苗药验方“四大血”对类风湿性关节炎大鼠关节炎症的作用及机制.pdf

基础研究苗药验方“四大血”对类风湿性关节炎大鼠关节炎症的作用及机制梁玺，覃淇，张艺馨，袁啸天，吴宁，吴遵秋，吴昌学（贵州医科大学 基础医学院 化学与生物化学实验室，贵州 贵阳 ；贵州医科大学 医学分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 ）摘要目的探讨苗药验方“四大血”（）对类风湿性关节炎（）大鼠关节炎症的作用及机制。方法 只健康 大鼠随机均分为空白组、阳性对照组、模型组及 （低剂量）组、（中剂量）组、（高剂量）组，后 组采用型胶原诱导建立 模型，空白组大鼠予等容积生理盐水皮下注射；五花血藤 鸡血藤 见血飞 黑骨藤按 制取受试药，按体质量 、予 高、中、低剂量灌胃，阳性药物组予 雷公藤多苷片（）水溶液灌胃，空白组、模型组予等容积生理盐水灌胃，持续周，给药期间检测关节足肿度（）；干预结束后处死各组大鼠，取膝关节滑膜组织、心脏取血，染色法观察各组大鼠膝关节滑膜组织的形态学特征，酶联免疫吸附试验（）检测各组大鼠血清的 表达情况，采用即时聚合酶链式反应（）和蛋白质免疫印迹法（）检测各组大鼠中 、的 和蛋白表达。结果给药 后，与模型组比较，各给药组大鼠 均不同程度的减轻（）；染色结果显示，与模型组比较，组大鼠炎症浸润、滑膜增生程度均有改善，且高剂量 组大鼠更明显；与空白组比较，模型组大鼠血清 水平明显升高（），高剂量、中剂量 组和阳性对照组大鼠血清 含量降低（）；结果显示，与模型组比较，中剂量 组大鼠膝关节滑膜组织中 、明显下调（）；结果显示，与空白组比较，模型组大鼠膝关节滑膜组织中 、蛋白表达上调（），但中、低剂量 组下调（），且中剂量 组蛋白下调与阳性对照组作用相当（）。结论 可抑制 大鼠关节炎症的反应，其机制可能与 炎症体轴激活受到抑制有关。关键词关节炎，类风湿；白细胞介素 ；苗药方四大血；抗炎；炎症体；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 中图分类号 ；文献标识码 文章编号 （）：，（，；，）（），（），（），（），（）第 卷第 期 年 月贵 州 医 科 大 学 学 报 基金项目 国家自然科学基金（）；本科创新创业人才培养计划项目（，）贵州医科大学 级硕士研究生通信作者 ：；引用本文：梁玺，覃淇，张艺馨，等 苗药验方“四大血”对类风湿性关节炎大鼠关节炎症的作用及机制 贵州医科大学学报，（）：，（），（），（）（）（），（），（），（），（）（）（）（），（），（）（），；，；类风湿性关节炎（，），一种炎症性、破坏性、慢性、可侵犯关节滑膜组织的疾病 ，主要特点为多关节滑膜炎性细胞浸润、关节腔内血管翳生成、成纤维样滑膜细胞增殖导致滑膜内衬层增生，最终引起骨组织破坏和软骨退化；临床表现为关节红肿热痛的炎症反应、功能下降、畸形等 ，世界范围内患病率 ，患者年致残率 ，年致残率为 ，现已跃升为医学界的难治疾病 。有研究表明，患者 样受体蛋白 （，）炎症体轴过度激活，将产生相关细胞因子引起一系列的炎性反应，加剧 病情 。炎性体（一种多蛋白复合体），由受体蛋白、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 前体（，）、细胞凋亡相关斑点样 蛋 白（，）部分组成，属于炎性体轴的关键蛋白并参与人体固有免疫 ；当 炎性体激活，形成 斑点或焦亡小体，在自催化活化近距离诱导下，可致 激活，从而促进白细胞介素 （，），等致炎症因子的成熟及分泌，最终导致周围组织炎症反应加重 。在 的药物治疗方面，新的生物制剂如托珠单抗、拮抗剂、肿瘤坏死因子 （，）拮抗剂等，不仅价格高昂，还易发生感染等不良反应；非甾体抗炎药（，）、改善风湿病情药物（，）及糖皮质激素（，）等常用临床治疗药物，则因疗效不佳、不良反应较明显等问题难以达到患者的期望 。当前，从中医药出发，研究疗效更显著、毒副作用更小的新药日渐成为研究热点。苗药验方“四大血”（，）组成为 味藤本药材鸡血藤（仰嗟嘎，）、黑骨藤（莴蒙棱，）、见血飞（嘎龚布梭学，）及五花血藤（梭向，），有通气散血、行瘀止痛之功 。本课题组前期结果表明，给药后的胶原诱导性关节炎模型贵 州 医 科 大 学 学 报 卷大鼠（，）表现出良好的治疗疗效、关节滑膜的炎性细胞浸润可被明显抑制、关节肿胀得到缓解、表达下调 。本研究以 炎症体轴为切入点，通过复刻 模型大鼠，对比不同剂量 治疗前后大鼠关节肿胀度及病理变化，并分析大鼠滑膜组织的 及 的蛋白及 水平和血清 含量的变化，评估 的抗炎效果。材料与方法 实验材料 药材来源 组成药材鸡血藤、黑骨藤、五花血藤及见血飞由贵州中医药大学苗医药教研室提供，经贵州中医药大学田振华副教授鉴定为正品。实验动物 只 周龄、体质量（）的健康 （）大鼠，雌雄各半，由学校实验动物中心提供 （黔）。本研究已获得学校实验动物伦理委员会审查批准（），且严格遵守伦理委员会规定。主要药物与试剂雷公藤多苷片（，；黄石飞云制药公司），弗式不完全佐剂（美国 公司），牛型胶原（美国 公司），二喹啉甲酸（，）蛋白定量试剂盒、（，）裂解液、苏木素、及伊红由上海碧云天生物技术有限公司提供，大鼠 酶联免疫吸附实验（，）试剂盒（上海泛柯实业有限公司），大鼠 抗体（美国 公司），抗体（华安生物技术有限公司），辣根过氧化物酶（，）羊抗兔免疫球蛋白 （，；美国 公司），高灵敏性染料法定量聚合酶链式反应（，）检测试剂盒和逆转录试剂盒由南京诺唯赞生物科技有限公司提供，其余试剂均为进口或国产分析纯产品。研究方法 药物的制备取 苗药五花血藤、鸡血藤、见血飞及黑骨藤组成 ，按 的比例取药材 ，加适量水用大火、中火及小火分别煮 、及 ，合并浓缩液 作为受试药，浓度为 （按生药量计），质量控制标准为每制 ；水煮液原药材五花血藤不低于 、鸡血藤不低于 ，见血飞不低于 及黑骨藤不低于 ；制备完成的中药水煎液密封避光，冰箱备用（保存 周）。造模及分组 只 大鼠于无特定病原体（，）级实验室适应性喂养 ，按体质量随机均分为空白组、阳性对照组、模型组及 （低剂量）组、（中剂量）组、（高剂量）组。取适量 牛型胶原与等量不完全弗氏佐剂于冰上混合，并完全乳化至其滴于水中不扩散；将模型组、阳性对照组及高、中、低剂量 组大鼠于尾根部皮下注射乳化剂 诱导免疫反应，周后再次注射乳化剂 加强免疫；空白组大鼠于尾根部皮下注射同量生理盐水。造模期间每日观察并拍照记录大鼠关节红肿及畸形等情况，每隔 观察并进行关节炎指数评分（，），评分 分即可视为造模成功 。给药方案造模成功 后，高、中、低剂量 组分别按照体质量 、给予 浓缩液 、（按生药量计），阳性对照组按体质量 给予 ，空白组及模型组给予等量生理盐水（，），次 ，持续给药 。一般情况的观察和 评分给药期间观察各组大鼠的饮食量、精神状态、踝关节形态、被毛情况及活动情况等。分别于造模前 天、灌胃给药前 天及灌胃给药 周、周、周时，采用足趾容积测量仪测各组大鼠足趾大小，记录 评分；足趾肿胀指标判断以大鼠造模前后的足趾容积变化为准，双后足累积得分作为总分。标本采集末次给药次日，各组大鼠经 水合氯醛麻醉，麻醉处死大鼠，取仰位固定，沿膝关节正中将皮肤纵行切开、暴露 以膝关节为中心的区域，齿镊提起髌骨，从上缘 处沿两侧向下分离，膝关节腔内可见附着的薄层滑膜组织，呈淡黄色、平滑、光亮，小心剥离后用磷酸盐缓冲液（，）清洗，液氮速冻，保存，并提取滑膜组织的总 及蛋白供后续研究。病理组织切片制备取各组大鼠踝关节组织，中性甲醛固定 ，常规梯度脱水后依次进行浸蜡、包埋、切片与贴片、脱蜡水化、苏木精 伊红（，）染色，脱蜡水化、脱苯、复水、常规梯度染色、梯度脱水、二甲苯透明、中性树期梁玺等苗药验方“四大血”对类风湿性关节炎大鼠关节炎症的作用及机制胶封片，在显微镜下观察滑膜组织形态学变化。酶联免疫吸附试验（，）法检测血清 的表达各组大鼠心脏取血后离心并取上层血清，采用 法检测大鼠血清 含量，按照试剂盒说明书进行操作，配置标准品液，每孔分别加标准品和待测样品 ，洗板后加一抗于 放置 ，再次洗板并加酶标抗体于 放置 ），洗板并加底物工作液于 放置 ，最后加终止液并混匀，测量酶标仪 处吸光值。即时聚合酶链式反应（，）法检测滑膜组织 及 的含量取大鼠关节滑膜组织匀浆，利用 法提取总 并吸取澄清的 至新的微型离心管（，）内，依次测定 样品浓度、纯度，逆转录合成互补脱氧核糖核酸（，）并进行 扩增（反应条件：预变性 ，变性 、退火 、循环 次）。用 法计算 的相对表达量，次平行实验后，对目的基因扩增产物与甘油醛 磷酸脱氢酶（，）光密度值进行统计学分析。通过 网站设计引物，由武汉天一辉远生物科技有限公司合成引物，为内参基因，引物序列见表 。表 各基因的引物序列 基因序列（）上游：下游：上游：下游：上游：下游：检测滑膜组织 、蛋白表达取各组大鼠关节滑膜组织，置于已加放射免疫沉淀法（，）裂解液 的研磨管，充分研磨，静置裂解 ，下 离心 取上清液，法测定蛋白浓度；依次制备 聚丙烯酰胺凝胶，上样 ，电泳，恒流转膜 ，脱脂奶粉封闭 ，一抗（）于 孵育过夜，辣根过氧化物酶偶联二抗（）室温孵育 ，经增强型化学发光试剂（，）工作液显色及曝光成像。采用条带分析软件处理条带，并计算灰度值，蛋白的表达量为条带与各组内参 灰度值的比值。统计学分析采用 软件分析实验数据并作图。计量资料符合正态分布且方差齐用均数 标准差（）表示，组间比较采用 检验，多组比较用单因素方差分析，表示差异有统计学意义。结果 足趾外观及双后肢足肿胀度的 评分 大鼠足趾外观结果显示，给药 后，各给药组较模型组大鼠双后肢红肿情况存在不同程度的降低，其双后肢膝关节、踝关节和趾间关节红肿均有不同程度的减轻。给药前，空白组的 评分为 分，其余各组 评分均为 分；根据评分标准（达 分及以上即可判断造模成功）可判断本次造模情况达标。连续灌胃给药 周后，高、中剂量 组大鼠双后肢足肿胀度较模型组下降（）；灌胃给药 周后，各剂量 和阳性对照组大鼠后肢肿胀程度较模型组均有较多降低（）；到给药 周时，各剂量 和阳性对照组大鼠双后肢足肿胀度和足趾外观表现较模型组均有明显减小（）。且除模型组 评分为 分，其余各组均为 分（）。见图 和表 。组织学特征光镜下观察时可见，空白组大鼠未见明显滑膜增生及炎症细胞浸润；相比空白组，模型组大鼠踝关节组织可见踝关节组织软骨表面粗糙不平、破骨细胞增多，软骨细胞坏死，衬里下层细胞坏死，衬里层的滑膜细胞存在坏死或增生，且存在浸润性炎性细胞、增生性纤维组织、形成新生毛细血管等病理改变；与模型组相比，各给药组大鼠踝关节组织病理改变均有所减轻，其中低剂量 组、中剂量 组仍可见较多浸润性炎性细胞、组织水肿；阳性对照组大鼠浸润性炎性细胞明显减少，表示踝关节组织炎症有一定程度减轻；高剂量 组大鼠明显缓解，偶见极少量散在分布的炎性细胞。见图 。贵 州 医 科 大 学 学 报 卷空白组 阳性对照组模型组 低剂量 组 中剂量 组 高剂量 组图 各组 大鼠干预 时足趾外观 表 各时间点各组大鼠双后肢足肿胀度的 评分（）（）组别时间造模前灌胃前灌胃 周灌胃 周灌胃 周空白组 模型组 （）（）（）（）阳性对照组 （）（）（）（）低剂量 组 （）（）（）（）（）（）（）（）（）中剂量 组 （）（）（）（）（）高剂量 组 （）（）（）（）注：（）与同时点空白组比较，；（）与同时点模型组比较，；（）与同时点阳性对照组比较，。注：绿色、蓝色黄色及橙色箭头分别表示淋巴细胞、中性粒细胞、浆细胞及纤维细胞。图 各组大鼠膝关节滑膜组织的形态学特征（）（）血清 水平 检测结果表明（表 ），与空白组比较，模型组大鼠血清 水平升高（）；与模型组比较，阳性对照组和 高剂量组大鼠的血清 水平下降（），中、低剂量组大鼠血清 水平下降、但无统计学意义（）；与阳性对照组比较，高剂量组大鼠的血清 水平比较、差异无统计学意义（）。表 各组大鼠的血清 水平（）（）组别血清 （）空白组 模型组 （）阳性对照组 （）低剂量 组 （）（）中剂量 组 （）（）（）高剂量 组 （）（）（）注：（）与空白组比较，；（）与模型组比较，；（）与阳性对照组比较，；（）与低剂量 组比较，；（）与中剂量 组比较，。期梁玺等苗药验方“四大血”对类风湿性关节炎大鼠关节炎症的作用及机制 和 的表达 检测结果表明（图 ），给药 后，与空白组比较，模型组大鼠膝关节滑膜组织中 、明显上调（）；与模型组比较，高剂量 组大鼠膝关节滑膜组织中 、下调，但差异无统计学意义（），中剂量 组大鼠膝关节滑膜组织中 、明显下调（），低剂量组 下调（），提示中、低剂量 组对 大鼠的 和 下调效果良好。注：、分别为 和 的定量表达；（）与空白组比较，；（）与模型组比较，；（）与阳性对照组比较，。图 各组大鼠膝关节滑膜组织 和 的表达 和 蛋白的表达 结果显示（图 ），与模型组比较，空白组大鼠膝关节滑膜组织中 、蛋白表达上调（），中、低剂量 组大鼠膝关节滑膜组织中 、蛋白表达下调（），中剂量 组大鼠膝关节滑膜组织中 、蛋白表达下调与阳性对照组作用相当（），提示中剂量 组对 大鼠膝关节滑膜组织中 和 蛋白下调效果良好。注：为 、蛋白的 检测结果，、分别为 、蛋白的定量结果；（）与空白组比较，；（）与模型组比较，；（）与阳性对照组比较，。图 各组大鼠膝关节滑膜组织中 和 蛋白的表达 讨论 属一种自身免疫性疾病，主要病变特征为侵蚀性关节炎，最终可导致肢体残疾，影响生活质量 。我国 患病率约为 。基本病理变化为关节滑膜炎形成、腔内具有浸润性炎性细胞、骨侵蚀及软骨破坏，其中炎症反应是 主要的发病机制之一，多种炎症因子与之密切相关，促炎细胞因子（、及 等）介导的贵 州 医 科 大 学 学 报 卷炎症反应是 滑膜病变发生发展的重要原因 。核因子 （，）信号通路调控 炎症体轴的激活 。有研究表明，患者外周血细胞中 炎症小体的增加表达 ；小鼠 下游因子焦孔素家族蛋白 （，）的缺失可以明显缓解 小鼠的滑膜炎和临床表现 。综合以上表明，中存在 炎症体轴的过度激活，但 炎症体轴对 炎症反应影响的具体机制仍有待证实。参与细胞死亡及炎症反应是 家族主要作用，且炎症小体在 的活化过程中 具 有 关 键 作 用 。炎 症 小 体 是 由 蛋白、细胞凋亡相关斑点样蛋白（，）、受体蛋白 部分组装而成的多蛋白复合体 ；其最具特征的亚型之一是由 作为受体蛋白的 炎症小体，主要依靠结构域之间的结合激活 ；作为 下游的关键因子，可直接实施损伤细胞，其活性的 端结构可破坏细胞膜的完整性并形成孔道，最终导致细胞死亡 ；、的成熟与活化依赖于 的活化，待其分泌至细胞外，将进一步诱导其他炎症细胞因子、粘附分子及趋化因子等的合成，从而扩大炎症反应 。基于 炎症体轴使用 治疗 的研究，尚且未见相关报道，因此，本研究旨在探究苗医验方 是否能通过干预 炎症体轴发挥抗炎作用。苗药验方 有味藤本药材：见血飞、鸡血藤、黑骨藤及五花血藤，具通气散血、行瘀止痛的功效，是 治疗的贵州苗族地区特色药方 。从本研究结果来看，与空白组相比，模型组大鼠足趾肿胀明显，组织切片提示滑膜细胞明显增生、炎症细胞浸润明显，血清 水平存在明显上调，滑膜组织中 、水平和蛋白表达升高，提示模型制备成功；过度表达可引起过度激活 炎症体轴的表现。炎症体轴的正常激活可以保护正常组织器官避免内源性损害及感染，过度激活则可能引发病理性炎症 。过度表达的 炎症小体，可激活 ，促进 、的成熟与分泌，引起细胞内容物、炎症因子 及 的大量释放，加重周围组织炎症反应；的刺激，又可促进滑膜细胞的过度增殖、血管翳的形成 。经过 或 治疗后，大鼠足趾肿胀度相对改善，关节滑膜组织中的细胞增生程度较轻，炎症细胞浸润明显减少，提示 可抑制 中的炎症反应，其中四大血高剂量组较低、中剂量组炎症反应缓解更加明显；与模型组相比，四大血中剂量组大鼠滑膜组织的 、蛋白和 表达明显下调，其余治疗组表达轻度下调；四大血阳性对照组及高剂量组血清中 水平降低；可见 具有抑制 炎症小体的可能，从而抑制 炎症体轴的激活 。综上所述，大鼠滑膜组织的炎性增生可能与过度激活的 炎症体轴有关；可下调 表达，减弱了 炎症信号通路的活化，下游 的表达则被抑制，从而缓解 大鼠滑膜组织中被过度激活的 炎症体轴、抑制滑膜炎症，起到治疗 的作用。因此，本研究提示 减轻炎性症状的作用与 炎症体轴密切相关，具有重要的药用价值。同时，为 治疗 的作用靶点的研究搭建了一定的实验基础，但仍需进一步深入研究具体机制。参考文献 ，：，（）：田乐，朴松兰，何艳新 红景天含药血清对肿瘤坏死因子 诱导的人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖的影响 中药新药与临床药理，（）：王洋洋，徐媛，苑功名，等 类风湿关节炎骨破坏及其针灸治疗的骨免疫学机制研究现状 山东中医杂志，（）：，：，：李媛 炎性小体及高尔基体应激介导糖尿病脑病发生机制研究 长春：吉林大学，（）：袁桃花，黄宇键，李佳豪，等 贵州苗药方“四大血”对 大鼠滑膜血管增生的作用机制 西安交通大学学报（医学版），（）：吴昌学，吴宁，冯光霞 苗药方四大血对佐剂性类风湿期梁玺等苗药验方“四大血”对类风湿性关节炎大鼠关节炎症的作用及机制关节炎大鼠 及 表达的影响 贵阳医学院学报，（）：，（）：，?，：仵恒立，谢天篪，张军阳，等 类风湿早期诊断 临床研究，（）：，（）：蒋海旭，许杰，陆清怡 槲皮素治疗类风湿关节炎的研究进展 中国实验方剂学杂志，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：吴宁，袁桃花，姬进忠，等 苗药验方四大血对人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡和焦亡的影响 南方医科大学学报，（）：（收稿，修回）中文编辑严征英文编辑张启芳（上接第 页），?，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，?，：（收稿，修回）中文编辑严征英文编辑陈琳贵 州 医 科 大 学 学 报 卷