植物细胞骨架的光学显微镜观察.doc

几种不同类型显微镜的使用及其对胞质环流的观察一、实验目的 学会使用相差显微镜，掌握暗视野技术，以及荧光显微镜等技术二、实验原理 在活细胞中，原生质流动是细胞活力强弱的重要标志，它的产生与细胞中微丝的作用是密不可分的。微丝的纤维较细，直径为56nm，主要成分是肌动蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白，并像肌肉一样有收缩功能。微管是由一种叫做微管蛋白的蛋白质组成的，位于原生质（静止的）外质，紧靠在质膜之下，离运动的内质至少有1m的距离，与胞质川流运动无关，主要起保持细胞形状、承担细胞运动和细胞内物质运输的作用。 另外，用秋水仙素与细胞松弛素B处理也可产生不同的结果。经秋水仙素处理后，细胞的纤维被扰乱，但不影响川流运动，这是与秋水仙素影响边缘微管作用有关。相反，用细胞松弛素B处理，就可抑制细胞的川流运动，很明显，微丝担负着川流运动的功能。胞质环流需要消耗能量，也受温度、渗透压以及离子浓度的影响。三、实验材料 新鲜洋葱鳞茎，刚毛藻等。四、实验器材 相差显微镜，普通光学显微镜，黑卡纸，载玻璃片，盖玻片，镊子，吸水纸，剪刀，滴管，擦镜纸。五、实验药品 100g/ml秋水仙素溶液，20g/ml细胞松弛素B(cytochalasin B)，蒸馏水，香玻油，二甲苯。六、实验步骤1. 取新鲜洋葱鳞茎内表皮约1cm2 或更小，放在干净的载玻片上，加一小滴水，将盖玻片倾斜盖上，并注意不出现气泡，即制成水封片。2. 取一块黑纸，把它剪成暗视野显微镜用的遮光板，并放入普通光学显微镜的聚光器下的光阑上，制成暗视野显微镜。（须反复调整遮光板的尺寸以得到最佳效果）。3. 把制成的水封片放在暗视野显微镜下用10倍物镜观察，可以看到在明亮的细胞壁与半透明的细胞核之间有很多极小而明亮的“质点”或颗粒，仔细观察，可以看出这些正作有向的运动（速度很慢），水封片中多加些水会促进这种运动。4. 学习相差显微镜，荧光显微镜和倒置显微镜的使用方法和有关操作技术。植物细胞骨架的光学显微镜观察一、实验目的 掌握细胞染色的基本过程及非切片法制片技术，了解细胞骨架的结构，学会制作永久封片。二、实验原理 当用适当浓度的TritonX100处理细胞时，因其非离子型表面活性剂的特性，可以除去可溶性蛋白质和脂类，而微丝束属不可溶性蛋白，就不会被TritonX100破坏而保留在细胞中。当用考马斯亮蓝R250染色时，在光学显微镜下通常能观察到以核为中心的纤维状骨架，在质膜下还能见到丝状骨架，骨架上常附着一些与膜运动、整合有关的蛋白质。 考马斯亮蓝R250并不是特异地显示微丝，但由于有些细胞骨架纤维如微管等在该实验条件下不够稳定，又因有些类型的纤维太细而在光学显微镜下无法分辨，因此看到的是由微丝组成的纤维束，直径约在40nm左右。 三、实验材料 新鲜洋葱鳞状叶。四、实验器材 普通光学显微镜，50ml烧杯，滴管，试剂瓶，载玻片，盖玻片，镊子，染色板，吸水纸，擦镜纸。 五、实验药品 1M缓冲液：所含各成分终浓度为50mmolL眯唑，50mmolLKCL，0.5mmolLMgCl2，lmmolLEGTA(乙二醇双(氨基乙基醚四乙酸)，0.1mmolL EDTA，lmmolL巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT)。lmolL HCl调pH到6.8 2 0.01mol/L磷酸缓冲液(pH 6.8) 用0.2mol/L磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲液稀释配制 其中磷酸盐缓冲液配法：0.2mol/LNa2HPO4 49ml 0.2mol/LNaH2PO4 5lml3. 1TrltonX100，用M缓冲液配制。 40.2考马斯亮蓝R250。配制用的溶剂为：甲醇：冰醋酸:水(46.5：7：46.5)。 5. 3戊二醛溶液，用9.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)配制 6. 50，70，95乙醇。 7. 叔丁醇 8. 正丁醇 9. 二甲苯。 10.中性树胶。六、实验步骤 1. 撕取洋葱鳞状叶内表皮约lcm大小，取若干片，置于装有pH6.8磷酸盐缓冲液的50ml烧杯中，用镊子轻按入使其浸没5min。 2吸去磷酸盐缓冲液，用lTritonX100处理2030min。 3. 吸去TrironXi00液，用M-缓冲液洗3次，每次10min左右。 4. 用3戊二醛固定0.5h。 5. 再用磷酸盐缓冲液洗3次，每次10min。 6. 0.2考马斯亮蓝R250染色2030min（在染色板上）。 7. 用蒸馏水洗12次，将样品置于载玻片上，在普通光学显微镜下观察，先低倍，再高倍，最后用油镜。 8. 如观察结果较佳，可制作永久封片：在有样品的50ml烧杯中，依次用如下试剂处理:50乙醇，70乙醇，95乙醇，(1/2)V 95乙醇+(1/2)V叔丁醇，叔丁醇(以上每个步骤反应510min)或正丁醇，正丁醇，二甲苯，二甲苯(每个步骤510min)。然后，将样品置于载玻片上展开，镜检后滴一滴中性树脂，盖上盖玻片。叶绿体的分离与荧光观察一、 实验目的掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。二、 实验原理用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它 沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组 分沉到离心管底部，这样，可粗略地分离叶绿体。三、 实验材料新鲜菠菜叶四、 实验器材组织捣碎器，高速冷冻离心机，普通离心机，离心管，Corex离心 管，烧杯，漏斗，纱布，载玻片，盖玻片，普通光学显微镜，剪刀，滴管，荧光显微镜。 五、实验药品 匀浆介质(0.25molL蔗糖、0.05molL TrisHCi缓冲液，pH7.4)：称取85.55g蔗糖，6.05gTris，溶解在近800ml蒸馏水中，加入约425ml0.lmolLHCI，最后蒸馏水定容至1000ml。 50蔗糖溶液，15蔗糖溶液。0.35M氯化钠，0.01吖啶橙六、实验步骤(一)叶绿体的密度离心 l. 洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去除叶柄、主脉后，称取5g，剪碎。 2. 加入预冷到近0C的匀浆介质10ml，在研钵内低温捣碎o。 3捣碎液用双层纱布过滤到烧杯中。 4. 滤液移入普通玻璃离心管，在普通离心机上1000rmin离心1min。 5. 在2ml离心管内依次加入50蔗糖溶液和15蔗糖溶液，注意要用滴管吸取15蔗糖液沿离心管壁缓缓注入，不能搅动50蔗糖液面，50蔗糖溶液加0.9ml，15蔗糖溶液加0.5ml。加液完后，可见两种溶液界面处折光稍有不同，这样密度梯度就制好了。 6在制好的密度梯度上小心地沿离心管壁加入0.3ml上清液。 7离心8000rmin，20min。 8. 取出离心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带；用滴管轻轻吸出滴于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察。还可在暗室内用荧光显微镜观察。 (二)菠菜叶手切片观察 用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上，滴加12滴0.35molLNaCl溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察，(1) 在普通光镜下观察 (2)在荧光显微镜下观察 (3)用同样方法制片，但滴加12滴0.01吖啶橙染液染色lmin，洗去余液，加盖片后即可在荧光显微镜下观察。七、实验结果 (一)叶绿体的分离和观察 1. 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。 2. 以Olympus荧光显微镜为例，在选用Bblue激发滤片、B 双向色镜和0-530阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。 3. 加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。 （二）菠菜叶手切片观察 1在普通光镜下可以看到三种细胞 ， (1)表皮细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。 (2)保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。 (3)叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭园形细胞。 叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下带可以看到绿色的基粒。 2在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体侧环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞少。 3用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发 绿色荧光，气孔仍为绿色。细胞组分的分离一、实验目的 掌握分级分离方法。二、实验原理 利用细胞内各组分在一定介质中的沉降速度的差异，可采取分级差速离心的方法，将各组分逐级分离出来。三、实验材料 小鼠(30克)取肝脏四、实验器材 同实验七 外加eppendorf管、微量进样器、tip头、台式高速冷冻离心机。五、实验药品 匀浆介质(0.25mol/L蔗糖OOlmol/LTris-盐酸缓冲液 pH7.4)，乙醇：冰乙酸(3：1)，生理盐水，姬姆萨染液，中性红一 詹纳斯绿染液(称取0.04g中性红、0.02g詹姆斯绿溶于l00ml， 0.25mol/L蔗糖溶液中)。 其中0.01mo/LTris盐酸缓冲液配法：0.lmol/L三羟甲基氨 基甲烷(Tris)10ml， 0.1mol/L盐酸8.4ml加蒸馏水至100ml。六、实验步骤 1.低速离心分离细胞核(1)将饥饿24小时的小白鼠放入容器中麻醉致死，立即剪开腹部，迅 速取出肝组织浸入预冷的生理盐水中洗去血污，用滤纸吸干。， (2)称取0.5g肝组织，放在小烧杯中剪碎，用少量预冷的匀浆介质洗涤数次。 (3)将烧杯内悬浮组织倒入玻璃匀浆器中进行冰浴匀浆。用4层 纱布(先用少量匀浆介质湿润)过滤匀浆液至Corex离心管中，同时制备l张滤液涂片，做好标记，自然干燥。 (4漓心机上500rmin离心5min(4)，将上层溶液吸入2支eppendof管中，盖紧盖子放在有冰块的器皿内，待分离线粒体时用。沉淀物作进一步处理。 (5)用5ml匀浆介质悬浮离心下的沉淀物，用吸管混匀，以1000rmin离心10min(4)，吸去上清液，用吸管吸出少量沉淀物上层涂片。剩余的沉淀物加入0.3-0.5ml匀浆介质，用吸管吹打成悬液，再制备一张涂片做好标记， 自然干燥。 2. 高速离心分离线粒体 (1)将步骤l(4)中的eppendof管在台式高速冷冻离心机上以10000rmin离心5min，缓缓吸出上清液至另2 eppendorf管，留取沉淀物冰浴保存，待涂片鉴定。 (2) 另2支上清液在台式高速冷冻离心机上以13000rmin离心5min。 (3)吸去上清液，沉淀物置冰浴中，待制片鉴定时用。 3分离物的鉴定 (1)细胞核。将步骤l中得到的涂片浸入乙醇一冰醋酸中固定15min，吹干，滴姬姆萨染液(原液用115mol磷酸缓冲液稀释1020倍)染色10min，自来水冲洗，吹干，在高倍镜下比较观察涂片。 (2)线粒体。在2张干净载玻片中央各滴23滴中性红詹纳斯绿染液，取步骤2高速离心得到两份沉淀物分别均匀地涂布在玻片上，染色30min后分别盖上盖玻片，在高倍镜下观察。附：更精致的分离方案 将4.5ml0.34molL蔗糖溶液放入离心管，然后沿壁小心地加入4.5ml鼠肝匀浆使覆盖于上层。用高速冷冻离心机以700g离心10min，得上清液I和沉淀物。沉淀物用10ml 0.25molL蔗糖溶液洗2次，每次1000g离心10min，得到的沉淀物可进行以下处理。(1)收集质膜：吸出沉淀中较疏松的上层，混悬于比重为1.16的蔗糖溶液中，沿管壁小心加入已放在离心管中的比重1.18的蔗糖溶液的上层，经700g离心10min，质膜最终集中在两溶液界面上，吸出质膜层。（2）细胞核纯化：将沉淀用5倍体积的0.34molL蔗糖0.5molLMg(Ac)2溶液混悬，铺在4倍于核悬液体积的0.88m01L蔗糖0.5molLMg(Ac)2溶液之上，1500g离心20min，沉淀物即为纯化的细胞核。（3）分离核仁：纯化的细胞核混悬在2倍体积的0.34molL蔗糖0.5molLMg(Ac)2溶液中，超声波破核膜，释放出核仁，注意蔗糖介质pH中性或弱碱性时核膜才易破碎，超声后的悬液铺于4倍体积的0.88molL蔗糖0.5moILMg(Ac)2溶液之上，1700g离心17min。沉淀物即为核仁，溶液为上清液I。 将上清液I 10000g离心lOmin得上清液和沉淀物，沉淀物以lOml预冷的0.25molL蔗糖溶液洗2次，每次10000g离心10min，得沉淀物即为纯化的线粒体。 上清液经16 300g离心20min得上清液和沉淀物，沉淀物以lOml预冷的0.25m01L蔗糖溶液洗；16300g离心20min，得沉淀物即为纯化的溶酶体。 上清液经100 000Xg离30min，得沉淀物(为微粒体)和上清液，后者再经离心150000g 3h左右可获得核糖体、病毒、生物大分子等。四膜虫纤毛的再生一、背景和原理纤毛和鞭毛是细胞表面的特化结构，具有运动功能。纤毛和鞭毛的结构基本相同。纤毛轴心含有一束“92”排列的平行微管，中央微管均为完全微管，外围二联体微管由A，B亚纤维组成，A亚纤维为完全微管，由13个球形亚基环绕而成，B亚纤维仅由10个亚基构成，另3个亚基与A亚纤维共用(图9-16)。微管是由微管蛋白组成的管状结构，对低温、高压和秋水仙素敏感。大多数微管纤维处于动态的组装和去组装状态，这是实现其功能所必需的过程。本实验以Rosenbaum和Carlson（1969）的实验为基础，在降低pH和钙离子存在的条件下通过机械修剪的方法，在膜水平脱去四膜虫的纤毛，剩下肿胀的，不能运动的细胞。在不同的生长温度（25和17）下观察纤毛的再生率，并且在不同的抑制物的作用下研究微管亚单位的合成和组装。二、实验目的1使用相差显微镜和血球计数器；2了解微管组装的基本原理三、教学安排学时数：34小时。四、实验仪器、器材与试剂1材料：梨形四膜虫。2仪器：锥形瓶，相差显微镜，血细胞计数器，台式离心机，滴管，注射器，parafilm膜，载玻片，盖玻片，定时器。3试剂：蛋白胨，亚胺环己酮，新霉素，秋水仙碱，EDTA，醋酸钠，氯化钙。五、实验方法与步骤1、 分别将250毫升含1%蛋白胨四膜虫培养物置于500毫升锥形瓶中于25和17培养。（时间）2、 两瓶培养物分别800g离心10分钟，重新悬浮于15毫升1%蛋白胨溶液，置于50毫升锥形瓶，做好标记。3、 准备2个50毫升锥形瓶，各加入15毫升1%蛋白胨溶液；3个100毫升锥形瓶，含20毫升1%蛋白胨溶液，分别加入10微克/升亚胺环己酮；50微克/升亚新霉素；加入2毫克/升秋水仙碱。4、 以下操作在冰浴上进行：1） 在零时间，用一个大试管在冰浴上将2.5毫升浓缩的四膜虫悬液（生长于25）加至5毫升介质A（10mMEDTA2Na; 50mM醋酸钠；pH6.0）中，搅拌混匀。2） 30秒后加入2.5毫升预冷的蒸馏水。3） 1分钟后加入0.25毫升预冷的0.2McaCl2, parafilm膜封口，倒转试管使之混合。4） 2分钟后用装有19号针头的注射器吸取悬液并注入预冷的试管中（修剪掉四膜虫的纤毛）。迅速用滴灌取少量悬液，滴加在载玻片上镜检，观察其是否失去运动性。5） 去纤毛后，立即把1毫升去纤毛的细胞加至20毫升1%蛋白胨溶液，25预热的100毫升锥形瓶中，于25培养并开始实验。5、 每隔10分钟取出定量的样品，对其随时间变化的能动性（motility）%进行分析。由于脱纤毛的细胞不能运动，切记在取样前振荡锥形瓶。在血细胞计数器上观察，估计运动细胞和非运动细胞的数目。制备快速标本，在相差显微镜下观察细胞是否肿胀，有无新生纤毛等情况。6、 同时对生长于17的四膜虫进行脱纤毛，并同在25的四膜虫的纤毛再生时间比较。7、 从生长于25的四膜虫悬液制备新鲜脱纤毛的细胞，在分别加入亚胺环己酮，新霉素，秋水仙碱和空白对照的含20毫升的1%蛋白胨溶液100毫升锥形瓶中各加入1毫升脱纤毛细胞。每隔10分钟分别从瓶中取样，观察其反应是否发生改变。 8、 从生长于17的四膜虫悬液制备新鲜脱纤毛的细胞，在分别加入亚胺环己酮，新霉素，秋水仙碱和空白对照的含20毫升的1%蛋白胨溶液100毫升锥形瓶中各加入1毫升脱纤毛细胞。每隔10分钟分别从瓶中取样，观察其反应是否发生改变。 9、 从生长于25的浓缩四膜虫悬液制备一些新鲜的脱纤毛细胞。对下列各个瓶中分别加入1ml脱纤毛细胞： （i）蛋白胨10g/ml亚胺环己酮（ii）蛋白胨50g/ml新霉素（iii）蛋白胨2mg/ml秋水仙碱（iv）只含蛋白胨作为对照每隔10分钟从瓶中取样。让实验进行尽可能长的时间，以便观察其反应是否发生改变。记录结果实验结果以能动性（）对时间（min）作图表示：（1）生长于25和17的四膜虫；（2）抑制物对纤毛再生的效应。讨论作为这一实验的引伸，还可以应用更多的抑制物来表明，是否需要生成新的信息性分子，细胞周期中的不同时相是否起重要作用？对抑制物的观察可以时可逆的，因为经过一个时间阶段后，细胞可以克服由于秋水仙碱引起的组装阻断。这些实验着眼于纤毛的再生系统，在这些系统中很容易辨认出重点。这些实验还为诸如纤毛和鞭毛等微管结构的合成和组装提供资料。六、实验提示与注意事项1.梨形四膜虫的纯培养可培养于1蛋白胨（1蛋白胨；0.25酵母浸膏），培养液用15磅/时2高压灭菌15分钟。在接种培养物和整个培养过程中需用无菌技术，但在课堂实验时无需应用无菌采样技术。为了获得实验所需数量的培养物，含250ml蛋白胨的500ml锥形瓶在25可培养12天，而在17需23天。这一体积的培养物可用来接种25瓶新的250ml培养物。2生长的温度很重要；如果四膜虫没有在25生长至少6天的话，则再生速率显著延缓。因此，对两种不同生长温度的比较，形成了本实验中一部分的基础。 3.四膜虫的离心必须小心，因为在减速时细胞容易被漩涡卷起。如果参加实验的学生较多，或没有经验，最好在实验时由一位技术员来离心细胞。通常800g即可，但也可用1000g。七、思考题纤毛再生所需的时间，是包括微管蛋白的合成和组装在内的许多过程决定的。培养物原先生长的温度为什么能影响纤毛再生率？通过抑制物的实验结果，我们能否确定在实验过程中，纤毛再生取决于现存前体库的大小和新蛋白质合成的程度？在较低级的真核细胞中我们能学到什么有关蛋白质合成的知识？八、推荐阅读Rosenbaum,J.L.and Carlson,K. 1968 Cilia Regeneration in Tetrahymena and its Inhibition by Colchicine ,J.cell Biol.,40,415Rosenbaum,J.L.and Child,F.M 1967Flagellar Regeneration in Protozoan Flagellates ,J.Cell Biol.,34,345Rosenbaum,J.L., Moulder, J.E. and Ringo,D.L. 1969 Flagellar Elongation and Shortening in Chlamydomonas,J.Cell Biol,41,600植物愈伤组织诱发培养一、实验目的 掌握无菌操作进行愈伤组织诱发培养的方法。二、实验原理 植物组织培养和细胞培养是进行植物细胞工程的基础工作。一般认为，分化了的植物根、茎、叶细胞具有全能性，在一定条件下进行离体培养，给予合适的营养条件和激素水平，可以脱分化为愈伤组织。利用愈伤组织可以进行一些生物化学、发育学、遗传学等方面的研究工作，例如愈伤组织能进一步诱导分化成完整的植株，还可以将愈伤组织进行单细胞分离，做悬浮培养，筛选各种生化突变型。三、实验材料 烟草或迎春花茎段 四、实验器材 培养皿，烧杯，镊子，剪刀，小三角烧瓶，大三角烧瓶，酒精灯，酒精棉花，滴管，试剂瓶，滤纸，锡箔纸，超净工作台，植物细胞培养室。五：实验药品 MS固体培养基(见附录，加08%琼脂)：培养基中加生长素2.4D，为脱分化培养基，培养基中加细胞分裂素6一BA和生长素NAA，为分化培养基，和其它成分相同。 70乙醇，漂白粉溶液(1片漂白粉片加300ml水)，无菌水。六：实验步骤 1培养基的配制：MS固体培养基灭菌后稍冷，倒入无菌 培养皿分装，或者直接配在三角瓶中，瓶口用二层牛皮 纸盖上用绳扎紧，灭菌后待用。 2迎春花枝条，去叶，用水洗茎。洗干净后剪取5cm长的 枝条3段，投入70%乙醇中浸泡30秒。再转入漂白粉 溶液，消毒lmin。 3移入超净台，按无菌操作要求将茎段取出置于无菌培养 皿内，用无菌水反复冲洗。再用无菌镊子移入另一培养 皿内，再用无菌水反复冲洗。 4将茎段剪小，每段约lcm长，放入脱分化培养基，每皿 67段，均匀分散在培养皿中，26暗培养34天，观 察有无染菌。 5挑取无污染茎段，转接入新的脱分化培养基，继续暗培 养7天，可观察到愈伤组织开始生长。 6如果以无菌烟草为材料，可跳过2、3两步，省去消毒、 漂洗过程。直接进入第5步。取烟草叶片进培养。 培养7天检查有无染菌，如有污染再转接一次，继续 暗培养7天，在这阶段可以看到叶片细胞脱分化产生愈 伤组织。 7将烟草愈伤组织转接到细胞分化培养基，照光培养2 3周，可以观察到细胞分化产生新的苗。鼠肾细胞原代培养 一、实验目的 了解细胞原代培养的原理和方法，学习细胞消化、细胞计 数、营养液的配制等操作技术，观察原代细胞的形态。 二、实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的器官组织，经消化，培养成为单个细胞的过程。用胰蛋白酶对组织进行消化获得单细胞悬液，由细胞悬液定量接种后获得原代细胞培养物。胰蛋白酶的作用是消化除去细胞间质，蛋白酶液中可添加胶原酶以增加消化能力。 细胞培养是探索细胞生命活动规律一种基本的、十分有效的实验技术，通过细胞培养可以进行细胞的结构，细胞的生长发育等等各项研究，目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。 三、实验材料 出生后一周左右的乳鼠。四、实验器材 细胞培养箱，离心机，超净工作台。细胞培养皿，滴管，血球计数板，吸液器，眼科剪刀，镊子，小离心管。五、实验药品 RPMl640培养液，小牛血清，青霉素，链霉素，025胰蛋白酶和01胶原酶，75乙醇，碘酒，乙醚，PBS，EDTA。六，实验步骤：1. 按无菌操作技术，消毒超净工作台及双手。2. 用乙醚麻醉法处死小鼠：将乙醚棉球放进烧杯中，然后放入小鼠， 盖住杯口片刻等小鼠死亡。3. 碘酒消毒腹部皮肤。4. 75酒精脱碘2次，然后进入超净工作台操作。5. 用酒精消毒双手及台面。6. 用第一副眼科镊及眼科剪“工”字型剪开皮肤。7. 用第二副眼科剪，剪开拉开腹膜。8推开肠管，在腹后壁找到肾脏，并剪取全肾。将剪刀放入75 酒精中浸泡，待用。9. 置肾脏于灭菌的盛有PBS灭菌液的培养皿。（直径60mm）中洗 两次。夹取肾组织，移至灭菌1.5ml离心管内，将剪刀在无菌PBS 中洗一下，剪碎肾组织，越碎效果越好。10. 加入025胰蛋白酶+1胶原酶lml，混合均匀。11. 37作用15分钟，每五分钟轻轻弹击。12. 无菌滴管轻轻吹打已消化组织20次，注意避免液体外溢。13. 1000RPM，离心1分钟，沉淀未消化的组织块和残渣。14. 吸取含有离散细胞的上清液至另一个管内。15. 3000RPM离心2分钟，收集离散细胞。16弃去上清液，加入完全培养液lml，吹打均匀。17吸取l0l，加入细胞计数板中，进行细胞计数。要求数四个角 的16个小格中细胞数的总和。然后按照以下公式计算细胞密 度。总计数结果 *1000*稀释倍数=细胞个数/mL4 18. 按105细胞/ml，吸取lml细胞加lml培养液，接种到35mm 细胞培养皿中。19. 轻轻混匀细胞，置培养皿于37，5的C02培养箱中，第二天 观察，换培养液，继续培养，第四天观察结果。哺乳动物贴壁细胞的传代培养一、实验目的 了解哺乳类动物离体贴壁细胞的培养条件；掌握贴壁培养细胞的传代技术；观察传代细胞贴壁、生长和繁殖过程中细胞形态变化和形成单层；掌握细胞培养中一些常用培养基、缓冲液、消化液、抗生素、完全培养液的配制方法及各种无菌消毒方法；掌握细胞计数方法。二、实验原理 要使细胞能在离体条件下存活并代代相传，必须在体外人工模拟个类似于体内的环境。所要求的这个环境呈液态，它包含有细胞赖以生存的基本培养基、一定的渗透压和氢离子浓度(即pH)，要有足够的空间，能在恒温恒压和无菌的条件下以满足细胞群体增殖和代谢的需要。离体贴壁培养细胞当群体增殖汇合形成单层细胞群体达到饱和密度时，必须进行传代。传代过程是通过胰蛋白酶消化将细胞从培养瓶（皿）上脱落并分散成单细胞，经过稀释(或不经稀释)从一个容器上转 移到另一个容器并给予新鲜培养液进行再培养。这种传代过程称为传代培养。三、实验材料 贴壁培养细胞株（系）、CH0、Hela、L929、或其他细胞1-2瓶。四、实验器材 设备：细胞培养箱，电热恒温干燥箱，高压消毒锅，水浴锅，离心机，冰箱，无菌室或超净工作台。器具：培养瓶(皿)36只，离心管2只，试管2只，滴管，5ml、10ml，移液管各若干支，血球计数板1块，污物缸，橡皮塞，吸液器，pH试纸，消毒药棉等高压或高温灭菌备用。 五、实验药品 RPMl1640培养基，5NaHCO3，小牛血清，青霉素，链霉素，谷氨酰胺，0.25胰蛋白酶液，0.1EDTA-Na2液，75乙醇，HCl，台酚蓝染色液，NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2P04。六、实验步骤 l. 洗净双手，入无菌室缓冲间穿戴工作服、鞋、帽、口罩后进入无菌室。 2点燃煤气(或酒精)灯，用75乙醇棉球抹拭双手、操作台表面、各种试剂瓶口。 3. 配制有关溶液 （1）RPMll640培养液： 1640粉剂一袋(10.4g)1升millce水谷氨酰胺0.3g+NaHCO32g，混匀后逐滴加入0.5ml浓HCI到pH6.8，过滤灭菌，分装，-20保存。临用时加10小牛血清和两种抗菌素溶液；最终浓度分别为100单位毫升。 （2）小牛血清灭活：小牛血清溶解后放置56，30min，然后分装小瓶，-20保存。 （3）两种抗菌素(双抗)溶液：取青霉素80万单位和链霉素80万单位，溶于80ml无菌水中，配成每毫升1万单位溶液，4保存。 （4） PBS溶液：NaCl 4g， KCl 0.lg，Na2HPO4(无水)0.57g或(12H2O)1.43g，KH2PO4 0.lg,双蒸水500mlpH7.2，10磅20分钟灭菌，4保存。 （5）0.1EDTA：l00mg EDTA100ml PBS （6）胰蛋白酶溶液：50mg胰蛋白酶l00mlPBS （7）胰酶消化液：溶液(5)+(6)，得到200ml溶液过滤灭 菌。 （8）细胞培养液：45ml 1640培养液5ml小牛血清+0.5m1双 抗。4 消化细胞 取接种35天形成单层的细胞株，使细胞面朝上，将培养液用吸管吸去，用12滴管PBS洗12次，加入2滴管消化液。消化12min，待细胞单层上出现透明针尖小孔隙时（此时镜检可见成片层的细胞固缩成圆形，细胞与细胞之间相互接触松散或互不接触)，使细胞面朝上，轻轻吸去消化液，丢入废物缸，然后加入2滴管完 全培养液，吸打细胞使其成细胞悬液。如果消化过头而细胞已自行脱落时，可加少量血清或完全培养液 以中止消化。滴管吸打均匀使成细胞悬液并转移至离心管离心(1000r ，35min后用完全培养液再悬浮。 5. 细胞接种 取小型细胞培养瓶1只，然后加入5ml左右培养液，再将上述细胞悬液等量（1：3或1：4）或不等量（根据实验需要）接种入内，打匀、平置、编号，37培养，隔天观察结果。6. 细胞计数 胰酶彻底消化细胞，用4.5ml细胞培养液悬浮细胞后转移到试管中，加0.5ml台酚蓝染色液，滴管吸打细胞悬液使均匀，吸取细胞悬液（要充满滴管，不能有气泡）沿细胞计数板血盖片边沿轻轻滴入计数板（不能有气泡、空隙，也不能使其外溢以免定量有误），在光学显微镜(10Xl0)下计数按图中四角大方格内细胞总数，按公式计算如下 4大格细胞总数*104 4求出每ml平均细胞数，乘以稀释倍数为该瓶细胞总数。 附录二 细胞培养用液 - 1. 平衡盐液 （1）Hank液原液：取NaCl 80.0g，Na2HPO42H2O 0.6g，KCl 4.0g，KH2PO4 0.6g，MgSO47H2O 2.0g，葡萄糖10.0g，无水CaCl2 1.4g， 加水至1000ml。配制：取Hank原液100ml，加蒸馏水896ml，加0.5酚红4ml，混 匀。分装，包扎，0.0552MPa(8psi)/30min或-.0689MPa临用前，加NaHCO3液调pH至7.2。（2）D-Hank液NaCl 8.0g，KCl 0.4g，Na2HPO412H2O 0.12g，KH2PO4 0.06g，葡萄糖 1.0g，酚红（1）2ml，加三蒸水至1000ml。0.0689MPa（10psi）/10min灭菌，冷却后置4冰箱保存。（3）Earle液原液A：取NaCl 68.Og，KCl 4.0g，NaH2PO4H2O 1.4g，葡萄糖 10.0g，加水至500ml。原液B:取CaCl2 2.0g，MgSO47H2O 2.0g，0.5%酚红4.0ml，加 水至500ml。配制：取原液A、B各1份，加18份水混匀。分装，包扎，0.0552 MPa（8psi）/30min或0.0689MPa(10psi)/15min灭菌，置 4冰箱备用。临用前调pH。2. 培养液（1） M199粉末9.9g加水至1000ml。过滤灭菌。（2） Eagles MEM：取E-MEM9.9g，水加至1000ml，分装，0.1034MPa（15psi）/15min灭菌。使用前每100ml E-MEM液中加入1ml3谷氨酰胺。（3） RPMI1640：取RPMI1640干粉10.5g，加水至1000ml，CO2气体调至pH7.2，过滤灭菌。（4） DMEM：取DMEM干粉9.96g，水加至1000ml，CO2气体调至pH7.2，过滤除菌。培养细胞的染色体显示 一实验目的 以传代培养的细胞为材料，学习和掌握细胞染色体显示的基 本原理和方法 二. 实验原理 显示染色体主要是显示分裂中期细胞，因为细胞处于分裂中 期时，染色体的长短和大小恰到好处，是研究染色体的最好阶段 哺乳动物细胞内有几十条染色体，相互交错缠绕，密集在细胞中， 必须把它们分散开，才便于观察采用加入秋水仙素，使分裂细胞 阻断在有丝分裂中期，再经离心，低渗处理，固定，滴片等步骤，可以 制备出较好的细胞染色体标本。 培养细胞有来源易得，细胞分裂率高和制出标本清晰度高等 优点，是制备染色体极好的材料。 三实验材料 传代培养的L929细胞株。 四. 实验器材 细胞培养瓶，载玻片(预冷保存)，盖玻片，10mi离心管，玻璃滴 管，37水浴锅，低速离心机，镊子，培养皿，牙签 五. 实验药品 1PBS溶液 2DMEM或1640培养液(含10小牛血清) 3. 秋水仙素：10g/ml