水混匀后定容至 再生培养基:麦芽糖 葡萄糖 酵母浸粉 琼脂 .甘露醇加水混匀后定容至 .方法.原生质体制备将活化好的菌丝体接入 液体培养基中于转速 、恒温暗培养 无菌条件下过滤菌丝体并先后用无菌水和稳渗剂(.的甘露醇)各冲洗 次 将菌丝体置于滤纸上吸干并称取 左右放入.离心管中加入 倍体积的.浓度的溶壁酶溶液(.溶壁酶 的.甘露醇)轻搅混匀后放入 的恒温金属浴中酶解 得到原生质体粗提液 用无菌脱脂棉过滤后 离心 倒掉上清液 用.的甘露醇轻轻冲洗管壁 次去除多余酶解液加入 的.甘露醇以悬浮沉淀制成原生质体原液.原生质体再生 用.的稳渗剂将原生质体原液稀释不同倍数并在血球计数板下计数 分别吸取 各稀释倍数的原生质体溶液均匀涂布到再生培养基上无菌水稀释的原生质体作对照 将实验组和对照组均置于 恒温暗培养每天观察菌落再生情况.单因素实验分别设置菌龄(、)、溶 壁 酶 浓 度(.、.、.、.、.)、稳渗剂种类(甘露醇、山梨醇、蔗糖、硫酸镁、氯化钾)、酶解温度(、)和酶解时间(、)共 个处理因素(崔玮洁等苏文英等)每个实验设置 次重复统计各因素对不同温型巨大侧耳菌株原生质体产量的影响.正交试验在单因素实验基础上分别选取菌龄、溶壁酶浓度、酶解温度和酶解时间为考察因素以原生质体产量为响应值组成 因素 水平的正交试验(表)以确定巨大侧耳原生质体制备的最适条件表 正交试验设计因素与水平 因素编码水平菌龄 ()溶壁酶浓度 ().酶解温度 ()酶解时间 ()结果与分析.原生质体的释放将两菌株的菌丝体置于溶壁酶溶液中在适宜温度下进行酶解 每隔半小时取一次样置于广 西 植 物 卷血球计数板中在显微镜下观察原生质体的释放情况 结果显示巨大侧耳的原生质体释放分为 个阶段(图):前期少量原生质体从菌丝体尖端释放中期部分菌丝体侧壁破裂原生质体从菌丝体侧面释放后期随着酶解时间的延长多数菌丝体细胞壁破裂大量原生质体释放出来.前期尖端释放.中期侧壁释放.后期大量释放.图 显微镜下原生质体释放的部分图片.单因素实验结果.菌丝体菌龄对原生质体制备的影响由图:可知巨大侧耳的原生质体产量随着菌龄的增加呈现先上升后下降的趋势 在 时和 的原生质体产量均达到最高分别为.和.且与其他菌龄的产量差异显著菌龄超过 后原生质体产量下降特别是 时原生质体产量最低且低于最开始 的产量分别为.和.综上可知两菌株制备原生质体的菌丝体最适菌龄为 .稳渗剂种类对原生质体制备的影响由图:可知不同稳渗剂中 的原生质体产量由高到低依次为甘露醇山梨醇蔗糖硫酸镁氯化钾最高产量为.其中甘露醇、山梨醇和蔗糖三者中的原生质体产量无显著差异但均显著高于硫酸镁和氯化钾 的原生质体产量由高到低依次为蔗糖甘露醇山梨醇氯化钾硫酸镁最高产量为.前三者产量无显著差异但均显著高于硫酸镁和氯化钾 可见稳渗剂类别对 和 的原生质体产量影响显著有机糖醇类稳渗剂甘露醇、山梨醇和蔗糖均为制备巨大侧耳原生质体的适宜稳渗剂.溶壁酶浓度对原生质体制备的影响由图:可知随着溶壁酶浓度的增加 和 的原生质体产量先增加后降低 当溶壁酶浓度为.时两菌株的原生质体产量均达到最高分别为.和.当浓度为.时原生质体产量下降且与.浓度的原生质体产量具有显著差异 可见制备巨大侧耳原生质体的最适溶壁酶浓度为.酶解温度对原生质体制备的影响 由图:可知随着酶解温度的升高 和 的原生质体产量呈现先增加后降低的趋势 当酶解温度为 时 的原生质体产量达到最高为.且与其他酶解温度差异显著 的原生质体产量也在 时达到最高为.但与、的原生质体产量无显著差异 综上可见 原生质体制备的最适酶解温度为 原生质体制备的适宜酶解温度较广为 .酶解时间对原生质体制备的影响 由图:可知 和 的原生质体产量随酶解时间的增加呈先上升后下降的趋势 当酶解时间为 时两菌株的原生质体产量均达到最高分别为 期骈永茹等:巨大侧耳原生质体制备条件的优化.和.但均与酶解时间 无显著差异当酶解时间大于 时原生质体产量显著下降 因此 为制备巨大侧耳原生质体的适宜酶解时间.菌龄.稳渗剂种类.溶壁酶浓度.酶解温度.酶解时间 不同小写字母、大写字母分别表示对、的原生质体产量有显著差异(.).(溶壁酶浓度 酶解温度酶解时间且各因素影响差异极显著(最优水平 最优组合 注:大写字母、分别表示菌龄、溶壁酶浓度、酶解温度和酶解时间 个因素 数字、分别表示对应因素的 个水平小写字母、表示原生质体产量有显著差异(.)下同:.(酶解时间酶解温度溶壁酶浓度且各因素影响差异显著(最优水平 最优组合 表 菌株的方差分析 来源型平方和 自由度菌龄 .溶壁酶浓度.酶解温度.酶解时间 .误差.总计 .各影响因素间存在一定的交互作用在进行条件优化时不可忽略 分析显示菌丝体菌龄对两株巨大侧耳菌株的原生质体产量影响均为极显著但溶壁酶浓度、酶解温度和酶解时间对两菌株的影响程度存在差异 推测是由于巨大侧耳的遗传多样性丰富 和 菌株间产生了遗传分化(.)菌株的生理状态和不同的酶解条件对食用菌原生质体产量和质量均具有不同程度的影响(孙佳星等)在本研究中菌丝体的菌龄是影响巨大侧耳原生质体制备的最主要因素 不同时期的菌丝体细胞壁厚度和生长活力不同对溶壁酶的敏感性也存在差异(张文学等)在菌丝生长前期细胞壁较薄更易被溶壁酶降解随着菌龄的继续增加细胞壁逐渐加厚且产生的次生物质增多酶解效率降低进而导致原生质体产量下降(.)本研究前期对巨大侧耳菌丝体培养时发现第 天正是巨大侧耳菌丝体生长的指数生长期此时细胞壁厚度和菌丝体活力均适宜可作为原生质体制备的理想时期和材料广 西 植 物 卷由于原生质体失去了细胞壁对外界环境十分敏感稳渗剂可保持原生质体内外的压力平衡避免其破裂或皱缩(.)同时稳渗剂在细胞与溶壁酶的反应中起媒介作用其性质影响溶壁酶的反应活性因此稳渗剂的选择非常重要(刘玉霞等)本研究中以甘露醇、山梨醇和蔗糖为稳渗剂时原生质体产量均较高且显著高于硫酸镁和氯化钾 前人研究也发现有机糖醇稳渗剂和无机盐稳渗剂在食用菌原生质体制备中影响差异很大(邹彰毅等孙佳星等)产生这一结果可能是因为有机糖醇不仅能维持渗透压平衡还能促进酶与底物的结合进而提高了酶促反应的产量(谭文辉等)溶壁酶是裂解细胞壁获得原生质体的关键酶的类型和浓度可以影响原生质体的活力和数量()李光环()研究发现单一的溶壁酶适合多种食用菌的原生质体制备在保证较高效率的同时成本也较低但由于不同真菌的细胞壁组成和结构不同不同浓度的溶壁酶的酶解效果也会有所差异 本研究结果表明在一定范围内溶壁酶浓度越高原生质体产量越高但浓度超过.后原生质体产量开始下降 这可能是因为酶浓度过高会对原生质体的膜造成影响使得细胞脱壁太彻底后期也会影响原生质体的再生(孙剑秋和周东波)在相同的溶壁酶浓度下酶解温度和酶解时间是影响破壁效果的关键 根据酶反应的动力学原理酶解温度直接影响酶促反应的速度还会影响细胞壁的生理状态适宜的酶解温度有助于溶壁酶发挥最佳的裂解作用 本研究中 为两菌株的最适酶解温度低于该温度时需适当延长酶解时间来获得较高的原生质体产量高于该温度时原生质体产量下降且再生率也降低 一方面可能是因为温度过低时酶活力不足且菌丝生理代谢慢导致酶解反应较慢温度过高会破坏酶的稳定性降低溶壁酶活性和损伤已游离的原生质体进一步影响细胞再生率(张丽霞和郭成金贺婷和郭成金)另一方面酶解时间可以影响酶促反应的程度适当延长酶解时间可获得较高的原生质体释放量 本研究中两菌株的最适酶解时间均为 超过 原生质体产量开始下降 推测是因为失去细胞壁的原生质体稳定性下降由于酶的作用及渗透作用酶解时间过长会导致原生质体破裂 并且原生质体再生时需要一定量的细胞壁酶解残余物酶解时间过长会导致酶解残余物过少甚至消失(郭成金和赵润)王昱等()研究也发现酶解时间过长较早释放出的原生质体无细胞壁保护而破裂其活性下降难于再生 因此适宜的酶解时间尤为重要综上所述两株不同温型巨大侧耳菌株的原生质体制备的最适条件相同但各因素对两菌株原生质体产量的影响不同 因此在制备巨大侧耳不同菌株的原生质体时应按照各菌株情况和实验需求进行适当调整 本研究结果可为后续的巨大侧耳杂交育种、遗传转化、全基因组测序等工作奠定基础有利于推动巨大侧耳产业的发展参考文献:.().():.崔玮洁 赵一橦 宋冰 等.玉木耳原生质体制备条件的优化及再生菌株的变异检测.分子植物育种():.().():.:.():.董洪新 蔡德华 李玉.猪肚菇担孢子交配型的分析.微生物学通报():.():.郭成金 赵润.冬虫夏草原生质体制备与再生条件的研究.食品科学():.():.贺婷 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