重组DNA技术与蛋白质工程.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,第 一 节 重组,DNA,技术,DNA Recombination Technique,一、相关概念,DNA,克隆,工具酶,目的基因,基因载体,二、基本原理及操作步骤,本节主要内容,一、重组,DNA,技术相关概念,克隆,(clone),来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为,克隆化,(cloning),，即,无性繁殖。,（一）,DNA,克隆,DNA,克隆,应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体,DNA,接合成一具有自我复制能力的,DNA,分子,复制子,(replicon),，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一,DNA,分子，也称基因克隆或重组,DNA(recombinant DNA),。,生物技术工程,:,基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。,目的,分离获得某一目的基因或,DNA,获得目的基因的表达产物（蛋白质）,基因工程,(genetic engineering),实现基因克隆所用的方法及相关的工作，又称,重组,DNA,技术。,（二）工具酶,限制性核酸内切酶,DNA,聚合酶,逆转录酶,T4DNA,连接酶,碱性磷酸酶,末端转移酶,Taq,DNA,聚合酶,重组,DNA,技术中常用的工具酶,工 具 酶,功 能,限制性核酸内切酶,识别特异序列，切割,DNA,DNA,连接酶,催化,DNA,中相邻的,5,磷酸基和,3,羟基末端之间形成磷酸二酯键，使,DNA,切口封合或使两个,DNA,分子或片段连接,DNA,聚合酶,合成双链,cDNA,分子或片段连接,缺口平移制作高比活探针,DNA,序列分析,填补,3,末端,Klenow,片段,又名,DNA,聚合酶,I,大片段，具有完整,DNA,聚合酶,I,的,5,3,聚合、,3,5,外切活性，而无,5,3,外切活性。常用于,cDNA,第二链合成，双链,DNA 3,末端标记等,反转录酶,合成,cDNA,替代,DNA,聚合酶,I,进行填补，标记或,DNA,序列分析,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸,5,羟基末端磷酸化，或标记探针,末端转移酶,在,3,羟基末端进行同质多聚物加尾,碱性磷酸酶,切除末端磷酸基,限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease),识别,DNA,的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链,DNA,的一类核酸内切酶。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,作用：,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源,DNA,，保护自身,DNA,。,分类：,、,、,类,（,基因工程技术中常用的是,类,）,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；,第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；,第四个字母代表株；,用罗马数字表示发现的先后次序。,命名：,H,in,d,属,系,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae,d,株,流感嗜血杆菌,d,株的第三种酶,类酶识别序列特点：,回文结构,(palindrome),切口：,平端切口,、,粘端切口,GG,A,T,CC,CC,T,A,GG,Bam,H,GTC,CAG,G,CCTAG,GATCC,G,+,GGATCC,CCTAGG,Hin,d,GTCGAC,CAGCTG,GAC,CTG,+,平端切口,粘端切口,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割,DNA,后，产生相同的粘性末端，称为,同尾酶,。这两个相同的粘性末端称为,配伍未端,(compatible end),。,Bam,H,Bg,l,GGATCC,CCTAGG,AGATCT,TCTAGA,G,CCTAG,GATCC,G,+,+,A,TCTAG,GATCT,A,DNA,聚合酶和,DNA,连接酶,DNA,连接酶催化,5,和,3,端形成磷酸二酯键，底物为带缺口的,DNA,、黏端,DNA,或平端,DNA,。,GGATCT,CCTAGA,G,CCTAG,GATCT,A,+,Bam,H,（三）目的基因,cDNA(complementary DNA),：,为具有与某,RNA,链呈互补的碱基序列的单链,DNA,基因组,DNA(genomic DNA),（四）基因载体,定义,为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些,DNA,分子。,常用载体,质粒,DNA,噬菌体,DNA,病毒,DNA,克隆载体,(cloning vector),为使插入的外源,DNA,序列被扩增而特意设计的载体称为,克隆载体,。,表达载体,(expression vector),为使插入的外源,DNA,序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为,表达载体,。,载体的选择标准,含有复制起始点，能在宿主中独立复制；,分子量小，以容纳较大的外源,DNA,；,不能插入宿主基因组，易于分离和纯化；,具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；,有克隆位点（外源,DNA,插入点），由限制性内切酶的识别序列组成。,1.,质粒,(plasmid),特点,:,能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状（一般带有抗生素的抗性基因）。,细菌染色体外的小型环状双链,DNA,分子。,噬菌体,DNA,改造系统,gt,系列（插入型，适用,cDNA,克隆）,EMBL,系列（置换型，适用基因组克隆）,2.,噬菌体,(phage),：适用于大片段,DNA,的克隆,M13,噬菌体,DNA,改造系统（含,lacZ,基因）,M13mp,系列,pUC,系列,3.,柯斯质粒,(cosmid),pJB8,的物理图谱,酵母人工染色体,(yeast artificial chromosome,YAC),动物病毒,DNA,改造的载体,腺病毒载体,逆转录病毒载体,杆状病毒载体,其他,二、重组,DNA,技术基本原理,目的基因的获取,重组,DNA,导入受体菌,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,以,质,粒,为,载,体,的,DNA,克,隆,过,程,（一）目的基因的获取,1.,化学合成法,已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。,2.,基因组,DNA,文库,(genomic DNA library),3.cDNA,文库,(cDNA library),4.,聚合酶链反应,(polymerase chain reaction,PCR),1.,化学合成法,由已知氨基酸序列推测可能的,DNA,序列,组织或细胞染色体,DNA,基因片段,克隆载体,重组,DNA,分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,存在于转化细菌内由克隆载体所携带的所有基因组,DNA,的集合,2.,基因组,DNA,文库,限制酶切位点,限制酶消化,除去中间片段,cos L,R cos,cos L,左臂,R cos,右臂,真核生物染,色体,DNA,限制酶部分消化,外源,DNA,与载体,DNA,混合,连接反应,体外包装,用重组噬菌体,感染大肠杆菌,20 Kb DNA,片段,cos L,R cos,20 Kb,外源,DNA,片段,基因文库,mRNA,cDNA,双链,cDNA,重组,DNA,分子,cDNA,文库,反转录酶,载体,受体菌,复制,3.,cDNA,文库,逆转录酶,A A A A,T T T T,AAAA,SI,核酸酶,DNA,聚合酶,碱水解,T T T T,DNA,序列是已知的，或两端已知，可以利用选择性体外扩增,DNA,的方法,PCR,。,是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组,DNA,或,cDNA,的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。,4.,聚合酶链反应（,PCR,）,模板,DNA,引物,4,种,dNTP,Taq DNA,聚合酶,含,Mg,2+,的缓冲液。,PCR,的反应体系,（,1,）,变性,，加热至,95,，使模板,DNA,解开成单链；,（,2,）,退火,，温度降至适宜，使引物与模板互补结合；,（,3,）,延伸,，温度升至,72,，,DNA,聚合酶以,4,种,dNTP,为底物，在引物的,3-OH,上，合成与模板互补的,DNA,新链。,PCR,的基本反应步骤及原理,PCR,反应条件,变性,95,C,延伸,72,C,退火,Tm-5,C,Tm,指的是把,DNA,的双螺旋结构降解一半时的温度,PCR,反应的基本原理,（三）外源基因与载体的连接,1.,粘性末端连接,方式：,(1),同一限制酶切位点连接,(2),不同限制酶切位点连接,（二）克隆载体的选择和构建,Bam,H,切割反应,GGATCC,CCTAGG,T4,DNA,连接酶,15,C,GATCC,G,G,CCTAG,+,目的基因用,Bam,H,切割,载体,DNA,用,Bam,H,切割,重组体,载体自连,目的基因自连,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点的连接,Eco,R,切割位点,Bg,l,切割位点,+,Eco,R+,Bg,l,双酶切,Eco,R+,Bg,l,双酶切,T4,DNA,连接酶,15,C,重组体,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,2.,平端连接,适用于：,限制性内切酶切割产生的平端,粘端补齐或切平形成的平端,目的基因,载体,限制性内切酶,限制性内切酶,T4 DNA,连接酶,15,C,重组体,载体自连,目的基因,自连,3.,同聚物加尾连接,在末端转移酶,(terminal transferase),的作用下，在,DNA,片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,5,3,3,5,载体,DNA,5,3,3,5,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,5,3,3,5,5,3 T(T),n,T,T(T),n,T 3,5,5,3,3,5,5,3,A(A),n,A,A(A),n,A,3,5,-,核酸外切酶,-,核酸外切酶,末端转移酶,+,dATP,末端转移酶,+dTTP,T(T),n,T,A(A),n,A,A(A),n,A,T(T),n,T,T4,DNA,连接酶,15,C,重组体,4.,人工接头,(linker),连接,由平端加上带有新的酶切位点的接头，再用限制性酶切产生粘性末端，而进行粘端连接。,Eco,R,Eco,R,Eco,R,人工接头及其应用,CCGAATTCG,GGCTTAAGC,5,-,3-,Eco,R,受体菌条件,安全宿主菌,限制酶和重组酶缺陷,处于感受态,(competent),导入方式,转化,(transformation),转染,(transfection),感染,(infection),（四）重组,DNA,导入受体菌,（五）重组体的筛选,1.,直接选择法,(1),抗药性标记选择,(2),标志补救,(marker rescue),(3),分子杂交法,原位杂交,Southern,印迹,2.,免疫学方法,如免疫化学方法及酶免检测分析等,(,插入失活法,),抗药性标记选择,组氨酸缺陷,型大肠杆菌,无组氨酸,的培养基,酵母咪唑甘油磷,酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,互补的检测,重组,DNA,技术操作过程可形象归纳为,小 结,分,分离目的基因,切,限制酶切目的基因与载体,接,拼接重组体,转,转入受体菌,筛,筛选重组体,重组,DNA,技术操作的主要步骤,载体,质粒,噬菌体,病毒,目的基因（外源基因）,基因组,DNA,cDNA,人工合成,PCR,产物,限制酶消化,开环载体,DNA,目的基因,连接酶,重组体,转化,体外包装，转染,带重组体的宿主,筛选,表型筛选,酶切电泳鉴定,菌落原位杂交,表达体系的建立,表达载体的构建,受体细胞的建立,表达产物的分离纯化,（六）克隆基因的表达,1.,原核表达体系,（,E.coli,表达体系最为常用）,标准：,选择标志强启动子,翻译调控序列多接头克隆位点,E.coli,表达体系的不足,不宜表达真核基因组,DNA,不能加工表达的真核蛋白质,表达的蛋白质常形成不溶性包涵体,(inclusion body),很难表达大量可溶性蛋白,优点：,可表达克隆的,cDNA,及真核基因组,DNA,可适当修饰表达的蛋白质,表达产物分区域积累,缺点：,操作技术难、费时、费钱,转染,将表达载体导入真核细胞的过程,方法：,磷酸钙转染,DEAE,葡聚糖介导转染,电穿孔,脂质体转染,显微注射,2.,真核表达体系,酵母、昆虫、哺乳类动物细胞,表达载体,pFASTBACI,的物理图谱,（一）疾病基因的发现与克隆,根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。,三、重组技术与医学的关系,（二）生,物制药,重组,DNA,医药产品,产 品,功 能,组织胞浆素原激活剂,抗凝,血液因子,VIII,促进凝血,颗粒细胞,-,巨噬细胞集落剌激因子,剌激白细胞生成,促红细胞生成素,剌激白细胞生成,生长因子,(bFGF,EGF),刺激细胞生长与分化,生长素,治疗侏儒症,胰岛素,治疗糖尿病,干扰素,(,1b,2a,2b,),抗病毒感染及某些肿瘤,白细胞介素,激活、剌激各类白细胞,超氧化物歧化酶,抗组织损伤,单克隆抗体,利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗,乙肝疫苗,(CHO,酵母,),预防乙肝,口服重组,B,亚单位菌体霍乱菌苗,预防霍乱,基因诊断,(genetic diagnosis),是,利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在,DNA,水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。,（三）基因诊断,基本过程,区分或鉴定,DNA,的异常,分离、扩增待测的,DNA,片断,标准,.,能正确扩增靶基因；,.,能准确区分单个碱基的差别；,.,本底或噪声低，不干扰,DNA,的鉴定,;,.,便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。,（四）基因治疗,定义,基因治疗,(gene therapy),是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。,方式,体细胞基因治疗,(somatic cell gene therapy),性细胞基因治疗,(germ line gene therapy),1.,产前诊断,2.,携带者测试,3.,症候前诊断,4.,遗传病易感性,（五）遗传疾病的预防,复习思考题：,1.,概念：,（,1,）克隆（,2,）转化,（,3,）转位（,4,）基因工程,（,5,）转座（,6,）限制性核酸内切酶,（,7,）载体（,8,）质粒,2.,简述基因工程的基本过程。,3.,简述目的基因的主要来源或途径。,