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砷砷-谷胱甘肽谷胱甘肽复合物的降解及含砷化合物对复合物的降解及含砷化合物对谷胱甘肽谷胱甘肽清除自由基的影响清除自由基的影响 Study on the Degradation of Arsenic-glutathione and the Influence of Arsenicals for Free Radical Scavenging by Glutathione 学科专业：化学工程 研 究 生：赵 凤 指导教师：那 平 研究员 企业导师：李良龙 高级工程师 天津大学化工学院 二零一二年六月 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 天津大学天津大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 天津大学天津大学 有关保留、使用学位论文的规定。特授权 天津大学天津大学 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年 月 日 签字日期：年 月 日 I 摘摘 要要 无机砷化合物如亚砷酸盐（AsIII）和砷酸盐（AsV）是常见的人类致癌物，近年来有研究指出砷-谷胱甘肽复合物（As(GS)3）在水溶液中是不稳定的。本论文首先利用高效液相色谱-电喷雾质谱（HPLC-ESI-MS），以乙腈（0.1%甲酸，v/v）和水（0.1%甲酸，v/v）作为流动相，研究了 As(GS)3复合物在水溶液中的降解过程，在此过程中发现了两种新的化合物。根据二级（及三级）质谱信息可推测出其结构，一种化合物是谷胱甘肽（GSH）的同分异构体，是由 GSH 结构中谷酰基上的-羧基替代了-羧基与氨基缩合而形成的；另一种化合物是由氧化型谷胱甘肽（GSSG）脱落谷酰基得到的。在相同实验条件下，利用 HPLC-ESI-MS研究纯物质 GSH 在溶液中反应 24h 后的情况，未发现 m/z=484.5 的分子离子峰，在物质 GSSG 对应的质谱图中也未发现与其保留时间相同 GSH 的同分异构体。因此，两种新化合物的产生与 GSH 的不稳定性没有关系，而是由于 As 与 GSH相互作用所导致。两种新化合物的形成将对生物体的遗传和代谢过程造成影响。GSH 还是生物体内重要的自由基清除剂，利用紫外-可见分光光度计以及HPLC-ESI-MS，研究了 GSH 对 DPPH 自由基的清除作用，以及含砷化合物（亚砷酸钠As，砷酸钠As，一甲基砷酸钠MMA）对 GSH 清除 DPPH 自由基的影响。紫外-可见分光光度计测定结果表明，GSH 具有明显清除自由基的能力。测定一系列不同浓度及不同配比的 GSH/As、GSH/MMA、GSH/As混合溶液对DPPH 自由基的清除作用，得到其回归方程，计算不同配比的 GSH/As、GSH/MMA、GSH/As溶液对 DPPH 自由基的半数清除率 IC50，根据 IC50值可以得出，适量的 As，As，MMA可以提高 GSH 清除 DPPH 自由基的能力，加入砷化合物后各混合溶液对 DPPH 自由基清除能力强弱顺序为：GSH/AsGSH/MMAGSH/As。利用 HPLC-ESI-MS 分别测定含有 As，As，MMA的 GSH 和 DPPH 混合溶液的液质谱图，进一步分析 As，As，MMA对 GSH 清除自由基的影响。HPLC-ESI-MS 扫描结果表明，在溶液中砷化合物与 GSH 发生反应，生成了GSSG，而 GSSG 对 GSH 清除 DPPH 自由基具有协同作用，因此适量的砷化合物能提高 GSH 清除 DPPH 自由基的能力。研究砷化合物对谷胱甘肽清除自由基的影响将有助于为砷化合物的体内代谢及毒性机理研究提供帮助。关键词：关键词：谷胱甘肽，砷-谷胱甘肽复合物，自由基，砷化合物 II ABSTRACT Inorganic arsenicals,including arsenite(AsIII)and arsenate(AsV)are well-known human carcinogens.Recently,research studies have indicated that arsenic triglutathione(As(GS)3)is unstable in an aqueous solution.The present study was designed to evaluate the degradation process of As(GS)3 in an aqueous solution using high-performance liquid chromatography-electrospray ionisation mass spectrometry(HPLC-ESI-MS).Using acetonitrile(0.1%formic acid,v/v)and an aqueous solution(0.1%formic acid,v/v)as the mobile phase.Two new substances were discovered in this study.Based on the fragments obtained from MS2 and MS3 spectrum,we predicted the structures of these.One of the newly discovered compounds was an isomer of glutathione,it was from the condensation of-carboxyl and amino.And the other was obtained after cleavage of the glutamyl from oxidised glutathione.We performed a contrast experiment under the same conditions as the previous experiment.After 24 hours,the compounds were not observed on the chromatogram Therefore,the two new peaks have no relationship to the instability of glutathione,they were caused by the interaction of As and glutathione.The formation of the two new compounds will influence the genetic and metabolic process of the organism.GSH is an important free radical scavenger in organism.Study on the scavenging effects of GSH to DPPH free radical and the influence of arsenicals(As,As,MMA)in the scavenging processes using UV-Vis spectrophotometer and HPLC-ESI-MS.GSH had the obvious ability of scavenging the free radical by UV-Vis spectrophotometer.Through determination of the scavenging effects of GSH/As、GSH/MMA and GSH/As to DPPH free radical,we could get the regression equation of GSH/As、GSH/MMA、GSH/As of different ratio.Then calculated the half elimination ratio(IC50)of them by regression equation.According to the IC50,we concluded that arsenicals(As，As，MMA)could improve the ability of scavenging DPPH free radical by GSH.The strength of scavenging effects of every solution was:GSH/AsGSH/MMAGSH/As.In order to further analysis the influence of arsenicals(As,As,MMA)in the scavenging processes of DPPH free radical by GSH,using HPLC-ESI-MS to research the mixed solutions of GSH and arsenicals(As,As,MMA).Based on the III scanning results of HPLC-ESI-MS,the arsenicals(As,As,and MMA)could react with GSH in mixed solutions and produced GSSG.And GSSG had synergistic effect in the process of scavenging DPPH free radical by GSH.Thus,the arsenical could improve the ability of scavenging DPPH free radical by GSH due to the formation of GSSG.Study on the influence of arsenicals for free radical scavenging by GSH is helpful to the metabolism in vivo and toxic mechanism of arsenicals.Key words：Glutathione,arsenic-glutathione,free radical,arsenicals 目目 录录 第一章 文献综述.1 1.1 谷胱甘肽简介.1 1.1.1 谷胱甘肽的结构.1 1.1.2 谷胱甘肽在生物体内的分布及代谢.2 1.1.3 谷胱甘肽的生物学功能.3 1.1.4 谷胱甘肽的生理功能及应用.6 1.2 谷胱甘肽与金属离子相互作用研究.7 1.2.1 谷胱甘肽与金属离子配合物的形成，结构及其性质的研究.7 1.2.2 谷胱甘肽与金属离子的电化学行为的研究.8 1.2.3 谷胱甘肽对重金属离子的解毒效应以及两者在生物体内的生理效应的研究.9 1.3 砷-谷胱甘肽化合物相互作用研究.9 1.3.1 含砷化合物对生物体的影响.9 1.3.2 砷-谷胱甘肽化合物在生物体内的主要代谢途径及机制.10 1.3.3 As(GS)3复合物的结构.13 1.3.4 砷-谷胱甘肽复合物的检测分析.15 1.4 谷胱甘肽对自由基的清除作用.16 1.4.1 自由基对生物体的影响.16 1.4.2 生物体内常见的抗氧化剂（自由基清除剂）.17 1.4.3 砷对自由基及抗氧化剂的影响.18 1.4.4 DPPH 自由基结构及特性.19 1.5 本论文研究内容和意义.19 1.5.1 研究背景和意义.19 1.5.2 本论文研究内容.21 第二章 砷-谷胱甘肽复合物的降解过程研究.22 2.1 实验仪器与材料.22 2.1.1 实验仪器.22 2.1.2 分析仪器.22 2.1.3 主要试剂.23 2.2 实验方法.23 2.2.1 As(GS)3复合物的制备.23 2.2.2 As(GS)3复合物的检测.24 2.3 As(GS)3复合物的降解过程研究.24 2.4 实验结果与讨论.28 2.4.1 两种新降解产物的结构.28 2.4.2 两种新降解产物的二级质谱分析.30 2.4.3 两种新降解产物造成的影响.32 2.5 本章小结.34 第三章 砷化合物对谷胱甘肽清除 DPPH 自由基的影响.35 3.1 实验仪器与材料.35 3.1.1 实验仪器.35 3.1.2 分析仪器.35 3.1.3 主要试剂.35 3.2 实验方法.36 3.2.1 谷胱甘肽体外清除 DPPH 自由基.36 3.2.2 含有 As、As、MMA的谷胱甘肽溶液对 DPPH 自由基的清除.36 3.3 砷化合物对 GSH 清除 DPPH 自由基的影响及质谱分析.36 3.3.1 谷胱甘肽对 DPPH 自由基清除作用.36 3.3.2 As、As、MMA对谷胱甘肽清除 DPPH 自由基的影响.38 3.3.3 含有砷化合物的谷胱甘肽与 DPPH 混合溶液的质谱研究.43 3.4 结果与讨论.45 3.4.1 As对谷胱甘肽清除自由基的影响分析.46 3.4.2 MMA对谷胱甘肽清除自由基的影响分析.47 3.4.3 As对谷胱甘肽清除自由基的影响分析.47 3.5 本章小结.48 第四章 结论与建议.49 4.1 结论.49 4.1.1 As(GS)3复合物降解过程中产生的两种新化合物.49 4.1.2 砷化合物对谷胱甘肽清除 DPPH 自由基的影响.50 4.2 建议.50 参考文献.52 发表论文和参加科研情况说明.59 致 谢.60 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 1.1 谷胱甘肽简介 谷胱甘肽（GSH）是广泛分布于植物、哺乳动物和微生物细胞内含量最丰富的低分子肽，是生物体内最重要的低分子活性巯基化合物之一，有解毒、清除自由基等许多重要的生理功能。谷胱甘肽结构中含有羧基、氨基、巯基和酰胺基等多种配位基团，有 3 个可解离的质子和 10 个可参与配位的原子，是研究金属离子与生物分子作用比较理想的模型。1.1.1 谷胱甘肽的结构 谷胱甘肽的化学名称是-L-谷氨酞-L-半胱氨酸-甘氨酸，是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的非蛋白巯基化合物，它在细胞内以液态状存在，含巯基最为丰富的一类化合物。谷胱甘肽的熔点为 189-193，等电点是 5.93，其晶体为无色透明的细长柱状，谷胱甘肽不溶于丙酮、醇及醚，易溶于水、液氨、二甲基甲酰胺及稀醇1。大多数多肽能被多肽酶在氮末端氨基酸的-羧基处分解，而 GSH却不会，这是因为它含有一个特殊的肽键由谷氨酸的-羧基和半胱氨酸的氨基（-NH2）构成（图 1-1）。图 1-1 谷胱甘肽的结构式 Fig.1-1 The constitutional formula of Glutathione 在细胞中的多肽易被分布于质膜上的-谷氨酰转肽酶（-GTP）的水解，而谷胱甘肽 C 末端羧基可保护分子免受细胞内-谷氨酰环化转移酶的裂解，同时这种特殊的结构可抵抗细胞内肽酶对其降解。-谷氨酰基使谷胱甘肽分子在细胞内保持完整，因此，GSH 的特殊结构使得它在细胞内以稳定的状态存在。它只能被某些特定的、存在于质膜外侧的-GTP 清除2。GSH 分子中半胱氨酸上的第一章 文献综述 2 巯基（-SH）为该分子化合物的活性中心，是一种强亲核物质，通过亲核取代和加成作用可使有毒亲电物质钝化，-SH 是其发挥生物学功能所必需的。在 GSH结构中，谷氨酸和半胱氨酸均带有负电荷，而且都属于极性氨基酸，因此可以提高与之结合的亲电物质分子中亲脂部分的水溶性（易即细胞膜脂相的亲和力降低）。GSH 的相对分子分子质量为 307，与其他物质结合后形成的加合物分子量大于 300，适于从胆汁排出，从而起到解毒的作用。谷胱甘肽有两种存在形式：氧化型（GSSG）和还原型(GSH)(图 1-2)，这两种形式在生物体内成稳恒性动态平衡，使 GSSG 维持在总 GSH 量的 1%-10%水平，构成有效的抗氧化系统，GSSG 为 GSH 的氧化形式，在氧化剂谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-Px）作用下 GSH 可氧化成 GSSG，在谷胱甘肽还原酶（GSH-Rx）作用下，通过 NADPH 供氢，GSSG 又可还原成 GSH 3；生理状态下，GSH/GSSG维持在高比率，而在氧化应激时，由于 GSH 氧化成 GSSG，GSH/GSSG 比率下降，GSH/GSSG 保持稳定关系对维护组织细胞、多种蛋白质、酶的结构及其功能具有重要的意义。图 1-2 谷胱甘肽的氧化型与还原型互变 Fig.1-2 The tautomerization of oxided Glutathione and reduced Glutathione 1.1.2 谷胱甘肽在生物体内的分布及代谢 在植物、微生物和所有哺乳动物细胞中，GSH 以高浓度（0.1-10mmol/L）普遍存在，其中肝脏中 GSH 的含量最高，然而 GSH 在细胞器中的分布是不均匀的，真核细胞有三个 GSH 库，近 10%的 GSH 分布于线粒体，近 90%分布于胞质，其它极少部分分布于内质网2。虽然线粒体中的 GSH 含量只有 10%左右，但是线粒体是细胞氧化呼吸场所，所以它对细胞具有极其重要的作用，在生理条件下，GSH 及其相关酶是重要的自由基清除剂，在氧化呼吸过程中，通过非酶促反应或酶促反应会产生少量氧自由基，此时 GSH 可起到清除剂的作用。然而线粒体缺乏合成 GSH 的酶，它只能由胞质供给，同时线粒体又不能将被氧化的谷胱甘肽输出到该细胞器外，因此在病理性或生理氧化应激状态下，细胞死亡与线粒体内 GSH 浓度的相关性比与胞质内 GSH 浓度的相关性更大。内质网中的 GSH 可与其他化合物（如辅酶 A、半胱氨酸和某些蛋白质的半胱氨酸残基）的巯基形成混合二硫键，因此内质网中 GSH 与 GSSG 的比例约为 3:1，而在线粒体和胞质中，第一章 文献综述 3 约 95%以上的 GSH 是以还原形式存在的，所以 GSH/GSSG 比例远远超过 10:1，此为细胞内环境处于还原态的基础2。GSH 的主要消耗和合成是在肝脏中完成的，合成后的 GSH 通过毛细胆管流入胆道、肠腔或通过肝血窦流入血液。流入肝血窦和流入毛细胆管的 GSH 比例随动物年龄和肝内 GSH 浓度而变化。研究表明，肝血窦输出的 GSH 为血浆 GSH的主要来源，血浆 GSH 与肝内 GSH 呈正相关。血浆 GSH 主要被肺、肾分解利用，水解后的氨基酸通过血液循环，被肝或其他器官摄取重新合成 GSH；胆管内的一部分 GSH 被分解，释放的氨基酸被肝摄入后重新合成 GSH。GSH 主要由肾脏消除，约 50%-67%的净血浆 GSH 经肾转运，通过肾脏时约 80%GSH 被重吸收，大大超过肾小球的滤过作用，同时，滤过的 GSH 逐步被上皮细胞上的半胱氨酸甘氨酸二肽酶和-谷氨酸转移酶降解，剩余部分则经不相关的基底外侧膜上的 Na通道转运。从肝脏转运的 GSH 可以与胆小管细胞上的转肽酶相互作用，被胆内皮细胞代谢重新吸收。谷胱甘肽在细胞内的代谢主要是通过-谷氨酰循环，此循环过程是谷胱甘肽的合成和降解、谷胱甘肽向细胞外、-GAA 向细胞内转运的重要途径，-谷氨酰循环中有两种酶也参与 GSH 衍生物的代谢，在 GST 的催化下，GSH 与某些亲电化合物反应可生成这些衍生物；关于谷胱甘肽代谢的调节的研究不是很多，在生物体内谷胱甘肽可以以非同型立体异构体的形式抑制-GCS 的活性，此作用取决于细胞内 GSH 浓度，对控制细胞内谷胱甘肽浓度具有重要意义，另外谷胱甘肽也可以抑制-谷氨酰胱氨酸的转运，这一作用与细胞外谷胱甘肽的浓度有关4。1.1.3 谷胱甘肽的生物学功能 谷胱甘肽分子中含有-谷氨酰基和活性巯基，是其许多重要生理功能的结构基础5。GSH 作为哺乳动物细胞内最主要的非蛋白巯基和含量最丰富的低分子量多肽，对保护细胞膜的完整性，维持细胞生物功能有着重要作用，它直接和间接参与许多功能活动。（1）清除体内的过氧化物及自由基，抵抗自由基对机体的损伤 还原性 GSH 是机体内的主要抗氧化剂，能够抵抗氧化剂对巯基的破坏，保护体内重要的酶蛋白巯基不被氧化而失活。GSH 还是体内重要的自由基清除剂，能够清除人体内的自由基，净化和清洁人体内环境。谷胱甘肽具有很强的亲和力，可通过巯基使体内的多种自由基（如烷自由基、过氧自由基、半醌自由基等）还原为容易代谢的酸类物质，加速自由基的排泄，对机体有很强的保护作用，维持第一章 文献综述 4 机体的正常代谢。同时谷胱甘肽可通过与过氧化物酶共轭，抵抗细胞脂质的过氧化损伤，作为谷胱甘肽还原酶的底物，可有效的清除体内的过氧化氢和过氧化脂质，如 GSH 可在含硒过氧化物酶（GSHpx）的催化下清除体内有害的过氧化物及自由基，如下所示：ROOH 和自由基不仅氧化某些具有重要生理作用的含巯基的蛋白质和酶，使之丧失活性，还将细胞膜磷脂分子中多不饱和脂肪酸氧化成过氧化物，生成的过氧化脂质又会通过自身的催化连续生成大量过氧化物，因此 GSH 通过自身氧化可以中止脂质过氧化的连锁反应6；谷胱甘肽还可抵御自由基对线粒体膜脂的过氧化损伤，保护线粒体膜上的各种重要功能蛋白，使其氧化磷酸化及呼吸链电子传递等生理过程得以正常有效的进行。（2）参与氧化还原过程，保护红细胞的形态及带氧能力 红细胞内氧的代谢能力非常旺盛，GSH 是重要的抗氧化物质，当某些氧化剂进入人体后可使红细胞膜磷脂和胞内的血红蛋白（Hb）的-SH 氧化，后者的氧化产物附着于红细胞膜内侧面，损坏膜的功能，使红细胞过早地破坏沉淀，甚至出现黄疸。尤其是有遗传缺陷而先天性缺乏 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6PD）的人更易受到伤害，因为这种个体不能使 6-磷酸葡萄糖（G-6P）脱氢转化为 6-磷酸葡萄糖（6-P-G）而将脱下的氢传递给氧化型辅酶（NADP+），使其转化为还原型辅酶（NADPH），从而细胞内 GSH 难以形成6，如下图 1-3 所示。图 1-3 NADPH 与 GSH 的关系 Fig.1-3 The relationship of NADPH and GSH 由于体内没有足量的谷胱甘肽，血红蛋白、红细胞膜以及细胞内其他的含巯基酶极易遭受氧化性物质的损害，红细胞尤其是较老的红细胞比较容易破裂，发生溶血性黄疸。同理，先天性缺乏 G-6PD 的人由于体内没有足够的 GSH 而不能有效地保护红细胞膜，极易遭受伯氨喹啉、磺胺类、硝基呋喃类、阿司匹林亚甲蓝等 54 种药物的伤害而出现溶血性贫血。第一章 文献综述 5 谷胱甘肽作为机体内重要的抗氧化物质，可抵抗氧化剂对巯基的破坏作用，同时阻止血红蛋白被过氧化氢氧化，保护重要酶分子中的巯基（-SH）不被氧化而灭活，有利于酶活性的发挥，并且能恢复已被破坏的酶分子中巯基的活性功能，使酶重新恢复活性，防止溶血并减少高铁血红蛋白的损失，保证血红蛋白能够持续的发挥输氧功能。以谷胱甘肽为底物的谷胱甘肽过氧化物酶能催化过氧化氢生成水且催化脂质过氧化物生成醇，可以避免对红细胞膜的损伤。血红蛋白分子中的二价铁离子（Fe2+）是红细胞运输氧所必需的，它可以与氧结合成为氧合血红蛋白；如果血红蛋白中的 Fe2+被氧化成 Fe3+，将丧失其运氧能力。在正常情况下，谷胱甘肽与其他还原型物质（包括 NADPH、NADH 和抗坏血酸）共同组成了氧合血红蛋白还原系统，能有效防止二价铁离子的还原，使之持续正常发挥运输氧的能力，所以谷胱甘肽对缺氧血症具有缓解作用7，还原型谷胱甘肽既能直接与氧化剂（如过氧化氢等）结合，生成水和氧化型谷胱甘肽，也能够将高铁血红蛋白还原为血红蛋白8。（3）谷胱甘肽参与氨基酸等物质的吸收及转运 借助细胞膜中特异蛋白质载体系统以及在谷胱甘肽参与下，人体吸收氨基酸并把氨基酸从细胞外转运到细胞内。谷胱甘肽是通过-谷氨酰基循环来实现氨基酸的吸收和转运的，-谷氨酰基的循环过程为：细胞外氨基酸在细胞膜基质上的-谷氨酰基转移酶作用下与谷胱甘肽反应，生成-谷氨酰氨基酸和半胱氨酰甘氨酸，进入细胞内，在细胞质中-谷氨酰氨基酸经-谷氨酰环化转移酶的催化，分解成氨基酸和 5-羟脯氨酸。5-羟脯氨酸在 5-羟脯氨酸酶的催化下水解成氨基酸，半胱氨酰甘氨酸则由二肽酶水解生成半胱氨酸和甘氨酸。这样就完成了三种氨基酸的循环，然后它们又可以重新用来合成谷胱甘肽，反应过程中有 ATP 提供能量8,9。（4）谷胱甘肽的其他功能 谷胱甘肽是人和动物机体内一种重要的功能性寡肽，它还具有许多其他重要的功能，刘平祥等研究表明增加谷胱甘肽可提高血清GF-1 的水平，使猪腺垂体 GH 分泌增加，提高肌肉和肝的GF-1mRNA 的表达量9，因此谷胱甘肽具有调节生长轴相关激素及基因表达的功能。谷胱甘肽还是生物体内一种重要的解毒物质，它具有很强的亲和力，可与侵入生物体中的重金属离子（如 Pb、Hg、As、Cu 等）、有毒化合物及其代谢物结合，形成大分子物质并排出体外，起到解毒作用。作为酶反应的辅基，谷胱甘肽可保护生物体内的巯基，同时谷胱甘肽还可清除机体内过多的自由基，参与体内三羧酸循环过程以及糖代谢过程，具有解毒、预防癌症等作用10。随着对谷胱甘肽研究的不断深入，其生物学功能也越来越受第一章 文献综述 6 到人们的关注，有研究发现谷胱甘肽在以下方面的新功能：细胞的凋亡、遗传基因的表达、蛋白质谷胱甘肽化、信号转导等，这些新功能的发现为我们从分子、细胞及整体等层次上研究谷胱甘肽的功能奠定了基础11。1.1.4 谷胱甘肽的生理功能及应用 谷胱甘肽在生物体内具有清除自由基及对重金属的解毒作用，促进氨基酸的转运及提高免疫功能，调节基因的复制、转录及细胞生长等多种生物学功能，在临床医药、食品工业及畜禽生产等方面的应用也越来越广泛。在临床医药方面，谷胱甘肽可作为解毒剂和抗氧化剂，用于重金属、一氧化碳、丙烯腈及有机溶剂等的解毒。谷胱甘肽可保护蛋白质的巯基免遭氧化性破坏，阻止 H2O2氧化血红蛋白，防止其他过氧化物对生物膜的破坏作用，在临床应用上相应的表现为防止红细胞溶血，促进高铁血红蛋白的还原，抑制白内障以及角膜与视网膜疾病的发展；在临床医药方面，谷胱甘肽可作为解毒剂，与外源或内源的活性化合物结合或发生反应，从而解除这些物质对生物体的毒性，例如用于解除重金属、一氧化碳、丙烯腈及有机溶剂等的中毒症状。谷胱甘肽可保护蛋白质的巯基免遭氧化性破坏，阻止 H2O2氧化血红蛋白，防止其他过氧化物对生物膜的破坏作用，在临床应用上相应的表现为防止红细胞溶血，促进高铁血红蛋白的还原，抑制白内障以及角膜与视网膜疾病的发展；谷胱甘肽可消除体内的自由基，抑制脂质过氧化，保护细胞膜，恢复细胞功能，防止机体衰老，此生理功能使谷胱甘肽在临床上的应用表现为：防止皮肤老化及色素沉积，促进皮肤产生光泽，改善皮肤抗氧化能力，防止肿瘤或动脉硬化的产生，减少自由基对 DNA的攻击而导致的损伤和突变；谷胱甘肽还参与转甲基、转丙氨基反应，维持并促进肝细胞正常功能，在临床应用上可抑制乙醇侵害肝脏产生脂肪肝，减轻病毒性肝炎与药物性肝损伤症状，减轻低白蛋白血症。谷胱甘肽在食品工业中的应用也越来越广泛，因其独特的生理功能被称为长寿因子和抗衰老因子，谷胱甘肽在食品加工工业上可作为抗氧化剂、氨基酸强化剂、风味强化剂加入到面制品及肉制品中。20 世纪 50 年代，谷胱甘肽作为生物活性添加剂在日本等发达国家就开始加入到保健食品的生产中，制成功能性食品推向市场11。第一章 文献综述 7 1.2 谷胱甘肽与金属离子相互作用研究 谷胱甘肽分子中有 10 个可参与配位的原子，还有 3 个可解离质子，是研究金属离子和生物分子作用比较理想的模型，而且谷胱甘肽与某些金属离子结合形成的配合物具有抗癌及酶活性，具有非常重要的生理生化功能12。金属元素尤其是重金属元素具有强烈的亲硫元素特性，而 GSH 分子结构中的活性功能团是巯基（-SH），它能与金属离子（M2+）结合形成无毒或低毒的配合物排出体外，从而起到解毒的作用。近年来对谷胱甘肽的研究，尤其是对金属离子与谷胱甘肽作用的研究主要有以下几个方面：谷胱甘肽与金属离子配合物的形成，结构及其性质的研究；谷胱甘肽与金属离子的电化学行为的研究；谷胱甘肽对重金属离子的解毒效应以及两者在生物体内的生理效应的研究13。1.2.1 谷胱甘肽与金属离子配合物的形成，结构及其性质的研究 由于谷胱甘肽分子具有多个可参与配位的原子，它与金属离子的络合情况较为复杂，所以对谷胱甘肽与金属离子的络合位置、络合能力以及生成配合物的构象成为研究的重点及热点。任吉民等利用顺磁稀土离子的诱导化学位移变化，发现谷胱甘肽在水溶液中通过分子两端的羧基负离子与稀土形成遥爪配位结构13；张树功等利用 Raman光谱和红外光谱对稀土谷胱甘肽配合物的研究，发现稀土谷胱甘肽配合物每式量含有 2-6 分子水，氮与稀土含量的摩尔比接近 9:1，表明该配合物的配位比是 1:3，对稀土与氧化型谷胱甘肽配合物的 X 射线光电子能谱（XPS）研究，表明配体中各氧原子与稀土离子配位，配合物中配体的构象基本是不变的14；Vicky Mah 等用 199Hg 核磁共振研究和扩展 X 射线吸收精细结构谱（EXAFS）研究一系列溶液（Ph=10.5）中 GSH 与 Hg 配合物的形成和结构，结果显示谷胱甘肽与汞反应形成的主要配合物是Hg(Gs)24-和Hg(Gs)37-，测得三角和对角 Hg-S 键的键长分别是 2.42A 和 2.32A，并用 EXAFS 模型线性组合得到了 Hg2+-GSH 配合物的比例模型15；Levina L 等联用电喷雾质谱（DSMS）,电磁顺磁共振谱（EPR），X 射线谱（XAS）等方法研究了 Cr（）和 GSH 的作用过程中形成的一种中间态配合物CrVO(LH2)23-,并用多重散射 X 射线吸收精细结构能谱（XAFS）检测了配合物的键长16；杨培慧等利用电化学方法对重铬酸钾和谷胱甘肽的相互作用形成中间态配合物过程也进行了研究17；阮湘元等利用原子显微镜（AFM）对谷胱甘肽的表面形貌特性进行了研究，得到了谷胱甘肽在汞表面上的形貌特性，AFM在生物科学方面的应用，使得在分子水平上对金属离子与谷胱甘肽作用的研究成第一章 文献综述 8 为可能18；对金属离子和谷胱甘肽形成的配合物的动态结构和三维结构变化信息的研究，有助于从分子及分子集合体水平上进一步了解谷胱甘肽在生物体内的生理功能，对谷胱甘肽在生物体内与金属离子的相互作用机制的进一步研究提供有用的信息12。1.2.2 谷胱甘肽与金属离子的电化学行为的研究 近年来，关于含硫化合物在金属电子表面自组装膜（SAM）修饰电极的研究成为热点。谷胱甘肽是生物体内具有重要生理功能的含巯基肽，功能基团巯基的存在使其很容易与金属离子结合，例如巯基可与金作用吸附排列在金电极表面上，从而自组装到金电极表面形成单分子层，使电极表面的物理性质和化学性质得到修饰，该电极会通过离子闸门作用对电活性离子的渗透和在电极上的反应造成影响。江子伟等19用谷胱甘肽在金电极上自组装形成单分子膜，发现该单分子膜能组织 Fe(CN)63-离子在金电极上还原，有离子闸门的作用，并且会影响电活性离子的渗透以及电极上的反应，应用计时库仑法和循环伏安法，比较了 La3+和Ca2+在改变谷胱甘肽单分子膜的结构及Fe(CN)63-离子的扩散系数方面的能力。王俊等20报道了在表面活性剂存在下，以铁氰化钾及苯醌作为探针，用循环伏安法研究谷胱甘肽单分子膜的电化学行为，发现谷胱甘肽在阳离子表面活性剂作用下存在离子闸门行为，随着阳离子表面活性剂浓度的增加，修饰电极表面的电子传输也随之增加。Cheng Fang 等21利用金属离子与谷胱甘肽形成配合物，在金电极上自组装形成单分子膜，研究该膜的电化学行为时发现具有离子门效应。La3+、Pb2+、Ba2+、Ca2+等金属离子有明显的打开膜上离子门的行为，其作用顺序依次减弱，相反 Zn2+具有关闭离子门的作用。谷胱甘肽-金属离子单分子膜的结构随着金属离子浓度计溶液的 PH 值得改变而变化。戴云辉等22发现在铜离子存在下，pH=4.7 的 NaAc-HAc 缓冲溶液中，谷胱甘肽可与铜离子反应得到谷胱甘肽与铜离子组成的 1:1 的络合物，该络合物在单扫示波极谱中产生了新的络合物吸附波，并对该极谱波的产生条件和性质进行了研究，得到了该吸附波的峰电位等一系列的电化学参数，并初步探讨了该极谱波的电极反应机理。对谷胱甘肽与金属离子体系的电化学行为的研究，有助于从分子及分子集合体水平上进一步了解谷胱甘肽在生物体内的生理功能，以及生物体内谷胱甘肽与金属离子的相互作用机制。第一章 文献综述 9 1.2.3 谷胱甘肽对重金属离子的解毒效应以及两者在生物体内的生理效应的研究 重金属元素是环境中最主要的污染物之一，所有的重金属元素对生物体都存在潜在的毒性，当这些重金属元素在生物体内聚集到一定量时就会中毒。金属在生物体内的代谢对生物组织中金属的转移、聚集以及毒性有重要的影响，金属会引起活性自由氧加剧产生、阻止抗氧化活动。降低重金属毒性的最好办法是在他们进入生物体之前减少其吸收或者使其结合成内源性物质，谷胱甘肽作为生物体内富含巯基的小分子肽，在解毒代谢过程中发挥着重要的作用。金属元素可以与 GSH 分子中的巯基结合，因此 GSH 是细胞内金属离子的螯合剂，有解毒的作用。谷胱甘肽对金属元素的解毒能力和金属离子与巯基的结合能力有关，而这种结合能力与金属离子的软硬性有关，Hg、Cu、Cd 三种相对软性的离子具有较强的络合能力，而 Zn、Pb、Ni 三种相对硬性的离子络合能力则较低。另外，生物体内重金属的氧化还原反应会对生物体内的细胞和组织产生而氧化胁迫，谷胱甘肽可以起到保护的作用，谷胱甘肽的氧化还原循环被看作是生物体内抵抗氧化胁迫的第一道防线。作为细胞中主要的抗氧化剂，谷胱甘肽的抵抗能力与其浓度及生成速率有关。近年来，对金属离子与谷胱甘肽的电化学行为，配合物构象及生理效应方面的研究比较集中，有学者利用原子力显微镜对谷胱甘肽的表面形貌特性进行研究，有助于从分子及分子集合体水平上了解谷胱甘肽的生理功能，对金属离子与谷胱甘肽在生物体内的相互作用机制研究提供有用的信息。1.3 砷-谷胱甘肽化合物相互作用研究 1.3.1 含砷化合物对生物体的影响 砷是广泛存在于自然界中的一种类金属元素，是人体内含量最丰富的 12 种元素之一，无机砷主要是以三价砷及五价砷化合物的形式存在于自然界，同时也是确认的致癌毒物23,24。目前已知的砷毒性取决于其体内形态及氧化还原状态25。人类摄入砷的主要途径是饮水和食物，饮水中主要含有 As3-、As1-,As3+和 As5+等多种形式的无机砷，而食物中同时含有机砷和无机砷。通过对水源的管理，饮水中的砷含量在一定程度上得到了控制，随着饮水中砷暴露的逐渐减少，饮食对第一章 文献综述 10 砷的摄入成为砷暴露的主要途径16-18。美国典型饮食砷暴露为 20-30 g/d29,砷主要有两种化合价态，As和 As。As具有更强的毒性，是 As毒性的 11 倍，As主要是以砷酸盐的形式存在，As以亚砷酸盐的形式存在。砷酸盐的毒性主要是由砷酸根（AsO43-）与磷酸根（PO43-）的相似性引起，通过竞争砷酸根可以抑制磷酸根在各类物质与能量代谢中的作用30。As则是与半胱氨酸或胱氨酸的巯基（-SH）或含-SH 的蛋白质紧密结合使其失去活性31，发挥毒性作用。无机砷甲基化生成一甲基砷酸(MMA)和二甲基砷酸（DMA）的过程一直被认为是无机砷在人类和哺乳动物体内发生生物转化和解毒的主要途径23，然而近年来的研究表明，砷的甲