单个核细胞分离-冻存及复苏.doc

1、 外周血单个核细胞Ficoll分离：
向Ficoll分层液离心管中加入稀释的血液样本，1500rpm，5min离心机离心；
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用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出该层的单个核细胞，盛入另一支离心管中，将所得的单个核细胞悬液用5倍体积的Hanks液或RPMI-1640洗涤2次，1500rpm，5min；
用细胞计数仪或血球计数板计数细胞，调整细胞至所需浓度；

淋巴细胞浓度浓度（细胞数/mL）=四个大方格内细胞数/4×104
2、 细胞冻存：
（1）配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液； 
（2） 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、； 
（3）离心1000rpm，5min； 
（4）去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml； 
（5） 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml； 
（6）在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-80℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。 
3、细胞复苏： 
（1）从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 
（2）从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀； 
（3）离心， 1000rpm，5min； 
（4）弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养； 
（5）次日更换一次培养液，继续培养。
4、注意事项：
（1）从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液； 
（2）将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤； 
（3）冻存和复苏最好用新配制的培养液。
（4）细胞分层液应避光4℃下保存，取出后逐渐升至室温后混匀，方可使用，避免细菌污染。
（5）稀释血液可降低红细胞的凝集，提高淋巴细胞售货量，但是如果要保留血浆成分作为其他实验用时，则不能稀释血液，以免影响血浆成分。
5、所需材料：
（1）仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、倒置相差显微镜、 培养箱、液氮冰箱 
（2）玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、废液缸 
（3）塑料器皿： 吸头、枪头、胶塞、 移液管（10ml）、15ml离心管、
冻存管（1～2ml） 
其他物品：微量加样枪、 红血球计数板、记号笔 、医用橡皮膏、移液枪 
（5）试剂:D-Hanks液、小牛血清、培养液、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.08%） 
、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油