实验五 叶绿体的分离.doc

山东大学实验报告 2013年3月12 日
姓名 李某某 系年级 同组者
科目 细胞生物学实验 题目 叶绿体的分离、纯化与荧光观察 学号 201100140000

【实验目的】
1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法；
2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
【实验原理】
1.叶绿体分离原理
匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。
差速离心：颗粒在离心场中的沉降速度取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的密度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速度不同，先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液中（0.35mol/L的氯化钠或0.4mol/L的蔗
糖溶液）进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
分离过程最好在0~5℃的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。
2、差速离心
特点：1.介质密度均一；
2.速度由低到高，逐级离心。
用途：分离大小相差悬殊的细胞核、细胞器。
沉降顺序：细胞核—线粒体—溶酶体与过氧化物酶体—内质网与高尔基体—核蛋白体。
可将细胞器逐步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。

3、密度梯度离心
密度梯度离心是用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中，这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种，速度沉降主要用来分离密度相近而大小不同的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体。
叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的，由于具有这一重要功能，所以它一直是植物生物学、细胞生物学和分子生物学的重要研究对象，叶绿体是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集，然后用密度梯度离心纯化，便可用于各种研究。
4、吖啶橙
（1）探针特性
AO是三环杂芳香类荧光探针，既可以标记DNA，又可以标记RNA，用蓝光激发后能够发出绿、红两种荧光。
AO与核酸的结合分为强结合方式和弱结合方式两种：一种是嵌入核酸双链的碱基对之间，另一种是与单链核酸的磷酸发生静电间相互作用。
强结合方式：又称插入性方式，AO分子插入在双链核酸的碱基对之间，它们的结合能量为6—10kcal/mol探针，插入后的探针分子与核酸结合更加稳定，每插入一个AO分子，双链结构即发生26度旋转，这样在一个位点上就限制了AO分子与DNA的结合，其荧光发射峰为530nm，呈绿色荧光。
弱结合方式：即静电吸引结合方式，带正电荷的AO分子与带负电荷的磷酸根结合，每个磷酸根的位点上均可结合一个AO分子，最大结合率为1:1，这种结合方式主要是AO分子与RNA分子的结合，其发射波长为640nm，呈红色荧光。
AO与核酸的结合方式在低浓度下最佳，此时插入性结合方式占优势。
（2）AO的主要应用：
1.对细胞内单链或双链DNA/RNA定性和定量。
2.分析核酸内部结构及含核酸的细胞成分构象。
3.观察DNA凝胶电泳情况。
4．作为细胞内PH梯度显示剂，用来检测离子交换，钙离子通道的质子梯度变化等。
5、荧光的概念
光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态到基态时，可以电磁辐射的方式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。紫外辐射、可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光。
荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并且立即退激发在极端的时间内能发射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光称为荧光，一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。荧光分为自发荧光或诱发荧光（次生荧光、续发荧光、间接荧光）。某些物质受激发光照射后可直接发出荧光，如叶绿素、血红素的火红色荧光或木质素的黄色荧光等，称为自发荧光。某些物质本身不发荧光，但它经荧光染料染色后，再通过紫外线照射同样也能发出荧光，这种荧光称为诱发荧光，如叶绿体被吖啶橙染色后可发橘红色荧光。
6、荧光的性质
1.吸收光，必须有激发光源。
2.荧光波长>激发波长（损失热能）。
3.荧光强度极小于激发光的强度。
4.有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光、淬灭剂等，先拍照后观察）。
5.荧光强度取决于激发光强度、被捡物浓度、荧光效率（在制作荧光纤维标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油）。
7、荧光显微镜的操作及注意事项
（1） 接通电源，打开启动装置开关；
（2） 按starter按钮3~5秒以启动激发光源，注意：按starter按钮不能超过5秒，启动2~3分钟后方可稳定，启动15分钟内不得关闭电源，一旦关闭汞灯，3分钟内不得重新启动，用完后关闭main switch；
（3） 光路对中（换灯泡时进行）；
（4） 选择相对应的激发滤片、阻断滤片和双色滤片；
（5） 放置样品，先在普通光镜下选好要观察的视野；
（6） 关闭普通光源后扯开UV挡板，即可观察到样品的荧光情况；
（7） 需照相时，要及时拍照，否则可能拍不到荧光照片；
（8） 观察结束后，关闭main switch，切断电源。
8、荧光显微镜的工作原理
荧光显微镜(Fluorescence microscope) ： 荧光显微镜是以紫外线为光源， 用以照射被检物体， 使之发出荧光， 然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间．有必要时立即拍照。 另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：
1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上；
2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；
3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人眼。
荧光显微镜也是光学显微镜的一种，主要的区别是二者的激发波长不同。由此决定了荧光显微镜与普通光学显微镜结构和使用方法上的不同。　　荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。
【实验材料】
1. 材料
新鲜菠菜
2. 试剂
0.35 mol／L氯化钠溶液， 0.01％吖啶橙(acridine orange)
3. 器材
普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜、光学显微镜、烧杯、量筒、滴管、离心管、纱布若干、无荧光载片和盖片。
【实验步骤】
1． 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后，去除叶梗及粗脉并剪碎，称30g放于150ml 0.35 mol／L NaCI溶液中。
2． 将叶、液同装入组织捣碎机中，匀浆3—5分钟，转速5 000 r／min。
3． 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。
4． 取滤液4ml在1000 r／min下离心2 min,弃去沉淀。
5． 取上清液在3000 r／min下离心5min（沉淀即为叶绿体和细胞核混合物）。
6． 将沉淀用2—3mL0.35 mol／L NaCl溶液悬浮。
7． 取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察： ①在普通光镜下观察；②在荧光显微镜下观察； ③取叶绿体悬液半滴滴在无荧光载片上，再滴加半滴0．01％吖啶橙荧光染料，用盖玻片一端搅动液体，混匀，加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下观察。
【实验结果】
在普通光学显微镜下，叶绿体呈绿色，形状为橄榄形（图1），高倍镜下可看到基粒（深绿色小颗粒）。
在荧光显微镜下，叶绿体自发荧光为“火红色”，背景为黑色如图2所示。加入吖啶橙染液后，叶绿体可以发出“橘红色”次生荧光，细胞核则发出绿色荧光。

叶绿体

图1. 普通光学显微镜下的叶绿体（10×10）

荧光叶绿体

图2. 荧光显微镜下的叶绿体

【实验结果分析】

本次实验主要进行的是叶绿体的分离纯化，以及在荧光显微镜下的观察，首先在显微镜下观察叶绿体悬液，叶绿体呈浅绿色的椭球形，周围还有一些其他物质，可能是核碎片等杂质。在荧光显微镜下，叶绿体显示为火红色，别经有点淡绿色，这是载玻片的杂质发荧光的原因。再用吖啶橙染色，叶绿体显示为橘红色，其中会有绿颗粒，这是核碎片激发出的荧光。
实验时应注意以下几点。
1. 要得到完整的有活性的叶绿体，需要在低温下迅速提取，涂片后立即观察，注意离心时的时间及强度。
2. 利用荧光显微镜可对发荧光的物质进行观察时，会受到很对因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在进行荧光观察时应抓紧时间，必要时应立即拍照。
3. 在制作荧光显微镜标本时最好使用无荧光载玻片，无荧光盖玻片香柏油。