食管鳞癌患者外周血NK细胞...70蛋白水平检测及临床意义_蔡慧红.pdf

：基金 项 目：河 南 省 医 学 科 技 攻 关 计 划 省 部 共 建 重 点 项 目（）；河 南 省 医 学 科 技 攻 关 计 划（联 合 共 建）项 目（）第一作者简介：蔡慧红，硕士，研究方向：食管鳞癌及肿瘤免疫方向的研究。：通讯作者：马军，博士，副教授，研究方向：干细胞和免疫细胞转化、肿瘤发病机制研究。：；周博，博士，助理研究员，研究方向：食管磷癌发病机制研究。：食管鳞癌患者外周血 细胞、细胞中 蛋白水平检测及临床意义蔡慧红，邹 锋，李婧逸，银潇迪，张燕松，孙金旗，朱立强，陈茂才，温立鸿，周 博，马 军郑州大学第二附属医院 检验科；医学研究中心，河南 郑州【摘要】目的 检测食管鳞癌（，）患者外周血 细胞、细胞中 蛋白表达水平，并探索其对 的临床意义及预后价值。方法对前期 患者和健康人的外周血单个核细胞（，）质谱结果进行生物信息学分析，筛选出差异蛋白，流式细胞学验证 在 细胞和 细胞中的表达，分析两者的联系及临床意义。结果 蛋白质谱发现 个差异蛋白，其中 个蛋白上调，个蛋白下调，通过生信分析筛选出 蛋白。流式细胞术分析显示，肿瘤组的 中 细胞和 细胞的 荧光强度和阳性表达率均低于健康对照组。结论 我们获得了 患者 的差异表达蛋白谱，其中 在 患者 细胞和 细胞中表达降低显著，可能成为 外周血检测的生物标志物。【关键词】食管鳞癌；外周血单个核细胞；细胞；细胞；中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：，；，【】（），【】；食管癌是全球排名第七位的常见消化道肿瘤，年全球癌症统计数据显示，新增食管癌病例达 万例，死亡率排名第六位（死亡 万例）。我国是世界上食管癌高发的国家，发病率约，其中 的病理类型为食管鳞癌（，）。尽管近年来食管癌在新辅助治疗、微创手术治疗和现代精确放射治疗等方面取得了一定的进展，但由于约 的食管癌患者初诊时已发展为疾病晚期，且近 的患者术后会出现复发，导致患者的预后效果仍不显著。寻求 的早期筛查标志物是开发新的治疗策略和提高标准治疗效果的必要条件，对实现临床患者的精准治疗意义重大。胃肠病学和肝病学杂志 年 月第 卷第 期 ，对于 重点高发人群，胃镜作为早期筛查的重要手段，因其成本昂贵和有侵入性的特点，患者接受率不高。基于血液的筛查试验因其较小的侵入性和患者的高接受度而极具吸引力。外周血单个核细胞（，）含有大量免疫细胞，既可作为免疫功能评价的窗口，也可直接作用于外周血循环肿瘤细胞，因此，尽管自然杀伤（，）细胞及自然杀伤（，）细胞此类免疫细胞在外周血中占比较低，但其作为重要的杀伤细胞一直受到科学研究的重视。又名，是细胞核和细胞质中均存在的一种 修复因子，其通过中心结构域与（）形成异二聚体以结合双链，在诱导细胞凋亡过程中发挥重要作用。目前，在前列腺癌、胰腺癌、肺癌等实体肿瘤中有一定的研究进展，但较少有涉及与 相关的深入研究。本研究通过对 患者 的蛋白质谱结果进行生物信息学分析，寻找与 发生发展相关的特异性靶分子，筛选出下调的差异蛋白，探索 在 患者外周血 细胞和 细胞中的表达及其对于 预后分析和临床分析的潜在价值。材料与方法 病例样本收集本研究纳入了 年 月至 年 月于郑州大学第二附属医院初次就诊和治疗的 患者外周抗凝血样本 例，病理证实为，且无严重并发症；同时，收集了 名健康人外周抗凝血作为对照。本研究纳入的 患者及健康对照人群均已签署知情同意书，并已通过医院伦理委员会审批（批件号：）。本研究收集入组人群抗凝血 ，样本均于采血 内冰盒运送至中心实验室，当天进行实验。试剂与设备 抗体购自 生物技术公司（货号：）。表染抗体购自 公司，分别为 （货号：），（货号：），（货号：）。红细胞裂解液购自 公司（货号：）。驴抗 兔 购 自 公 司（货 号：）。购自 公司（货号：）。流式细胞仪（）购自必达科生物科技有限公司。方法 蛋白质谱结果的生物信息学分析：前期，本实验室通过质谱技术获得了 对健康人与 患者 的差异蛋白谱。本研究对前期质谱分析中发现的差异蛋白进行了生物信息学分析，首先利用 语言编程进行 通路富集分析和 功能富集分析。在 数据库中（：）进行差异蛋 白 的 蛋 白 互 作 分 析（，），搜索已知蛋白之间和预测蛋白之间的互相作用。流式细胞学验证实验：取外周抗凝血每管，标记分组，每组设置未染色管、表面染色管和实验管，将红细胞裂解液按 的比例加入样本，室温裂解 。，离心 ，弃上清，加入 流式缓冲液清洗 遍，获得（）个。按抗体说明配制、和 混合抗体，避光孵育 。后续使用 固定液：，避光孵育 ；破膜液：，避光孵育 。离心去除破膜液后，配制 兔源单克隆抗体，避光孵育 ，流式缓冲液漂洗，配制 标记的驴抗兔 抗体，避光孵育二抗 。流式缓冲液洗去浮色，以 缓冲液重悬，在 内使用 流式细胞仪上机检测。统计学分析采用 软件进行统计学分析。使用 软件（，）分析流式细胞术检测结果。两样本均数的比较采用独立样本 检验或非参数检验；多组间样本均数的比较采用单因素方差分析。所有数值均代表至少 次实验结果的均值，为差异有统计学意义；所有的误差靶线代表均数标准误。结果 生物信息学分析 质谱结果显示，差异倍数 倍以上的蛋白有 个，其中上调蛋白 个，下调蛋白 个。经筛选，差异显著性 的上调蛋白 个，下调蛋白 个，因此，本研究分别选取上调差异蛋白和下调差异蛋白中的前 位进行蛋白聚类分析比对（见图）；并选取上调差异蛋白和下调差异蛋白中的各前 位进行 富集分析和 富集分析；选取下调蛋白前 位进行 分析。富集分析发现这 个蛋白主要富集在以下通路如碳代谢、补体和凝血级联、柠檬酸循环（循环）、剪接体、血小板激活、细胞凋亡、中性粒细胞胞外陷阱形成等（见图）。在 富集分析中，其参与的主要生物学进程（，）有凋亡信号通路前体代谢物的产生及能量调控；细胞成分（，）有分泌颗粒管腔、胞浆泡、管腔泡；分子功能（，）包括钙黏着蛋白结合、肌动蛋白结合、碳氧裂解酶活性等（见图）。此外，我们还对下调的 个差异倍数较大的蛋白进行胃肠病学和肝病学杂志 年 月第 卷第 期 ，分析，其中、等是重要的节点基因，这些基因多与 损伤修复、细胞信号转导、加工及代谢、细胞免疫等方向相关（见图）。综合以上分析，本实验选择了在 网络中节点较多的，有显著差异的 蛋白进行后续表达验证，探索其与 之间的联系。注：代表肿瘤患者外周血样本，代表健康人外周血样本；即。图 前 位上调差异蛋白和前 位下调差异蛋白的聚类分析图 注：前 位上调和 位下调差异蛋白的 富集分析；：前 位上调和 位下调差异蛋白的 富集分析。图 对质谱分析的差异蛋白进行 富集分析和 富集分析 胃肠病学和肝病学杂志 年 月第 卷第 期 ，图 前 位下调差异蛋白的 分析 在 患者外周血 细胞、细胞中低表达 为了进一步探究 蛋白在 中的表达，我们利用流式细胞术对 进行了亚群区分，并检测 蛋白在 细胞和 细胞中的阳性表达率和平均荧光强度。每个样本将通过、表面抗体染色进行分群划门，利用 及 门控圈选出淋巴细胞群整体，利用 和 门控去除粘连的细胞，再根据表面抗体对应的荧光通道，圈出 细胞亚群；对于 细胞亚群，则需要先利用 和 门控圈选出 的细胞亚群，再利用 和 双门控分出双阳细胞，最后使用直方图显示 阳性细胞群（见图）。图 划门策略图 胃肠病学和肝病学杂志 年 月第 卷第 期 ，结果显示，相较于健康对照组（），蛋白在 肿 瘤 组（）的 细 胞 和 细胞中表达明显降低。在 组 细 胞 中 的 阳 性 表 达 率 为（）（），在 细 胞 中 为（）（），均低于健康对照组。对于荧光强度，在 组 细胞中 的荧光强度为（），在 细胞中为 （），相对健康对照组也均为显著下降趋势（见图）。注：健康人与 患者外周血 细胞、细胞中 蛋白的流式划门；：在 细胞和 细胞中的阳性表达率；：分别在 细胞和 细胞中的平均荧光强度（，）。，。图 流式细胞术检测 蛋白在外周血 细胞、细胞中的表达 的低表达促使 患者的免疫细胞增殖能力下降 本研究通过流式细胞术验证了 在 患者 的 细胞及 细胞中表达量下降，这可能标志着 患者的 细胞或 细胞增殖能力、转录能力变弱，并提示 患者 细胞或 细胞的基因修复能力可能降低，推测 表达量降低可能是 发生发展的重要因素之一。此外，数据库（：？）中也显示，在各类肿瘤包括膀胱癌、肺癌、头颈部鳞癌、食管腺癌等组织中，的低表达均显示出较差的总生存期（，）和无进展生存期（，）。因此，也与本研究外周血中的表达结果一致。讨论自质谱技术发展以来，肿瘤的蛋白质组学相关性研究开始蓬勃发展，给临床诊疗提供了许多支持和证据。研究表明，富含免疫抑制细胞群，这些免疫抑制细胞可能有助于免疫逃逸并促进肿瘤进展，本研究利用质谱技术对 的 进行检测，筛选蛋白质差异表达谱，旨在寻找与 发生发展相关的特异性靶向分子标志物。质谱分析显示，患者和健康人 中蛋白差异 倍以上的有 个，本研究筛选出显著差异的上调蛋白和下调蛋白各 位，通过 富集和 富集分析，重点关注其中与免疫调控及相关功能的基因。研究报道，与多种癌症的发生发展有联系，是抗癌药物的靶点，在 修复和复制过程中发挥着 关 键 作 用。研 究 表 明，可 与 形成异源二聚体，或独立于 存在。在 等的研究中，单基因敲除鼠成熟 淋巴细胞较少且胸腺淋巴瘤发病率较高，成纤维细胞转化率较高，因此推测 基因可能与免疫细胞的增殖转化能力有一定联系，不过这些差异背后的机制仍不清楚。由于活细胞需要数千种蛋白质正常运行其功能，而每一种蛋白质均可能因其基因突变而受损，因此，只有当生物的 序列保持不变并被准确地复制，才能保持生命的延长。在 等的报道中提出，异源二聚体的表达减少与 淋巴细胞中胃肠病学和肝病学杂志 年 月第 卷第 期 ，蛋白激酶亚基的转录、蛋白表达和磷酸化的上调同时发生，这将限制 的修复能力，进一步将影响免疫细胞的增殖和过早的免疫衰老。同时，修复能力的降低还与乳腺癌患者肿瘤浸润淋巴细胞（，）数量高相关，两者之间的相互作用可以促进侵袭性肿瘤表型。研究表明，的 检测可能在应答 感染的免疫细胞募集中起关键作用；且在肝细胞癌（，）中，介导的免疫活性缺乏会导致 和 表达减少，从而促进 的发展，而 的异位表达也通过恢复细胞的衰老反应和激活免疫网络来防止 的发生和发展，从而诱导有效的自噬降解，去除积累的活性氧，减少 损伤，减缓增殖，并促进 缺陷肝脏的程序性细胞死亡。此外，等的研究发现，食管癌细胞系中 表达水平与放射敏感性相关，综合本研究结果，我们推测 在 患者外周血中的低表达也许与部分 患者放疗后预后差有关。本研究对 患者和健康人 的差异蛋白谱进行了生物信息学分析，首次研究了 在 患者外周血 细胞和 细胞亚群中的表达。蛋白的低表达可能成为 的潜在生物标志物，但其生物学功能需进一步细胞学和信号通路实验得到验证，本研究为 能否作为 特异性靶分子提供了一定证据。参考文献 ，：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，？，（）：（），（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：胃肠病学和肝病学杂志 年 月第 卷第 期 ，