NF2蛋白518位丝氨酸磷酸化状态对其分子内相互作用机制的结构生物学及生物化学研究.pdf

复 里 学 Un 揠 i v 医 学 版 SFu d a n Un i v J Me d S c 2 。 1 5 J u 1 ，4 2 ( 4) i 一 4 3 5 N F 2蛋 白 5 1 8位 丝氨酸磷 酸化状态对其分子 内 相互作 用机 制的结构 生物学及 生物化学研究 巩 微 徐海鸣 孙 昶 徐彦辉 李 泽 王 平 ( 复旦 大学生物 医学研究院结构生物学实验室 上海2 0 0 0 3 2 ) 【 摘要】 目的 揭 示 NF 2( n e u r o f i b r o ma t o s i s t y p e 2 ) 蛋 白 5 1 8位丝 氨酸的磷 酸化如何对其 结构 与功能进行调 节。方法解析 野生 型 N F 2 ( 无模 拟磷酸化突变) 和突变 型 NF 2 ( 模 拟 5 1 8位丝 氨酸被 磷酸化 的突变 体) 蛋 白的晶体 结构 ， 进一步利用体外 P u l l - d o wn实验及荧光 共振能量转 移( f l u o r e s c e n c e r e s o n a n c e e n e r g y t r a n s f e r ， F R E T) 实验检测 了 NF 2的分子 内相互作用 。结果 由于 N F 2的 c _ 端在结 晶过程 中降解 ， 未能观察到 NF 2 和 N F 2 。 两种 蛋白质构象的差异 ， 结构 分析发 现 NF 2的 N一 端 F E R M( F o u r - p o i n t o n e ， E z r i n ， R a d i x i n ， Mo e s i n ) 结 构域与已有结构报道的 F E RM 结构域具有相似的空间构象 。体外 P u l l d o w n实验证 明生化实验结果提 示 ， 相对 NF 2 C 一 端蛋 白质而言 ， NF 2 的 C _ 端蛋 白质与 NF 2的 N 一 端蛋 白质结合更强 。F RE T实验在波长 5 2 5 n m处 ， 检测到全长 NF 2 比全长 NF 2 产生更 强的 F RE T信号 。结论野生型 N F 2 w T 处于 “ 开放” 状态 而模拟磷 酸 化的突变型 NF 2 。 处于“ 闭合” 状态 。 【 关键词1 N F 2 ； 磷酸化 ； 晶体 结构 ； 开放构象 ； 闭合构象 【 中图分 类号1 Q5 1 8 2 【 文献标志码】 A d o i ：1 0 3 9 6 9 j i s s n 1 6 7 2 - 8 4 6 7 2 0 1 5 0 4 0 0 2 St r u c t u r a l a n d bi o c he m i c a l i n s i g ht s i nt o t he me c ha ni s m f o r i n t r a mo l e c u l a r i nt e r a c t i o n i n NF2 r e g u l a t e d b y p h 0 s p h0 r y l a t i 0 n o f s e r i ne 5 1 8 GONG W e i I，XU H a i mi n gI，SUN Ch a n g，XU Ya n hu i ，LI Ze，W ANG Pi ng 5 ( S t r u c t u r a l Bi o l o g y La b， I n s t i t u t e s o f Bi o me d i c a l Sc i e n c e s ， Fuda n Un i v e r s i t y， Sha ngha i 2 00 03 2， Chi na) A b s t r a c t O b j e c t i v e To r e v e a l t h e s t r u c t u r a l a n d b i o c h e mi c a l me c h a n i s m f o r i n t r a mo l e c u l a r i n t e r a c t i o n i n n e u r o f i b r o ma t o s i s t y p e 2 ( NF2)r e g ul a t e d b y p ho s p h o r y 1 a t i o n o f s e r i ne 5 1 8 M e t h o d s W e r e s o l v e d t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s o f wi l d - t y p e NF2 ( NF2 w ) wi t h o u t mi mi c p h o s p h o r y l a t i o n mu t a n t a n d a p h os p h o r y 1 a t i o n mi mi c mu t a nt p r o t e i n (NF2 S 5 D) Fu r t h e r ，i n v i t r o Pu l l d o wn a s s a y a n d f l u o r e s c e n c e r e s o n a nc e e n e r g y t r a n s f e r (FRET) a s s a y we r e e x e c u t e d t o de t e c t t h e i n t r a mo l e c u l a r i nt e r a c t i on o f NF2 Re s u l t s No o b v i o u s c o n f o r ma t i o n a l d i f f e r e n c e wa s o b s e r v e d b e t we e n t h e s t r u c t u r e s o f NF2 a n d NF2 b e c a u s e o f t h e u n e x p e c t e d C t e r mi na 1 d e g r a d a t i o n o f NF2 d u r i n g c r y s t a l l i z a t i o n St r u c t u r a l a n a l y s i s i n d i c a t e d t h a t t he FERM( Fo ur p o i n t o ne ， Ez r i n， Ra d i x i n， M o e s i n) d o ma i ns o f NF2 w T a nd NF2 。 。a d o p t e d s i mi l a r c o n f o r ma t i o n t o t h a t o f t he r e p o r t e d FERM d o ma i n s 国家 自然科学基金 ( 3 1 0 0 0 3 2 5 ) Co - f i r s t a u t h o r s C o r r e s p o n d i n g a u t h o r E ma i l ： w a n g p i n g 6 3 8 h o t ma i l C O W l 4 3 6 复旦学报( 医学版 ) 2 0 1 5年 7月 ， 4 2 ( 4 ) I n v i t r o Pu l l d own a s s a y s ho we d s t r o ng e r i nt r a m o l e c ul a r i nt e r a c t i o n b e t we e n t he N t e r m i n us a nd C- t e r mi nu s o f NF2 ，c o mpa r e d wi t h t ha t wi t hi n NF2 w T I n FRET a s s a v。NF2 S S l S D g e n e r a t e d s t r o n g e r F RET s i g n a l t h a n NF2 w a t t h e wa v e l e n g t h o f 5 2 5 n m C o n c l u s i o n s Th e NF2 w p r o t e i n a d o p t e d a c l o s e d f o r m wh i l e t h e wi l d p h os p h o r y l a t i o n mi mi c NF 2 S 5 D mut a n t p r e f e r s a n o p e n f o r m Ke y wo r d s NF 2； p h o s p h o r y l a t i o n ； c r y s t a l s t r u c t u r e ； o p e n f o r m； c l o s e d f o r m * Th i s s t u d y wa s s u p p o r t e d b y t h e t i o nal Na t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f Ch i n a ( 31 0 0 0 3 2 5) NF 2是 由位 于 2 2号 染 色体上 的抑 癌基 因 NF 2 所 编码 的蛋 白质 ， NF 2基 因的 失活 会造 成 神 经性 纤 维瘤 病 型 ( n e u r o f i b r o ma t o s i s t y p e 2 ， NF 2 ) 的 发 生 l 1 2 3 。研究 发 现 ， N F 2蛋 白 的异 常可 能 导 致 散 发 性 的许 旺氏 细胞瘤 、 脑脊 膜瘤 、 室 管膜瘤 以及 肾细胞 癌 、 黑色 素瘤 、 胶质母 细 胞瘤 、 大肠 癌 、 乳 腺癌 等 多种 肿 瘤 的发 生l_ 3 。 目前 的 研究 表 明 ， NF 2可 以 在 细 胞 质 中以及 细 胞核 中发 挥不 同功 能 。在 成角 质细 胞 和皮肤上皮 中， NF 2可以被招募到 a c a t e n i n处并促 进 a c a t e n i n与 P a r 3 ( p u l mo n a r y a d e n o ma r e s i s t a n c e 3 ) 的相互 结 合 ， 起 到 帮 助 黏 附 连 接 成 熟 的 作 用 。 。 在 紧 密 连 接 处 ， NF 2通 过 与 血 管 动 蛋 白结 合 释 放 Ri e h ( GT P a s e Ra c 激活 蛋 白) 来 使 Ra c 失 活 ， 调 节 细 胞 的接触抑制进而减弱有丝分裂信号 ， 甚至可能有 抑 制肿 瘤 的 作 用 1 。在 细 胞 核 内 ， NF 2可 以 与 C R L 4 D c A F 结 合 并抑 制 其 E 3泛素 连 接 酶 活性 ， 因为 C RI 4 D C 可 以调 节 许 多 与 转 录 和 表 观遗 传 有 关 的 蛋 白质 ， NF 2被 认 为在 进 入细 胞 核后 可 以对 基 因 的 表 达进 行调 控 _ 1 。另外 ， 最 新研 究 发 现 ， NF 2还 可 以通 过 C R I 4 A F 调 控 I a t s l 2 ( 1 a r g e t u mo r s u p p r e s s o r k i n a s e 1 ) 或 直 接 调 控 I a t s l 2 2 ， 达 到 调 节 Hi p p o 信 号通 路 活性 的 目的 。 NF 2与 E R M ( E z r i n ， R a d i x i n ， Mo e s i n ) 蛋 白 为 同源蛋 白 ， 均 属 于 B a n d 4 1超 级 家 族 。这 4种 蛋 白质 的 N 端 均 有 一 个 F E R M ( F o u r p o i n t o n e ， E z r i n ， Ra d i x i n ， Mo e s i n ) 结构 域 ， C 一 端 为 一 段 亲水 的 尾 巴 ， 其 间 为 c o i l e d c o i l 结 构 。这 类 蛋 白质 生 物 活 性的调控可通过其分子 内相互作用的改变来实现。 与 E R M 蛋白相似 ， NF 2特定位 点的氨基酸被磷酸 化后 ， 其 活 性 状 态 会 发 生 改 变 ， 如 N F 2 C 一 端 第 5 1 8 位 丝 氨 酸 可 以 被 激 活 后 的 P AK ( P 2 1 一 a c t i v a t e d k i n a s e ) 磷 酸化 ， 导致 其 分 子 内相互 作 用 改 变从 而使 蛋 白失 活l_ 2 引。虽然 NF 2活 性 的调 节 方 式 已经 被 研 究得十分清楚 ， 但是 由于缺少全长结构 ， 目前仍无法 从原 子水 平证 实 NF 2的 分子 内相 互 作 用 机 制 及 其 活性 调节机 制 。 在 NF 2的十 余种 亚型 中 ， 关 于 NF 2 1和 N F 2 2 两 种亚 型 的研究 最多 ， 其 中 N F 2 1为 主要 表 达 的 亚 型 ( 以下 均 称 NF 2 ) E a t, 3 。 自 1 9 9 7年 起 ， 多 项 研 究 认 为 ， NF 2 2不 具有 抑 制 肿 瘤 生 长 的 活 性 ， 且其 N 端 的 F E R M 结 构域 和 C端 结 构 的分 子 内相 互 作 用 很 弱 ， 即其 构 象一直 处 于“ 开 放” 状 态 ； 有抑 制细胞 生 长 活 性 的 NF 2与 之 相 反 ， 为 “ 闭 合 ” 构 象 ， 即 N 端 F E RM 结构域与 c端尾巴紧密结合 ， 而失活的 NF 2 为 “ 开放 ” 构 象 _ 2 捌 。而 较 新 的研 究 结 果 恰 与 此 相 反 ， 研究认 为 ， 5 1 8位 丝 氨 酸 未 被 磷 酸 化 的 NF 2与 NF 2 2均 处 于 “ 开放 ” 的构 象 ， 且 具 有 抑制 细 胞 生长 的活性 。 而 5 1 8位 丝 氨酸 被 磷 酸 化从 而 失 活 的 NF 2 则处 于“ 闭合 ” 构象 。 有研 究表 明 ， NF 2的 5 1 8位 丝 氨 酸 突 变 为 天冬 氨 酸后可 以模 拟该 位点 的组 成 型磷 酸化 ， 且 NF 2不 再具 有正 常 的抑 制 肿 瘤 生 长 的功 能I 2 。基 于 以上 背 景 ， 本 研 究 对 野 生 型 NF 2 w T 和 突 变 型 NF 2 。 ( 5 1 8位 丝 氨 酸 突 变 为 天 冬 氨 酸 ) 进 行 了表 达 与 纯 化 ， 希 望 通 过 结 构 生 物 学 的 手 段 ， 直 接 观 察 两 种 NF 2的构象 ， 进 一 步通 过 体 外 P u l l d o wn实 验 和 荧 光共 振能 量 转 移 实 验 ， 检 测 NF 2的 分 子 内 相 互 作 用 ， 对 N F 2的分子 内相互 作 用机制 及 其活 性 调节 机 制作 出解 释 。 材 料 和 方 法 材 料 来 源 NF 2全 长 c DNA 由复 旦 大 学 生 物 医学研 究 院 MC B实 验 室 管 坤 良教 授 馈 赠 ； C F P和 Y F P荧光 蛋 白基 因 由华 东 理工 大 学 杨 弋教 授 提 供 ； 大肠埃 希 菌 T o p 1 0和 B I 2 1 ( DE 3 ) 感 受 态 菌 株 、 原 核表 达 载 体 p GE X 6 p 一 1 一 Hi s 、 用 于 F RE T 实 验 的 载 体 p E T 2 8 一 F R E T、 3 C蛋 白酶 等 均 由本 实 验 室 制备 ； 巩微 ， 等 N F 2蛋A 5 1 8 位 丝氨酸磷 酸化状态对其分子 内相互作用机制 的结构生物学及生 物化 学研 究4 3 7 P C R引 物 购 自 I n v i t r o g e n公 司 ； P h a n t a D NA 聚 合 酶购 自诺 唯赞 生物 公 司 ； KOD p l u s D NA 聚合 酶 购 自 T OY OB O 公 司 ； 限 制 性 内 切 酶 购 自 T a k a r a公 司 ； 质 粒 抽 提 试 剂 盒 购 白 S o l a r b i o公 司 ； 胶 回 收 、 P C R产 物 回收试 剂 盒 购 白 Ax y g e n公 司 ； 蛋 白纯化 使 用层 析 柱 及 柱材 均 购 自 GE He a l t h c a r e公 司 ； 结 晶初筛 商业 试 剂盒 分 别 购 自 Ha mp t o n Re s e a r c h公 司和 E me r a l d B i o S t r u c t u r e s 公 司 ； 各 类 试 剂 分 别 购 白生 工生物 工程 ( 上 海 ) 股份 有 限公 司 、 国药 集 团 化 学 试 剂有 限公 司 、 AMR E S C O公 司 、 S i g ma 公 司 。 野生 型 NF 2蛋 白表 达 片段 的构 建 全 长 NF2 共有 5 9 5个 氨基酸 。通 过 Ge n e R u n n e r 软件 分析 c DNA序 列 并 设 计 P C R 引 物 ( 表 1 ) 。 以人 源 NF 2 c DNA作 模板 进行 P C R扩 增 ， 回收 DNA 片段 ， 使 用 B a mH 工和 E R 1分 别 对 DNA 片段 及 载 体 进 行 双 酶切 ， 回收 酶 切 产 物 。片 段 和 载 体 用 T 4酶 连 接 后 转人大 肠 埃希 菌 T o p l O中 ， 在 含相 应 抗 生 素 的 固 体平 板 上培 养 ， 挑 取单 克隆 以 P C R方法 检测 阳性 克 隆 。通过 DNA 测 序 的 方 法 ( 上 海 铂 尚生 物 技 术 有 限 公 司) 鉴定 重组 质粒 的序列 是 否完全 正确 。 表 1 针对野 生型 N F 2 不 同蛋 白表达片段的引物序列 Tab 1 Pr i me r s u s e d f o r d i f f e r e n t pr o t e i n e x pr e s s i o n i n wi l d t yp e NF2 c o ns t r u c t s ：_ - _ - - 兰 苎 唑 羔 噬堕 篷量 薹 立 NF2 1 8 F Ba mH I CGGGATCCCAACCCAAGACGTTC NF 2 5 1 3 F - B a mH I C GGGAT C C GAC ATGAA GC GGC T TTC NF2 3 4 4 R E c o R I C GGAATT C TT AC T GC TT C TC TC G AGC NF2 59 5 R Ec o R I CGGAATTCTTAGAGCTCTTCAAAG 突变 体 N F 2蛋 白表 达片 段 的构 建将 NF 2的 5 1 8位 丝氨 酸 ( S e r i n e ， S ) 突 变 为 天 冬 氨 酸 ( As p ， D) 以模 拟 5 1 8位 丝氨 酸 的 磷 酸化 状 态 ， 重 组 蛋 白称 为 NF 2 ” 。 。以测序正 确 的野生 型 NF 2重组 质粒 为 模 板 ， 用 含有 突变 序列 的 P C R引 物 ( 表 2 ) 对 目的片 段 进 行 扩增 。用 限制性 内切 酶 Dp n I消化 模 板质 粒 ， 将 产物 转入 大肠 埃希 菌 To p l 0中 ， 在 含相 应 抗 生 素 的 固体 平板 上 培 养 ， 挑 取 单 克 隆 通 过 D NA 测 序 的 方 法鉴 定重 组质 粒 的序列 是否 完全 正确 。 表 2用于突变体 N F 2结构的引物序列 Ta b 2 Pr i me rs u s e d i n mut a t e NF2 c on s t r u c t s NF2 一S 5 1 8 D_ F C AT GAAGC GG CT TGA CAT GGA GAT AGAG NF2 一S5 1 8 D _ R CTCTATCTCCATGTCAAGCCGCTTCATG NF 2重 组 蛋 白的 表 达 与 纯化 将 鉴 定 正 确 的 重组 质粒 转入 大肠 埃希菌 B L 2 1 ( DE 3 ) 中表 达 ， 经 反 复测试 ， 使 用 2 YT培 养基 、 低 温 ( 1 5 ) 诱导 表 达 的条件下 ， 蛋 白产量较高、 性质较好 。3 7培养至 菌液 的 D值 为 0 6 0 8 ， 降温 至 1 5 C， 加入 终 浓 度 1 mmo l L的 I P TG诱 导重组 蛋 白的表 达 ， 低温 培养 1 6 h后 收 集 菌 体 。菌 体 用 裂 解 缓 冲 液 充 分 重 悬 后 高压 破 碎 ， 细 菌裂 解 液 使 用 高 速 离 心 机 3 0 9 9 6g 低温( 4) 离心 4 0 mi n ， 收集上清液 。接下来 的步 骤 均在 4 冷库 中进行 。 将上 清 液缓缓 通 过 Ni 亲 和层 析 柱 ， 上样 完 毕 后 ， 使 用洗 涤 缓 冲 液 冲 走 非 特 异 性 吸 附 的杂 蛋 白 。 向吸 附 了 目的 蛋 白 的柱 内加 入 1 mL浓 度 为 0 5 mg mL的 3 C蛋 白酶 ， 与 柱 材充 分 混 匀 ， 酶 切过 夜 。 不 同 的是 ， NF 2 5 1 3 - 5 9 5和 N F 2 5 1 3 - 5 9 5 S 5 1 8 D 为 GS T P u l l d o wn的饵蛋 白， 亲和层析后直接用洗脱 缓 冲液洗脱 ， 进 行纯 化及 缓 冲条件 的更 换 。 用洗 脱 缓 冲液 洗 脱 充分 酶 切 后 的蛋 白 ， 稀 释 后 使用 AKT A P u r i f i e r蛋 白纯化仪进行 阴离子交换 柱层析， 用 S DS P AGE检测紫外吸收峰处的蛋 白样 品， 收集浓度较高且 杂带较少 的蛋 白样 品， 浓缩 至 1 mL以 内 。 利 用 凝 胶 过滤 层 析 进一 步 纯 化 ， 同时更 换 缓 冲 液 。用 S DS P AGE检测 紫外 吸收 峰处 蛋 白样 品 ， 收 集纯度高的 目的蛋 白样品浓缩至适合 的浓度 ， 分装 于 1 5 r n L离心管 中， 液氮速冻后保存于 一8 0冰 箱 中备 用 。 N F 2重组 蛋 白晶体 的筛选 和优 化 本研 究采 用 气相悬滴法筛选和优化蛋 白晶体， 初筛使用商业化缓 冲液( Wi z a r d工 、 9 6个 结 晶 条 件 ， C r y s t a l s c r e e n I 、 9 6个结 晶条 件 ， I n d e x 9 6个 结 晶条件 ， S a l t 9 6个 结 晶 条件 ， P E G I o n工 、 9 6个 结 晶条 件 ， P E G R x I 、 9 6 个结 晶条 件 ) ， 将 NF 2 1 8 5 9 5蛋 白、 NF 2 1 8 5 9 5 $ 5 1 8 D蛋 白( 均 为 1 0 mg mL ) 与池液 1 ： 1 昆 合 。晶体 在 4或者 1 8恒 温箱 内生 长 。3天后 在倒置 显微 镜下 观察 液滴 内是 否有 晶体长 出 ， 筛选 到质量 较好 的 晶体 的初 始生长条件 后 ， 根据初 始生长条 件分 别对沉 淀剂浓 度 、 缓 冲液 p H 进 行 变 动 ， 以上 述相 同方 法筛 选 晶体 。 对 晶体 进 行 防冻 处 理 时 ， 防冻 液 成 分 为 晶体 生 长缓 冲液 加 2 0 的甘 油 ， 采 用 慢 平 衡 的方 法 处 理 ， 平衡 好 的晶体 迅速 转移 至液 氮 中保 存 。 晶体 数 据收 集及 结构解 析 在上 海 同步辐射 光 4 3 8 复 旦学报 ( 医学版) 2 0 1 5年 7月 ， 4 2 ( 4 ) 源 S S R F B L 1 7 U 线 站 内 C e n t OS操 作 系 统 中运 行 的 B l u i c e 控制系统控制收集 晶体衍射数 据， 数据收 集采用 回摆 法 。 衍射 数 据 收集 完 成 后， 使 用 HKL 2 0 0 0软 件 包 l 3 。 处 理 。采 用 分 子 置 换 法 解 析 相 位 ， 依 次 用 C C P 4软 件 包口 妇中 s c a l e p a c k 2 mt z 、 ma t t h e ws e o e f 、 p ha s e r MR用搜索模型进行分子置换 ， 找到对应的 解 。随 后 在 P HE NI X 软 件 包 中 使 用 p h e n i x r e f i n e中刚体修正、 拟退火修 的测率进行修正。在 C OOT l 3 中根据 对 应 的 电 子 密 度 图 进 行 手 动 的搭 建与修正 ， 并用 p h e n i x r e f i n e进行结构优化 。通过 多轮 的手 动搭建 和 软 件优 化确 定 最 终 的 结构 模 型 。 最终根据 R wo r k值和 R f r e e 值来评价模型搭建的 质量并使用 P R OC HE C K 3 来 确定二 面角等立体 化 学参 数是 否合 理 。 G S T P u l l - d o w n实验为 检 测 5 1 8位 丝 氨 酸 的 磷 酸化对 于 NF 2 蛋 白分 子 内相互 作用 的影 响 ， 将 有 GS T 融 合 标 签 的 NF 2蛋 白 GS T NF 2 5 1 3 5 9 5 、 GS T NF 2 5 1 3 5 9 5 S 5 1 8 D作为饵 蛋 白， 与 不含 GS T 标签 的靶 蛋 白( NF 2 1 8 3 4 4 ) 按 照 1 ： 1 0的摩 尔 比 混 合 。结 合 缓 冲 液 成 分 为 2 0 mmo l L T r i s HC 1 ( p H=8 0 ) ， 1 1 0 mmo l L Na C 1 ， 体 积分数 分别 为 0 3 的 Tr i t o n X 一 1 0 0和 5 的甘油 。4。 C 孵育 2 h ， 1 2 0 0 0 x g离心 2 mi n 后将上清与 1 0 L用结合缓冲 液平衡过 的 GS T柱 材混 合孵 育 1 h 。用缓 冲液清 洗 G S T柱材 4 5次 ， 用 S D S - P A GE检测结合情 况 。 体 外荧 光共 振 能量 转 移 ( f l u o r e s c e n c e r e s o n a n c e e n e r g y t r a n s f e r ， F R E T ) 实验为 检 测 5 1 8位丝 氨 酸 的磷 酸化 对 NF 2蛋 白分子 内相互 作用 的影 响 ， 将 供 体 C F P荧 光 蛋 白融 合 于 NF 2蛋 白 的 N 端 ， 受 体 Y F P荧光蛋 白融合于蛋 白的 c端 ， 检测 NF 2蛋 白 的荧光 强度 。C F P 、 YF P荧光 蛋 白距 离 在 1 0 n m 以 内时 ， C F P被 激 发 后 的发 射 光 与 Y F P吸 收 光 光 谱 重 叠 ， 因而发 生 能 量 转 移 ， 供 体 C F P的荧 光 强度 会 大 大 降低 ， 仅 可检 测 到 YF P发 射 光 ； 若 YF P与 C F P 相距 较远 ， 则 YF P无 法 吸收 C F P的发 射 光 ， 因 而 只 能检测到 C F P的发射光 。 实验 组为 融合 有 C F P和 YF P 的 NF 2蛋 白 ， 阴 性对照组使用终浓度 0 1 的 S D S处理 ( 使蛋 白变 性而 构象 开放 ) ， 以 4 3 ( ) n m 波长 激发 光激 发 C F P并 测 量 4 5 5 6 0 ( )n m 波长 范 围 内的数 值 ， 每 个孑 L 的数 值 由 S y n e r g y 4 酶 标 仪 读 取 ，数 据 使 用 软 件 Mi c r o s o f t Of f i e e Ex c e l 处 理 。 结 果 NF 2重 组 质 粒 的 构 建 以 往 研 究 结 果 表 明 ， NF 2蛋 白第 5 1 8位丝 氨 酸 的磷 酸化 对 NF 2的构 象 及 生 物功 能均有 重要 影 响 。本 研究 采用 5 1 8位丝 氨 酸 突变 为天 冬 氨酸 以模拟 S 5 1 8磷 酸化状 态 的策 略 ， 设 计 了 用 于 晶 体 筛 选 、 G S T P u l l d o wn 实 验 和 F R E T实 验 的不 同重组 质粒 ( 表 3 ) 。 表 3用于不 同实验而设计的重组质粒 Tab 3 Re c o mb i n an t pl a s m i d s d e s i g ne d f o r di f f e r e nt e x p e r i me n t a l p ur p o s e s NF 2重 组 蛋 白的 表 达 与 纯 化 经 过 对 缓 冲 液 p H、 盐 浓度 、 添加 剂 以及纯 化方 式 的反 复优 化 ， 本 研 究 最终 选取 Ni 亲和层 析一 阴离 子交 换柱 层 析一 凝胶 过 滤 层析 的纯 化策 略 ， 各 种缓 冲液成 分如 下 ： 裂 解 缓 冲 液 ： 5 0 mmo l L Tr i s HC 1( p H 8 O ) ， 3 0 0 mmo l L Na C 1 ； 洗 涤 缓 冲液 ： 5 0 mmo l L Tr i s HCl( P H = 8 0)，3 0 0 mmo l I Na Cl ，2 5 mmo l L咪 唑 ； 洗 脱 缓 冲 液 ： 5 0 mmo l L T r i s HC 1 ( p H =8 0 ) ， 3 0 0 mmo l L Na C 1 ， 2 5 0 mmo l I 咪唑 ； 离 子交换 层 析缓 冲液 A： 2 0 mmo l L T r i s HC 1( p H =8 ( ) ) ， 2 mmo l L D TT； 离 子 交 换 层 析 缓 冲液 B： 2 0 mmo l L Tr i s HCl( P H ：8 0 ) ， 1 mo l L Na Cl ， 2 mmo l L D TT； 凝 胶 过 滤 层 析 缓 冲 液 ： 2 0 mmo I I Tr i s HC 1( p H = 8 0)， 1 5 0 mmo l L Na Cl ， 及2 mmo l I 的 DTT。 Ni ”一 N TA 对 NF 2 一 N 蛋 白有较 强 的吸 附性 ， 3 C 巩 微 ， 等 NF 2蛋 白 5 1 8位丝氨酸磷酸化状态对其分子 内相互作 用机制的结构生物学及生物化学研究 4 4 3 YF P距 离 更为 接 近 ， 发 生 了 能量 转 移 ， 进 一 步 支 持 上 述 推断 ： 溶 液 状态下 的 NF 2蛋 白在 5 1 8位丝 氨 酸 被 磷 酸化后 ， N 端和 C端 的分子 内相 互作用 更 强 。 综上所述 ， 处于活性状态 的 NF 2蛋 白， 其 N端 和 C端 分 子 内相 互 作 用 强 度 较 弱 ， 蛋 白质 整 体 呈 “ 开放 ” 状 态 ， 而 5 1 8位 丝 氨 酸 被 磷 酸 化 后 ， NF 2蛋 白活 性丧 失 ， 此 时分子 内相互 作用 较强 ， 蛋 白质处 于 “ 闭合 ” 构象 ， 这 与最 新 的研 究结 果 一 致 。今 后 的 研究中 ， 我们拟进行突变体筛选以提高 NF 2蛋白 自 身稳定性 ， 避免其分子内降解 ， 有望从结构生物学的 角度 揭示 N F 2蛋 白 5 1 8位 丝 氨 酸 磷 酸 化 对 其 构 象 调节 进 而调控 肿瘤 生长 的分 子机 制 。 致谢上 海光 源 B L 1 7 U 线 站 工作 人员 在 晶体 数据 采 集过程 中提供 了帮助 。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 参 考 文 献 Ro u l e a u G A ， M e r e l P， Lut c h m a n M ， e t a 1 A I t e r a t i o n i n a ne w ge ne e n c od i n g a p ut a t i v e me mbr a n e o r g a n i z i n g p r o t e i n c a u s e s n e u r o f i b r o ma t o s i s t y p e 2 J Na t u r e ， 1 9 9 3， 3 6 3( 6 4 2 9)： 51 55 2 1 Tr of a t t e r J A， M a e Col l in MM ，Ru t t e r J I ，e t aZ A n o ve l m o e s i n - ，e z r i n - ，r a d i x i n - l i k e g e ne i s a c a n d i d a t e f or t he n e u r o f i b r o ma t o s i s 2 t u mo r s u p p r e s s o r J C e l l ， 1 9 9 3 ， 7 2 ( 5)： 7 91 8 0 0 Bi a nc hi AB，Ha r a T ，Ra m e s h V ， e t a 1 M n t a t i o n s i n t r a n s c r i p t i s o f o r m s o f t h e n e u r of i b r o m a t o s i s 2 g e n e i n mu l t i p l e h u ma n t u mo u r t y p e s J Na t G e n e t ， 1 9 9 4 ， 6 ( 2 ) ： 1 8 5 1 9 2 Da l g l i e s h G L，Fu r g e K ，Gr e e n ma n C e t a1 S ys t e ma t i c s e qu e n c i ng o f r e n a l c a r c i n o ma r e ve a l s i na c t i v a t i o n o f h i s t o n e mo d i f y i n g g e n e s J Na t u r e ， 2 0 1 0， 4 6 3 ( 7 2 7 9 ) ： 3 6 0 3 6 3 La u YK， M u r r a y LB，Hou s hma n di S S， e t a1 Me r l i n i s a p o t e n t i n h i b i t o r o f g l i o ma g r o wt h J C a n c e r Re s 。 2 0 0 8 ， 6 8 ( 1 4)： 5 7 3 35 7 4 2 M o r r o w KA，Da s S，M e t ge BJ ，e t a1 I O S S of t u mo r s u p pr e s s o r M e r l i n i n a d v a nc e d b r e a s t c a nc e r i s du e t o p o s t t r a n s l a t i o n a l r e g u l a t i o n J J Bi o l C h e m ， 2 0 1 1 ， 2 8 6 ( 4 6)： 4 0 3 764 0 38 5 Pa p