基于UPLC-Q-TOF MS技术的陈皮陈化年份鉴别方法研究.pdf

第42 卷 第 8 期2023 年8 月Vol.42 No.810071011分析测试学报FENXI CESHI XUEBAO（Journal of Instrumental Analysis）基于UPLCQTOF MS技术的陈皮陈化年份鉴别方法研究周熙1，罗辉泰1，黄锦沛2，陈怡珊2，李乐2，赖晓娜1，黄芳1，吴惠勤1*（1.广东省科学院测试分析研究所（中国广州分析测试中心），广东省化学测量与应急检测技术重点实验室，广东省中药质量安全工程技术研究中心，广东 广州 510070；2.江门市新会区动物防疫监督所（江门市新会区农产品质量安全监督检验测试中心），广东 江门 529199）摘要：建立了一种陈皮陈化年份的鉴定方法。利用超高效液相色谱四极杆串联飞行时间质谱（UPLCQTOF MS）对陈皮的主要化学成分进行鉴定，研究了不同陈化年份陈皮样品中化学成分的变化规律，结合统计分析方法发现了6个同分异构体在陈皮陈化过程中的相互转化规律。结果表明，6个分子式为C20H22O7的五甲氧基黄烷酮同分异构体中，前3个化合物含量随年份的增加而降低，后3个化合物含量随年份的增加而升高，其比值与陈化年份具有显著的线性关系。利用该6个特征性成分的转化因子（S），建立了陈皮陈化年份计算模型，相关系数（r2）为0.90。训练集样品的年份预测误差均不大于2年。盲样测试结果中90.0%样品的年份预测误差不大于2年。该方法准确可靠，为陈皮陈化年份的鉴定提供了科学依据。关键词：陈皮；陈化年份；超高效液相色谱四极杆串联飞行时间质谱；转化因子中图分类号：O657.63；R914.1 文献标识码：A 文章编号：1004-4957（2023）08-1007-05Storage Years Identification of Pericarpium Citri Reticulatae by Ultra-high Performance Liquid ChromatographyQuadrupole Time-of-flight Mass SpectrometryZHOU Xi1，LUO Hui-tai1，HUANG Jin-pei2，CHEN Yi-shan2，LI Le2，LAI Xiao-na1，HUANG Fang1，WU Hui-qin1*（1.Guangdong Provincial Engineering Research Center for Quality and Safety of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Provincial Key Laboratory of Chemical Measurement and Emergency Test Technology，Institute of Analysis，Guangdong Academy of Sciences（China National Analytical Center，Guangzhou），Guangzhou 510070，China；2.Institute of Animal Epidemic Prevention Supervision，Xinhui，Jiangmen（Agricultural Products Quality and Safety Supervision and Inspection Analytical Center，Xinhui，Jiangmen），Jiangmen 529199，China）Abstract：A method for identifying the storage years of Pericarpium Citri Reticulatae was established in this paperThe main chemical components in Pericarpium Citri Reticulatae were determined by ultra-high performance liquid chromatographyquadrupole time-of-flight mass spectrometry（UPLCQTOF MS），and the variation of chemical components in samples with different storage years were studiedResults showed that there were six pentamethoxyflavanone isomers of C20H22O7，and the transformation rules for the six isomers were found with the increase of the storage yearsWith the increase of storage years，the contents of the first three compounds decreased，while the contents of the last three compounds increasedRatios of the last three compounds to the first three compounds had a significant linear relationship with the storage yearsBased on the conversion factor（S）of the six characteristic flavonoids，a model for calculating the storage years of Pericarpium Citri Reticulatae was establishedThe correlation coefficient（r2）for the established model was 0.90，and the verified results showed that the prediction errors for all the model group samples were not more than doi：10.19969/j.fxcsxb.23052003收稿日期：20230520；修回日期：20230608基金项目：广东省科学院打造综合产业技术创新中心行动资金项目（2022GDASZH-2022010110）；江门市六大特色优势农业产业及新兴特色农业发展项目“新会陈皮陈化特性与道地性研究”通讯作者：吴惠勤，研究员，研究方向：中药物质基础研究与质量控制，E-mail：第 42 卷分析测试学报2 years，and the prediction errors for 90.0%samples in validation group were not more than 2 yearsThese results indicated that the established method was accurate and reliable，and it provided a scientific basis for identification on the storage years of Pericarpium Citri Reticulatae.Key words：Pericarpium Citri Reticulatae；storage years；high-performance liquid chromatographyquadrupole time-of-flight mass spectrometry；conversion factor陈皮（Pericarpium Citri Reticulatae）是芸香科植物橘（Citrus reticulate Blanco）及其栽培变种的干燥成熟果皮，具有调节胃肠平滑肌运动，控制消化液分泌，利胆保肝，祛痰平喘，松弛子宫平滑肌等多种药理作用13。陈化年份是陈皮质量的重要评价标准。绍兴本草 曾报道“唯橘皮以陈久者佳”。本草纲目 记载“他药贵新，惟此贵陈”。由于陈化年份高的陈皮价格高昂，不法商人将新陈皮做旧冒充老陈皮，损害了消费者利益，扰乱了陈皮市场，影响陈皮产业的健康发展。陈皮年份的准确识别对保障消费者权益和产业发展具有重要意义。陈皮的陈化时间越长，品质越高。目前，针对不同年份陈皮的研究已多有报道。随陈化年份的增加，陈皮表面颜色逐渐加深，利用光谱技术可实现陈皮年份的快速、无损检测46。余梅等4利用近红外光谱对不同陈化年份陈皮的内囊及外壁进行分析，结合不同模式识别方法构建了陈皮年份的鉴别模型，可对5年、10年、15年、20年与25年的陈皮进行鉴别。杨少壮等5利用太赫兹光谱技术，结合主成分分析支持向量机算法实现了3年、5年、10年、15年与20年陈皮的区分。但上述研究不能反映陈皮内在的化学成分变化，年份鉴别结果的准确性低。黄酮类化合物是陈皮的重要活性成分，多个研究表明陈化过程中黄酮类化合物含量发生变化79。但不同研究的变化规律不尽相同，结论不一致。在1 11年陈皮样品中，橙皮苷的含量随年份延长呈显著下降，川陈皮素与红橘素显著升高9。而另一研究对1 10年陈皮样品中橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘红素与5-去甲川陈皮素分析发现，5种黄酮类化合物的含量呈波动性变化，随年份的延长变化规律不明显8。陈皮样品受产地、种类、储存等因素影响，不同样品中单一化学成分的含量差异较大，用单一成分含量表征其年份结果偏差较大。因此，迫切需要建立一种准确鉴定陈皮陈化年份的分析方法。本文在陈皮化学成分研究基础上10，采用超高效液相色谱四极杆串联飞行时间质谱（UPLCQTOF MS）深入研究了不同陈化年份陈皮样品中化学成分的变化规律，发现了6个同分异构体在陈皮陈化过程中的相互转化规律，利用化学成分内在转化关系建立准确评价陈皮年份的方法，可为陈皮质量控制提供科学依据。1 实验部分 1.1仪器与试剂Agilent1290 HPLC6540QTOF MS（美国Agilent公司）；KQ2200型台式机械超声波清洗器（东莞市超声波设备有限公司），赛多利斯TP114电子天平（美国Sartorious公司）。实验用水为二次蒸馏水，甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯试剂（德国Merck公司）。1.2样品收集2022年6月 12月，新会3个陈皮果园与新会农业局提供了2014 2022年共49批次自然条件下陈化的新会陈皮样品，年份信息见表1。表1陈皮样品的年份信息Table 1Year informations of Pericarpium Citri Reticulatae samplesS1S2S3S4S5S6S7S8S9201620172018201920202021202220142015S18S19S20S21S22S23S24S25S26201820202021201520162018201620172018S35S36S37S38S39S40S41S42S43202120212014202120162020201520172018No.YearNo.YearNo.Year1008第 8 期周熙等：基于UPLCQTOF MS技术的陈皮陈化年份鉴别方法研究S10S11S12S13S14S15S16S1720162017201820202021201420152017S27S28S29S30S31S32S33S3420192020202120162017201820192020S44S45S46S47S48S49-201520182020201720142021-（续表1）No.YearNo.YearNo.Year1.3实验方法1.3.1 样品前处理 准确称取陈皮样品1.0 g于锥形瓶中，加入70%（体积分数）甲醇25 mL，称重，超声提取30 min，70%甲醇补重，滤膜过滤，装瓶。1.3.2 色谱条件 Agilent RRHD C18（150 mm 2.1 mm，1.8 m）色谱柱，流动相为0.1%甲酸水溶液（A）乙腈（B），流速为 0.3 mL/min；柱温为 35；进样量为 0.4 L。流动相梯度为：0 5 min，10%B；5 20 min，10%25%B；20 30 min，25%40%B；30 40 min，40%70%B；40 42 min，70%95%B；42 47 min，95%B；47.1 50 min，95%10%B。1.3.3 质谱条件 Agilent Dual AJS ESI离子源，正离子扫描；干燥气（N2）温度为350；雾化气（N2）压力为2.4 105 Pa；干燥气（N2）流速为8 L/min；鞘气温度为350；鞘气流速为11 L/min；电喷雾电压为3 500 V；毛细管出口电压为150 V；锥孔电压为65 V；八极杆电压为750 V；扫描范围：m/z 100 1 000；参比离子正离子为：m/z 121.050 9、922.009 8。2 结果与讨论 2.1陈皮主要化学成分鉴定及其在陈化过程中的变化规律根据课题组前期的陈皮物质基础数字化研究结果10，在UPLCQTOF MS中，陈皮样品在负离子模式下得到的总离子流色谱图峰数很少，正离子模式下得到的总离子流色谱图峰数多且丰度高。因此，本实验采用正离子模式对陈皮样品进行分析，得到其总离子流色谱图（图1），根据图中色谱峰的精确质量数及同位素分布推测分子式，结合前期研究结果对主要化学成分进行鉴定（见表2）。图1正离子模式下陈皮提取物的总离子流色谱图Fig.1Total ion chromatogram of Pericarpium Citri Reticulatae extract in positive ion mode表2陈皮主要色谱峰的鉴定结果Table 2Identified results of the main components of Pericarpium Citri ReticulataeNo.1234567tR/min18.029.031.233.434.635.236.7M+H+/（m/z）611.196 1373.128 2373.128 7403.139 2433.149 2373.128 5389.120 3Error/（10-6）-1.4701.341.24-0.230.80-7.19MS/MS（m/z）465.141 8，449.146 6，431.136 5，413.124 9，345.098 7，303.088 3，129.055 2，85.029 4357.095 7，343.081 6，327.049 5，315.086 7，181.013 2，153.018 0357.096 8，343.081 3，327.049 5，315.086 5，181.012 7，153.018 1388.115 8，373.092 0，355.081 6，327.086 0，211.023 6418.126 4，403.103 4，385.092 4343.083 6，328.059 5，300.065 0，271.061 8，211.025 3，183.030 5373.092 7，359.078 1，341.067 6，316.059 6，197.008 5，169.013 9FormulaC28H34O15C20H20O7C20H20O7C21H22O8C22H24O9C20H20O7C20H20O8IdentificationHesperidin（橙皮苷）Isosinensetin（异橙黄酮）Dinensetin（甜橙黄酮）Nobiletin（川陈皮素）3，5，6，7，8，3，4-Heptamethoxyflavone（3，5，6，7，8，3，4-七甲氧基黄酮）Tangeretin（桔皮素）5-O-Desmethyl nobiletin（5-去甲川陈皮素）tR：retention time1009第 42 卷分析测试学报选取在同一种植园区、相同品种、相同采收时间及储存方式下陈化不同年份的陈皮样品为研究对象（S1 S7），采用“1.3”方法对样品进行检测。利用提取离子峰面积对不同年份陈皮样品中特征性成分的相对含量进行分析。结果显示，随着陈化时间的增加，陈皮样品中特征性成分的含量变化规律不明显（图 2）。这与其它研究结果一致7。陈皮样品受产地、采摘时间、品种等因素影响，个体差异较大，利用单一成分含量无法准确鉴定其陈化年份。2.2陈皮陈化年份相关的特征性成分研究利用Agilent MassHunter Profinder软件对“2.1”中 7 个代表性陈皮样品（S1 S7）的 UPLCQTOF MS数据进行色谱峰提取、对齐与匹配（峰面积与保留时间的偏差阈值分别为 5 000与 0.2 min），共得到626个化合物。陈皮中多甲氧基黄酮具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、降脂减肥、神经保护等药理活性，是陈皮的质量控制成分及药效物质1112。通过设置母离子质荷比范围13（m/z：250 465）、保留时间（15 min）且质荷比符合N规则等条件，在626个化合物中筛选出潜在的106个多甲氧基黄酮类化合物。陈皮中化学成分在陈化过程中会发生转化。随陈化时间的延长，底物含量降低，转化产物含量升高。其转化率随陈化时间而发生规律性变化。采用Matlab2022对106个化学成分的色谱峰面积与陈化年份进行分析，得到各色谱峰面积的两两比值与陈化年份的相关关系。以相关系数r 0.9或r -0.9为强线性相关标准，统计与至少10个化合物的峰面积比值和陈化年份具有强线性相关的化合物。确定了5个潜在的指标性成分，分别为C21H24O8（tR：33.2 min）、C19H20O6（tR：34.7 min）、C20H22O7（tR：28.0 min）、C20H22O7（tR：32.1 min）、C20H22O7（tR：35.5 min），其中3个化合物为C20H22O7（五甲氧基黄烷酮）的同分异构体。同时，该 3 个化合物与另 3 个分子式同为C20H22O7的化合物（tR分别为36.9、38.5、39.7 min）的峰面积比与陈化年份的相关系数均大于 0.90。对比不同年份样品中该6个同分异构体的提取离子色谱图（图3）发现，随着陈化时间的延长，化合物1、2、3的相对含量逐渐降低，而化合物4、5、6的相对含量逐渐升高。同分异构体间的相互转化是中药化学成分转化的重要方式之一。如绿原酸与新绿原酸，D-苦杏仁苷与L-苦杏仁苷均可发生相互转化1415。推测该6个同分异构体在陈皮陈化过程中相互转化。因此，选择该系列化合物作为陈化年份的指标性成分。2.3陈皮年份鉴别模型的建立本实验推测上述6个同分异构体在陈皮陈化过程中相互转化，通过优化方法，最终选取公式（1）建立6个特征成分转化因子（S）的计算方法。并选取29个样品为模型组，建立转化因子（S）与陈化年份（Y）的相关关系（图4），得到陈化年份（Y）的预测图36个同分异构体的提取离子色谱图Fig.3The extraction ion chromatograms of 6 isomers图4转化因子（S）与陈化年份（Y）的相关性Fig.4Correlation between conversion factor（S）and storage year（Y）图2不同年份陈皮样品中主要化学成分的含量变化Fig.2Variation of main components content in Pericarpium Citri Reticulatae of different storage years1010第 8 期周熙等：基于UPLCQTOF MS技术的陈皮陈化年份鉴别方法研究模型方程Y=（S-0.061 1）/0.107 6，其r2=0.90，p=7.61 10-15。利用建立的模型对训练集样品进行计算，其年份误差值|Y|见表3。由表可知，训练集中72.4%的样品预测误差|Y|1年，27.6%的样品预测误差为1年|Y|2年。所有样品的预测误差均 2年。S=A24+A25+A26A21+A22+A23（1）其中，S为转化因子，A1、A2、A3、A4、A5、A6分别为化合物1 6的峰面积。2.4方法验证利用剩余20个样品作为盲样对建立的方法进行验证，结果见表3。20个样品中，55.0%样品的预测误差|Y|1 年，35.0%样品的预测误差为1 年|Y|2年。剩余2个样品的计算误差分别为2.3年与3.3年。结果表明，90.0%的样品年份预测误差在2年内，本方法可靠，可作为陈皮年份鉴别的计算方法。本实验证明了利用陈皮内在化学成分的转化规律对陈皮陈化年份进行预测的可行性。但由于受储存条件的影响，部分样品的年份预测误差较大，需后续进一步研究。3 结论 本研究利用UPLCQTOF MS技术对不同年份陈皮样品进行检测，发现了陈皮在陈化过程中发生变化的部分特征性成分。6个分子式为C20H22O7的五甲氧基黄烷酮同分异构体在陈化过程中可能发生相互转化，可作为陈皮年份鉴定的指标性成分。同时，利用该6个特征性成分的转化规律建立陈皮陈化年份的计算模型，可实现陈皮年份的准确鉴别。该研究可为陈皮的质量控制提供科学依据，并为陈皮陈化的科学内涵研究提供了新思路。参考文献：1Yu M，Li S K，Yang F，Zheng Y，Li P，Jiang L W，Liu XJ.Instrum.Anal.（余梅，李尚科，杨菲，郑郁，李跑，蒋立文，刘霞分析测试学报），2021，40（1）：6571.2Bian X Q，Xie X Y，Cai J L，Zhao Y R，Miao W，Chen X L，Xiao Y，Li N，Wu J LFood Chem.，2022，373：131399.3Li C，Xiong Y，Gu L H，Hou H C，Li J MJ.Instrum.Anal.（李纯，熊颖，顾利红，侯惠婵，栗建明分析测试学报），2021，40（3）：370376.4Yu M，Li J Y，Fan W，Zheng Y，Li P，Jiang L W，Liu XFood Res.Dev.（余梅，李嘉仪，范伟，郑郁，李跑，蒋立文，刘霞食品研究与开发），2021，42（19）：171178.5Yang S Z，Li C，Li C，Wang Z Q，Huang L L，Ding QMod.Food Sci.Technol.（杨少壮，李灿，李辰，王志琪，黄略略，丁庆现代食品科技），2019，35（12）：258266.6Bao Y D，L Y Y，Zhu H Y，Zhao Y R，He YSpectrosc.Spectral Anal.（鲍一丹，吕阳阳，朱红艳，赵艳茹，何勇光谱学与光谱分析），2017，37（6）：18661871.7Wei Y，Li 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BChin.J.Exp.Tradit.Med.Formulae（汤庆发，谢颖，陈飞龙，郭阳，宋帅，罗佳波中国实验方剂学杂志），2013，19（8）：107109.（责任编辑：丁岩）表3陈皮年份预测模型的准确度Table 3Accuracy of storage year prediction model for Pericarpium Citri ReticulataeSetTraining setTesting setPrediction error|Y|Y|1year1 year 2 year|Y|1 year1 year 2 yearRatio/%72.427.60.055.035.010.01011