梨火疫病菌在库尔勒香梨枝条中的侵染定殖和扩展特征研究.pdf

果树学报2023，40（8）：1692-1702Journal of Fruit ScienceDOI:10.13925/ki.gsxb.20230056梨火疫病菌在库尔勒香梨枝条中的侵染定殖和扩展特征研究吕天宇1#，徐琳赟1#，席海珅1，韩剑1，2，罗明1，2*（1新疆农业大学农学院 农林有害生物检测与防控重点实验室，乌鲁木齐 830052；2农业农村部西北荒漠绿洲农林外来入侵生物防控重点实验室，乌鲁木齐 830052）摘要：【目的】示踪梨火疫病菌Erwinia amylovora在库尔勒香梨（Pyrus sinkiangensis Yu）（简称香梨）枝条组织中侵染定殖和扩展特征，为梨火疫病的有效防治提供依据。【方法】以分离获得梨火疫病强致病力菌株E.a001为材料，采用热激法将携带有绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein，GFP）质粒phc60-gfp转化E.a001，获得了能发出强烈绿色荧光的标记菌株E.a001-gfp。利用该标记菌株接种香梨枝条，检测、观察其在香梨枝条组织中的侵染定殖和扩展动态。【结果】针刺接种和喷雾接种E.a001-gfp引起枝条发病的最低浓度分别为106cfumL-1和107cfumL-1。相同浓度的病原菌接种，喷雾接种较针刺接种后发病显症时间延迟23 d。梨火疫病菌侵染枝条产生的坏死病斑的扩展速率随病原菌浓度提高而升高；病菌在1年生枝条上的生长扩展速度显著快于在2年生枝条内的扩展速度。梨火疫病菌入侵后主要存在于枝条维管系统中，大量分布于皮层薄壁细胞和韧皮部薄壁细胞间隙，少量存在于木质部导管中。在香梨发病枝条上，病健交界处的活菌数量最高，可达到108cfug-1，未显症部位010 cm处病原菌为105cfug-1，但在香梨枝条病斑外未显症部位1015 cm处均未分离出病原菌。【结论】研究明确了梨火疫病菌在香梨枝条组织中的扩展距离、迁移时间及速率，以及分布及定殖量，为病枝的准确修剪和制定病害的综合防控措施提供了科学依据。关键词：库尔勒香梨；梨火疫病菌；绿色荧光蛋白基因标记；侵染；扩展中图分类号：S661.2S436.612文献标志码：A文章编号：1009-9980(2023)08-1692-11收稿日期：2023-02-22接受日期：2023-04-27基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金重点项目（2021D01D12）；国家重点研发计划（2021YFD1400200）；新疆维吾尔自治区重大科技专项（2019A01001-2）作者简介：吕天宇，在读硕士研究生，研究方向为植物细菌性病害。E-mail：。#为共同第一作者。*通信作者Author for correspondence.E-mail：Characterization of the infectious colonization and expansion with GFPtagged strain of Erwinia amylovora in Kuerlexiangli pear(Pyrus sinkian-gensis Yu)shootsL Tianyu1#,XU Linyun1#,XI Haishen1,HAN Jian1,2,LUO Ming1,2*(1College of Agriculture,Xinjiang Agricultural University/Key Laboratory of Detection and Prevention and Control of Agricultural andForestry Pests,Urumqi 830052,Xinjiang,China;2Key Laboratory of Prevention and Control of Invasive Organisms in Northwest DesertOasis Agriculture and Forestry,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Urumqi 830052,Xinjiang,China)Abstract:【Objective】Fire blight is a major international quarantine bacterial disease caused by Erwin-ia amylovora,a destructive bacterium that infests pears,apples and other kinds of rosaceae nut fruittrees.In 2016 and 2017,it was found for the first time in Yili and Bazhou in Xinjiang,China,harmingpear,apple,hawthorn,begonia,quince and other fruit trees,especially spreading extremely fast on Kuer-lexiangli pear(Pyrus sinkiangensis Yu),resulting in severe economic loss to the pear industry.The infes-tation characteristic that E.amylovora can transfer rapidly in the host tissues is an important reason forthe fast epidemic speed,destructive damage and great difficulty of control.Timely pruning of diseasedfruit trees can not only greatly reduce the amount of pathogenic bacteria,but also prevent its migrationand expansion in the tree,which is an important measure for disease prevention and control and easy to，等：和扩展特征研究第8期梨火疫病是由解淀粉欧文氏菌Erwinia amylovo-ra侵染梨、苹果等多种蔷薇科仁果类果树、造成毁灭性危害的重大国际检疫性细菌病害1-2。该病害于1780年首次报道于美国纽约，现分布于北美、欧洲、北implement and cost-effective.The artificial inoculation of tracing pathogenic bacteria in pear branch tis-sue infestation colonization and migration characteristics was employed to deeply understand the patho-genic bacteria in the host tissue infestation expansion process and mechanism in order to guide the fieldpruning of diseased branches,disease resistant varieties selection and breeding and the development ofintegrated control measures【Methods】In this study,the virulent pathogenic strain E.a001 was isolatedthe shoots infested by fire blight,and the Green Fluorescent Protein(GFP)plasmid phc60-gfp was trans-formed into E.a001 by thermal excitation method,and the strong green fluorescent strain E.a001-gfpwas successfully obtained.The inoculations of different concentrations of E.a001-gfp suspension wereconducted with two methods,needle prick and spray,to detect and observe the dynamics of infestationand expansion in the tissues of pear shoots.【Results】The GFP-labeled E.a001-gfp strain emittedstrong green fluorescence under fluorescence microscopy,and a target fragment of about 700 bp wasamplified from the genomic DNA of the labeled bacteria.The morphology,growth curve and pathoge-nicity of the tagged strain E.a001-gfp were not significantly different from those of the wild type,andits green fluorescence was stably inherited.The lowest concentrations of E.a001-gfp for inducing shootdisease were 106cfumL-1and 107cfumL-1for needle inoculation and spray inoculation,respectively.The expansion rate of the necrotic spots produced by the pathogen-infested shoots increased with theconcentration of the pathogen,and the expansion rate of spots on shoots treated with 109cfumL-1inocu-lation was the fastest,and the migration rate was up to 3.96 cmd-1.The migration time of the necroticspots produced by the E.a001-gfp inoculation in the pear shoots was 12-15 d(average 13.5 d).The ex-pansion distance of spots in 1-year-old branches was 37.72-47.27 cm(average 42.77 cm),and in 2-year-old branches was 2.05-3.86 cm(mean 3.21 cm)respectively,which were significantly different.The re-sults of spray inoculation treatment were similar to those of the needle prick method.The laser confocalscanning microscope observation showed that the pathogenic bacteria mainly presented in the branchvascular system after invasion,and a large number of them were distributed in the cortical thin-walledcells and the interstices of the bast thin-walled cells,and a small number of them distributed in the xy-lem ducts.The E.a001-gfp was colonized at the necrotic lesions,disease-healthy junction and 0-10 cmof the non-significant part of the branch,and it could still be isolated at 40 d.The highest number of via-ble bacteria was found at the disease-healthy junction,which could reach 108cfu g-1tissue,and thehighest number of pathogenic bacteria was 105cfug-1tissue at 0-10 cm of the undeveloped part of thebranch,but no pathogenic bacteria were isolated at 10-15 cm of the undeveloped part of the pearbranch outside the diseased spot.It is suggested that pruning the diseased branch at 20-30 cm of the vis-ible spot of the fire blight susceptible pear branch could effectively remove the pathogen,which is asafe and effective pruning length;the pathogenic bacteria could survive in the diseased branches for along period of time,and the viable bacteria count of fire blight bacteria detected in the diseased branch-es stored at room temperature for 6 months was 105cfug-1.【Conclusion】The study clarified the expan-sion distance,migration time and rate,distribution and colonization amount of the E.amylovora,in thebranch tissue of pear,which provided a scientific basis for the accurate pruning of diseased branchesand the formulation of comprehensive prevention and control measures of the disease.Key words:Kuerlexiangli pear(Pyrus sinkiangensis Yu);Erwinia amylovora;Green fluorescent pro-tein(GFP)genetagged;Infestation;Extension吕天宇，等：梨火疫病菌在库尔勒香梨枝条中的侵染定殖和扩展特征研究1693果树学报第40卷非、中东和大洋洲等近60多个国家和地区3。近年来梨火疫病又传播至亚洲的日本、哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦等国，20162017年相继在中国新疆伊犁、巴州等地首次被发现，危害梨、苹果、山楂、海棠、温桲等果树，尤其在库尔勒香梨（简称香梨）上传播极为迅速，造成大批梨树被砍伐、果园被毁的巨大损失，给香梨生产带来重创。该病害近期已传播至甘肃张掖等地区，目前在中国尚属局部发生，现已被中国列入 一类农作物病虫害名录 和 重点管理外来入侵物种名录，对中国林果安全生产带来了巨大威胁和风险4-5。国外针对梨火疫病的病原学、检测技术和预测预警、流行规律和防治技术等开展了大量研究，提出了包括化学防治、生物防治、抗病品种选育、转基因技术和果园苗圃的综合治理等多种防控措施。但目前果树抗病品种匮乏，专门的防治药剂有限，也没有能高效控制病害的单一措施，至今病害依然是威胁梨和苹果产业的突出问题6。已有研究表明，梨火疫病菌E.amylovora在寄主组织中快速转移的侵染特征是造成病害流行速度快、毁灭性危害和防治难度大的重要原因。梨火疫病菌通过伤口和自然孔口侵入寄主多个部位，造成花器、叶片、幼果变黑凋萎、新梢枯死。易感寄主在气候条件适宜时，病原菌从病梢快速扩展到枝条、树干，直至砧木和根部，严重时可在几周或1至几个生长季导致全株枯死；病原菌在感病果树枝干的溃疡斑、枝条及病果，以及不表现症状的组织上越冬，还可在木质部导管中存活多年，难以根除。春季病原菌在病灶处大量繁殖作为当年的初侵染源，通过风雨、昆虫、鸟类及田间操作将病原菌传至寄主上造成初次侵染和再次侵染7-8。因此及时修剪发病果树的病枝，不仅可以大大降低病原菌的菌源量，还能阻止其在树体中的迁移扩展，是简便易行、经济有效的病害防控的重要措施。明确梨火疫病菌在不同寄主组织内生长及扩展特性，对深入了解梨火疫病菌的发生流行规律以及病害的科学防控具有重要的指导意义。国外研究者对梨火疫病菌的侵入及在寄主体内的定殖和迁移扩展曾采用生物学、细胞学和组织学的方法开展过一些研究，但该病原菌寄主种类的多样性和研究手段及方法的局限性，仍然存在诸多问题，一直没有获得确定的结果9。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）具有荧光性质稳定、直观、操作方便和不需添加外源底物就可以在实时、原位条件下对活细胞直接检测等优点，已广泛应用于病原菌与寄主植物的互作过程和示踪观察的研究中10-11。1988年，Bogs等12首次利用GFP作为报告基因标记梨火疫病菌，观察到其通过苹果枝条韧皮部进入木质部的侵染过程，并证明病原菌在破坏木质部导管后可以定殖到薄壁组织的细胞间隙。Hey-ens等13利用GFP标记技术发现梨火疫病菌在苹果叶片的侵染主要沿叶内主脉迁移，从主脉到叶肉和侧脉的迁移速率较慢。梨火疫病是近期在中国香梨生产区突发的流行病害，香梨作为梨火疫病的高感品种，梨火疫病菌在香梨枝条中的侵染定殖和扩展动态的研究未见报道。本研究以分离获得梨火疫病强致病力菌株为材料，对其进行绿色荧光蛋白报告基因标记，通过人工接种示踪病原菌在香梨枝条组织中侵染定殖和迁移特征，为深入了解病原菌在寄主组织内的侵染扩展过程及机制，掌握病害发生流行规律，指导田间病枝修剪、抗病品种选育和制定综合防治措施提供参考依据。1材料和方法1.1供试病原菌和质粒梨火疫病菌：Erwinia amylovora，E.a001菌株，由新疆农业大学农业微生物与生物技术实验室从新疆库尔勒市香梨园梨火疫病树病枝中分离、鉴定和保存，致病力测定为强致病力菌株。质粒：宿主菌为E.coli DH5，携带gfp基因并具有卡那霉素（50 gmL-1）抗性筛选标记的phc60-gfp质粒载体，由南京农业大学植物保护学院胡白石教授惠赠。1.2供试培养基梨火疫病菌和大肠杆菌培养采用 LB（Luria-Bertani）培养基；感受态细胞复苏培养基为 LB+0.5 molL-1山梨醇+0.38 molL-1甘露醇。1.3供试植株材料以库尔勒市巴州农科所日光试验果温室中栽培的4年生香梨树的枝条和叶片作供试植株材料。1.4梨火疫病菌标记菌株的构建及验证参考王颖14的方法并略作修改，将phc60-gfp质粒热击转化到E.a001菌株的感受态细胞中。先将制备好的E.a001感受态细胞置于冰上冻融，42 水浴锅中热激90 s后，迅速转移置于-40 冰箱放置3 min，然后每管加37 预热的LB复苏培养基1694，等：和扩展特征研究第8期400 L，32、180 rmin-1复苏培养30 min，将复苏后的培养物涂布于LB（加入Km 50 gmL-1）平板上，37 恒温培养过夜，通过倒置荧光显微镜（NikonECLIPSE Ts2R-FL）检测菌落荧光。挑取阳性转化子用GFP特异性引物（gfp-F：5-ATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3；gfp-R：5-TTATTTGTATAGTTCATCCATG-3，Size：700 bp）分别对转化子与野生菌株进行菌落PCR扩增和电泳检测，将扩增出目的基因的阳性转化子命名为E.a001-gfp。1.5E.a001-gfp标记菌株的生物学特性1.5.1遗传稳定性测定参照任嘉红等15的方法，挑取已长出的E.a001-gfp单菌落接种至LB液体培养基中，28、200 rmin-1培养过夜，以获取的菌悬液为种子液按1%的接种量接种至无抗生素LB培养液中，每次隔12 h接种到新鲜50 mL的LB液体培养基中培养。分别在培养12、24、36、48、60、72、84、96 h时取100 L菌液涂布到不含抗生素的LB平板上培养过夜。用接种针随机挑取100个单菌落，点接至LB（加入Km 50 gmL-1）培养基平板上，24 h后计数平板生长菌落数，以荧光菌落数所占总菌落数百分比计算菌株的遗传稳定性。1.5.2生长曲线测定将E.a001-gfp和原始菌株E.a001分别加入无抗生素的LB培养液中，28、200 rmin-1培养OD600=1.0左右。按照1%的比例分别接至LB培养液中，28、200 rmin-1振荡培养，每隔2 h测量一次OD600值，绘制生长曲线。1.5.3标记菌株的致病性测定取健康香梨离体叶片，用0.5%次氯酸钠浸泡10 min进行表面消毒，用无菌水浸泡漂洗3次。用无菌牙签在叶片的叶柄基部扎孔，用移液枪分别滴加5 L的E.a001-gfp和E.a001菌悬液（浓度为108cfumL-1），每个处理20枚叶片，以接种无菌水为对照。接种后将叶片置于培养皿中，28 下保湿培养，观察发病时间并用游标卡尺测量病原菌沿叶脉扩展的病斑长度。1.6接种E.a001-gfp标记菌株在香梨枝条组织中的侵染和迁移扩展动态1.6.1不同浓度的E.a001-gfp菌悬液的制备 将E.a001-gfp菌株在LB培养基上活化，挑取单菌落接入 LB（加入 Km 50 gmL-1）培养液中，在 28、160 rmin-1震荡培养OD600=1.2左右。用无菌水将培养液稀释至106、107、108和109cfumL-1不同浓度的菌悬液。1.6.2香梨枝条上接种E.a001-gfp及其在枝条中的迁移扩展测定在试验温室供试香梨植株上选取长势一致的1年生、2年生枝条，分别采用针刺法和喷雾法接种E.a001-gfp菌悬液。（1）针刺法接种：在香梨幼嫩枝条距顶梢5 cm左右处用无菌牙签刺伤约0.5 cm的伤口，用移液枪吸取10 L不同浓度的菌悬液滴入伤口，在接种点上方1 cm处包裹一圈无菌水浸润的无菌棉条，再用保鲜膜将接种部位同脱脂棉条一起包裹好保湿24 h后去除接种位点上方塑料薄膜和脱脂棉；（2）喷雾法接种：将不同浓度的菌悬液装入手持式压力喷壶中，将菌液均匀喷施在香梨枝条顶梢约10 cm处至叶片与枝条完全湿润，套袋保湿24 h。每个菌悬液浓度处理接种20个枝条，以接种无菌水作为对照。接种后每天定时观察枝条发病情况，测定并记录发病香梨植株枝条上病斑扩展的距离、时间，计算迁移速度。1.7接种E.a001-gfp标记菌株在香梨枝条组织中的定殖1.7.1E.a001-gfp在香梨枝条组织中的定殖量在试验温室种植的4年生香梨植株的当年生幼嫩枝条上，采用1.6.2针刺法接种E.a001-gfp菌悬液（浓度为109cfumL-1）。接种后9、19、40 d分别从发病枝条顶梢处、病健交接处和未显症部位取样，用75%的酒精浸泡1 min，1%次氯酸钠浸泡23 min，再用无菌水冲洗34次。取最后一次无菌水冲洗液100 L涂布于LB培养基，置于28 恒温箱中培养2 d。取表面灭菌彻底的样品放入灭菌的研钵中，加入PBS缓冲液将组织充分研磨，将上清液加入试管无菌水中充分混匀制成不同稀释度的稀释液。每个梯度稀释液吸取100 L加在LB（含50 gmL-1的Km）平板培养基上，用无菌涂布器均匀涂布后放入28 培养箱，培养2 d。在倒置荧光显微镜下观察、统计平板上长出的具有绿色荧光的菌落，计算出病原菌在枝条不同部位的定殖量（cfug-1）。1.7.2E.a001-gfp在香梨枝条组织中定殖位点的显微观察采用1.6.2的方法对香梨1年生枝条针刺接种E.a001-gfp。于接种10 d后取发病枝条的不同部位（接种点，距接种点不同距离，显症和未显症部位）1 cm的片段在冷冻切片机（赛默飞 CryoStar NX50）上横切、纵切制作组织切片，置于激光共聚焦扫描显微镜下（TCS SP8 STED 3X），在 GFP 的激发波长吕天宇，等：梨火疫病菌在库尔勒香梨枝条中的侵染定殖和扩展特征研究1695果树学报第40卷（488 nm），荧光检测波长（495515 nm）下观察在香梨枝条表皮、皮层、韧皮部、维管束、木质部和导管组织中标记菌株的分布，拍照并分析。1.7.3E.a001-gfp在离体香梨枝条中的存活能力检测将1.7.1 接种E.a001-gfp发病的香梨枝条剪下，装入牛皮纸袋放置在实验室室温下保存，每个月抽取6个病枝，采用1.7.1的组织分离法进行病原菌的分离，检测病枝条中存活的病原菌数量。2结果与分析2.1梨火疫病菌E.a001-gfp转化子的获得和鉴定采用热激转化法将携带gfp基因的质粒phc60-gfp导入梨火疫病菌E.a001感受态细胞中。挑取在LB选择性抗生素平板上长出的菌落，在荧光显微镜下观察可见菌落和菌体均发出强烈的绿色荧光（图1-B，C）；抗性菌落呈乳白色、半球形隆起状，表面湿润，光滑，半透明（图1-A），菌体为短杆状，与野生菌株无差异，而野生菌株不发荧光。用gfp基因特异性引物对阳性转化子、野生菌株E.a001进行PCR检测，结果显示在阳性转化子基因组、含gfp基因的质粒DNA中均能扩增出大小约700 bp的目标条带，而野生菌株中扩增不到目的片段（图2），表明gfp基因已成功转入到E.a001的基因组中并在细胞中成功表达，将标记菌株命名为E.a001-gfp。A.E.a001 菌落形态；B，C.荧光显微镜观察 E.a001-gfp 菌落和菌体（UV 光，放大倍数分别为 10，1000）。A.Colony morphology of E.a001 strain；B,C.Colony and bacteria morphology of E.a001-gfpstrain under the fluorescent microscope(UV-light,magnifications were 10 and 1000,respectively).图 1野生菌株和 GFP 标记菌株的形态特征Fig.1Morphological characteristics of wild type and GFP-marked E.a001 strain700 bpM CK 1 2 3 4 5 M.Marker;对照.GFP 质粒；1-3.E.a001-gfp 阳性转化子；4-5.野生菌株 E.a001。M.Marker;Control.GFP plasmid;1-3.E.a001-gfp positive transformants;4-5.wild typeo of E.a001.图 2阳性转化子中 GFP 基因的 PCR 检测Fig.2PCR detection of GFPgene in positive transformants2.2E.a001-gfp标记菌株的生物学特性2.2.1E.a001-gfp遗传稳定性检测遗传稳定性检测结果显示（表1），E.a001-gfp标记菌株在不含抗生素的LB培养基中每隔12 h连续继代培养8次后，菌落保持强烈的绿色荧光，质粒保持率为99%以上。结果表明，gfp质粒可在E.a001中稳定遗传且表达良好。2.2.2标记菌株与野生菌株的生长曲线比较测定比较标记菌株与野生菌株的生长曲线（图3）。在相同培养条件下，标记菌E.a001-gfp与野生菌株E.a001均在生长6 h后进入指数期，约24 h后，进入稳定期，生长曲线的变化趋势基本相同（图3）。结果显示，外源基因gfp的转化和表达未影响标记菌株E.a001-gfp表 1标记菌株 E.a001-gfp 菌株的遗传稳定性测定结果Table 1Determination of genetic stability of markedE.a001-gfp strain连续传代时间Continuouspassage time/h1296荧光菌落数Fluorescencecolony count727700总菌落数Total colonycount728706遗传稳定率Geneticstability/%99.8699.15700 bpMCK12345对照Control20 mABC1696，等：和扩展特征研究第8期0.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.00246810 12 14 16 18 20 22 24OD600培养时间（h）Inoculation timeE.a001E.a001-gfp01020304050607025810121519-100102030405060702581012151901020304050607025810121519一年生 Annual两年生 Biennia01020304050607025810121519的生长，其生长速率与野生菌株基本一致。2.2.3标记菌株与野生菌株的致病性比较在香梨叶片上针刺接种标记菌株E.a001-gfp和野生菌株E.a001，比较其致病性（图4）。E.a001-gfp和E.a001在香梨叶片上产生病斑的显症时间无差异，均在接种后3 d可见病原菌开始沿主叶脉扩展，扩展距离略有差异，分别为4.1 cm和3.9 cm，但差异不显著（p0.05）。结果表明，E.a001-gfp标记菌株的侵染能力和致病性与野生菌株相似，可以将其用于接种测定病原菌在寄主组织中的侵染过程的功能菌株。2.3E.a001-gfp标记菌株在香梨枝条中的迁移扩展特征2.3.1针刺法接种标记菌株在香梨枝条中的侵染扩展距离、迁移时间和速率采用针刺法在香梨树1年生、2年生枝条上接种E.a001-gfp菌液，观察测定病原菌的侵染和在枝条组织中的迁移扩展情况。试验结果表明（图5，表2），接种不同浓度E.a001-gfp菌液，从针刺伤口侵染产生的坏死病斑在枝条中的扩展AD.接种浓度分别为 106cfumL-1，107cfumL-1，108cfumL-1，109cfumL-1。A-D.Inoculation concentration 106cfumL-1，107cfumL-1，108cfumL-1，109cfumL-1.图 5针刺接种 E.a001-gfp 在香梨枝条中病斑的扩展距离和迁移时间Fig.5Migration distance and time of necrotic lesions in pear shoots bystab inoculation with E.a001-gfp培养时间 Time/hOD600图 4标记菌株 E.a001-gfp（左）和野生菌株 E.a001（右）的致病力比较Fig.4Comparison of pathogenicity between E.a001-gfp(left)and E.a001(right)E.a001E.a001-gfp图 3E.a001 与 E.a001-gfp 的生长曲线Fig.3Growth curve of E.a001 and E.a001-gfp病斑扩展距离Migration distance ofdisease spots/cm病斑扩展距离Migration distance ofdisease spots/cm时间 Time/d时间 Time/d时间 Time/d时间 Time/d01020304050607025810121519-100102030405060702581012151901020304050607025810121519一年生 Annual两年生 Biennia01020304050607025810121519ABCD病斑扩展距离Migration distance ofdisease spots/cm病斑扩展距离Migration distance ofdisease spots/cm1 年生 Annual2 年生 Biennia吕天宇，等：梨火疫病菌在库尔勒香梨枝条中的侵染定殖和扩展特征研究706050403020100-101697果树学报第40卷0102030405060702581012151901020304050607025810121519距离、迁移时间及速率均有明显差异。在香梨1年生幼嫩枝条上接种，当病原菌浓度为105cfumL-1时仅局限在伤口处变黑，病斑不扩展；病原菌浓度为106cfumL-1时，接种3 d后枝条上开始出现黑色坏死病斑，5 d后病斑才逐渐开始扩展，之后扩展迅速；浓度为107、108和109cfumL-1病原菌接种后2 d枝条上即出现黑色坏死病斑并扩展，扩展速率随病原菌浓度的增加而提高，108cfumL-1病原菌在枝条中的扩展最快，速率可达3.95 cmd-1，显著高于其他浓度。浓度106cfumL-1病原菌接种后侵染香梨枝条组织产生坏死病斑并上下迁移的时间为1015 d（平均 13.5 d），病斑扩展距离为 38.0645.31 cm（平均42.55 cm），其中106、107cfumL-1接种处理的枝条病斑迁移持续时间最长（15 d），109cfumL-1接种处理的枝条病斑的迁移时间持续最短（10 d）；108cfumL-1浓度的病原菌接种处理的病斑扩展最长（45.31 cm）。在 2 年生枝条上针刺接种，病原菌浓度为105cfumL-1时仅局部变色，病斑不扩展；浓度106cfumL-1病原菌接种后812 d才开始出现病斑症状并缓慢扩展，扩展距离为 3.053.86 cm（平均3.46 cm），15 d后病斑不再扩展。2.3.2喷雾接种标记菌株在香梨枝条中的扩展距离、迁移时间和速率在香梨树1年生、2年生枝条上采用喷雾法接种不同浓度的E.a001-gfp菌液。试验结果表明（图6，表3），在1年生枝幼嫩枝条上，浓度为106cfumL-1病原菌接种后枝条不显症；浓度为107cfumL-1病原菌接种后56 d在顶梢处开始出现黑色坏死病斑并沿枝条逐渐向下扩展；浓度为108cfumL-1和109cfumL-1病原菌接种后2 d即开始显症并沿枝条扩展，108cfumL-1接种处理的病斑扩展最快，扩展速率可达4.06 cmd-1。浓度107cfumL-1的接种处理，枝条病斑的迁移时间为15 d，之后病斑长度不再增加；病斑扩展距离为38.8947.27 cm（平均43.08 cm），108cfumL-1接种处理的病斑扩展最长（47.27 cm）。在2年生枝条上喷雾接种病原菌浓度107