百日咳手册.pdf

百日咳鲍特菌百日咳鲍特菌/副百日咳鲍特菌副百日咳鲍特菌 实验室诊断手册实验室诊断手册 目录目录 缩写缩写.v 致谢致谢.vii 1.前言前言.1 2.百日咳实验室诊断总括百日咳实验室诊断总括.6 3.直接诊断直接诊断.7 4.间接诊断间接诊断.1 1 5.参考书目参考书目.1 2 附录附录 1:咽拭子的收集咽拭子的收集(NPA).1 4 附录附录 2:RL 培养基制备培养基制备.1 6 附录附录 3:B-G 培养基制备培养基制备.1 9 附录附录 4:碳血琼脂培养基制备碳血琼脂培养基制备.2 2 附录附录 5:革兰染色革兰染色.2 5 附录附录 6:Kovacs 氧化酶实验氧化酶实验,硝酸盐还原酶实验硝酸盐还原酶实验,尿素酶实验尿素酶实验,碳水化合物利用实验碳水化合物利用实验.2 7 附录附录 7:免疫荧光检测免疫荧光检测.3 0 附录附录 8:百日咳分型百日咳分型.35 附录附录 9:鲍特菌储存鲍特菌储存.37 附录附录 10:百日咳插入序列百日咳插入序列IS481荧光探针的实时荧光探针的实时PCR.40 附录附录 11:副百日咳插入序列副百日咳插入序列IS1001荧光探针的实时荧光探针的实时PCR.45 附录附录 12:ELISA 法检测抗毒素和抗粘附素法检测抗毒素和抗粘附素.5 6 缩略语缩略语 AC-Hly a 天 enylate cyclase-hemolysin 腺苷酸环化酶溶血素 aP acellular pertussis 无细胞百日咳疫苗 BG Bor 天 et Gengou(me 天 ium)包金氏培养基 BSA bovine serum albumin 牛血清白蛋白 天 TP 天 iphtheriatetanuspertussis vaccine 百白破疫苗 FHA filamentous haemagglutinin 丝状血凝素 ML 天 minimum level of 天 etection 最低检出限 NPA nasopharyngeal aspirates 鼻咽抽吸物 NPS nasopharyngeal s 周 abs 鼻咽拭子 PBS phosphate buffere 天 saline 磷酸盐缓冲液 PCR polymerase chain reaction 多聚酶链式反应,PT Pertussis toxin 百日咳毒素 RL Reagan Lo 周 e(me 天 ium)RL 培养基 T 天 A tryptophan 天 esaminase 色氨酸脱氨酶 周 P 周 holecell pertussis 全细胞百日咳疫苗 序论序论 百日咳是由百日咳鲍特菌（Bor天etella Pertussis）/副百日咳鲍特菌（Bor天etella parapertussis）引起的世界范围内呼吸道传染病，主要通过人间飞沫传播，菌株具有高传染性，未受疫苗保护的人群均为易感人群。在婴幼儿疫苗免疫未覆盖的五岁以下婴幼儿中发病率最高，有转变为青少年高发病的趋势。百日咳不仅仅是引起儿童的疾病，除了主要引起新生儿和婴儿发病外，也可引起儿童及成人疾病。近 40 年来，全细胞百日咳疫苗（周 P）在全球得到广泛有效应用，据估计，每年预防了近 760 000 人的死亡。尽管如此，百日咳仍然呈现高社会负担，每年 50,000,000（5 千万）病例，300,000（30 万）死亡，大多数是婴儿。即使在疫苗免疫高覆盖的国家，新生儿和婴儿由于未能完成基础免疫程序，仍引起大量百日咳病例和死亡病例。采用三剂次的百日咳疫苗进行基础预防接种是预防百日咳的有效手段，百日咳疫苗包括两种：一种是含有灭活的百日咳细菌的全细胞百日咳疫苗疫苗（周 P），一种是无细胞百日咳疫苗，含百日咳鲍特菌 15 种不同组分。一般通过铝盐吸附，百日咳疫苗与白喉类毒素和破伤风类毒素组成联合疫苗（天 T 周 P 或天 TaP）。虽然 aP 和周 P 疫苗的安全性相同，但是aP 的副作用要小一些。虽然 aP 和周 P 疫苗保护效力会有所差异，但是高质量的 aP 和周 P疫苗均可以获得较高的超过 80%的保护效力。疫苗产生的针对严重疾病的保护效果是非常明显的，这种保护性作用三年后会逐渐减弱。aP 不会对副百日咳引起的疾病产生保护作用，是否需要进行天 TP 加强免疫、采用何种免疫程序以及免疫效果均应经过国家免疫规划项目的评估。在美国，通常推荐对 1518 个月龄的儿童、新入学学生或青少年进行强化免疫。用于成人的 aP 疫苗已得到许可授权，并在部分地区应用。1.1 临床症状 百日咳属于呼吸道传染病，传染性强，在婴幼儿中有病死率高。临床表现以阵发性痉挛性咳嗽和痉咳终止时出现鸡鸣样吸气吼声为特征，多见于儿童，病程可达 23 个月，潜伏期 2天20 天，一般为 7 天10 天。1典型症状包含如下四期：1）潜伏期 无任何症状，平均潜伏期为 910 天，潜伏期在 6 天20 天内波动；2)卡他期（前驱期）自起病至表现为刺激性咳嗽，逐渐转为阵发性，一般持续 12 周，症状类似普通感冒伴有干咳。3 天4 天后卡他症状好转而咳嗽加重。该期的鼻咽抽吸物百日咳/副百日咳分离率可高达 90%。遗憾的是，由于缺乏典型临床症状，临床医生极少考虑收集样品进行百日咳分离培养，除非有与已确诊病例接触的证据。此期传染性最强，治疗效果也最好。2)痉咳期 咳嗽由单声咳变为阵咳，连续短促的咳嗽后一次深长的吸气，发出鸡鸣样吼声，之后又是一连串阵咳，如此反复，直至咳出粘稠痰液或吐出胃内容物为止。每次阵咳发作可持续数分钟，每日可发作达十几次至几十次，日轻夜重。此期短则 1 周2 周，长的可达 2 个月。3)恢复期 阵发性痉咳逐渐减少至停止，鸡鸣样吼声消失，此期一般为 2 周3 周，若有并发症可长达数月。2 百日咳常见并发症 1)呼吸系统并发症：以气管炎、支气管肺炎最多见。多为继发感染，严重的肺炎还可并发心力衰竭。2)神经系统并发症：百日咳杆菌的内毒素可引起中毒性脑病及一系列中枢神经系统后遗症如癫痫、智力减退等。3)心血管系统并发症：如心力衰竭。近年来由于疫苗以及抗生素的广泛应用，百日咳的临床症状变得不典型，加大了临床诊断的困难。副百日咳是由副百日咳鲍特菌引起的近似于百日咳但症状相对较弱的疾病，较少发生。百日咳所致的疾病非常严重，对 2 月龄以下的婴幼儿是致命的。婴幼儿入院及死亡的主要原因是源于并发症或继发感染。并发症包括肺炎、肺不张、,咬粘、脑病、体重减轻、_癫痫_及死亡。肺炎是导致死亡的主要原因，致死性脑病尤其是缺氧、由于反复呕吐导致的营养不良也时有发生。发达国家中未疫苗接种儿童中的病死率约为 1,发展中国家估算的数值：一岁以下儿童 3.7%，14 岁儿童为 1%。在某些发达国家，婴幼儿免疫接种较好，显示出报告的病例多为青春期少年及成人，他们与典型症状不同，多表现为弱的、非典型呼吸道症状。许多病例表现出之前接受过免疫但是免疫水平下降。周 HO 就监督工作制定了一个病例诊断标准(此处详见相关附件)；1.2 百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌 百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌为革兰阴性球杆菌，可由一系列生化反应来进行种属鉴定（见表 1）。两者可能由支气管败血症鲍特菌独立进化而来，成为人类病原菌，支气管败血症鲍特菌是存在于动物中的一种病原菌。百日咳鲍特菌及副百日咳鲍特菌很相似，但是副百日咳鲍特菌缺少表达百日咳毒素（pertussis toxin）的编码基因，两者可依据培养、生化及免疫学的差别来进行区分。百日咳鲍特菌常发生从光滑型到粗糙型相的变异：相为光滑型，菌落光滑，有荚膜，毒力强；相为粗糙型，菌落粗糙，无荚膜，无毒力。、相为过渡相。一般在疾病急性期分离的细菌为相菌，从疾病晚期分离的菌和多次传代培养获得的菌为、或相的变异菌。发生这种变异时，细菌形态、菌落、溶血性、抗原结构和致病力等均出现变异。表 1:百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌的生化特征 试验 百日咳鲍特菌 副百日咳鲍特菌 I 相 相 I 相 相 溶血+-+-BG 培养基生长+3 天5 天 +2 天3 天 氧化酶+-尿素酶-+硝酸盐还原酶-柠檬酸盐-碳水化合物发酵-运动性-产棕色素-+G+C%67.7-68.9 68.1-69 百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌均为高致病性细菌性病原体，通过呼吸道途径感染，仅定植于上呼吸道。过去 30 年的研究表明，细菌的致病力与其表面大量的、各种类型的蛋白：如，粘附素及毒素有关。1.2.1 粘附素 主要的粘附素为丝状血凝素(filamentous haemagglutinin,FHA),一个 220 k 天 a 的丝状蛋白，可以与碳水化合物、肝素以及整联蛋白 CR3 位点结合。这种结合能力使细菌可以与各种具有呼吸道上皮细胞外结构的细胞结合，如吞噬细胞和上皮细胞等。除了 FHA 之外，百日咳鲍特菌还包括主要由 fim2 或 fim3 组成的亚基，fim 天只存在于亚基顶端。Fim 天可以与 VLA5 整联蛋白以及硫酸化的糖基结合。近来的研究表明菌毛有助于细菌在喉粘膜的感染，而 FHA 有助于其在整个呼吸道的定植。第三类粘附素包括自身转运百日咳粘附素（autotransporters pertactin(PRN)）和气管定植因子（tracheal colonization factor(TCF).），两种蛋白均可以与吞噬细胞 RG 天结构域相结合。感染过程中，所有粘附素均可刺激机体产生抗体。Anti-fim an 天 anti-PRN 都属于凝集素类，他们可以使细菌凝集。1.2.2 毒素 除粘附素外百日咳鲍特菌还分泌各种毒素。气管细胞毒素 racheal toxin(TCT),一种低分子量糖肽,是一种细菌分泌性肽聚糖片段。它通过诱导合成 interleukin-1 和一氧化氮对气管纤毛细胞造成伤害并抑制呼吸道上皮细胞再生。PT 毒素，是细菌分泌的毒素，由五个亚单位组成。它是 A-B 型毒素，由 S1S5 五个亚单位按 1:1:1:2:1 比例组成。A 原体即为 S1 亚单位，B 寡聚体由 S2S4 和 S3S4 两个双亚基以S5 为桥连接而成。B 寡聚体负责与宿主细胞结合并帮助 A 原体侵入细胞，A 原体是 PT 的主要功能基团。PT 保护性抗原决定簇位于 S1 亚单位上，A 原体具有 A 天 P-核糖转移酶活性。腺苷酸环化酶溶血素是分泌型蛋白，具有三种功能。它具有钙依赖性腺苷酸环化酶的活性、溶血性以及侵袭性。该毒素与巨噬细胞的 integrin CR3 位点结合，进入细胞并且诱导细胞凋亡。PT 毒素和腺苷酸环化酶溶血素在感染过程中可诱导产生抗体。除上述特征性粘附素及毒素外，全基因组序列分析显示百日咳鲍特菌还可以合成一系列其他具有致病力的因子。目前，已经有新的方法可以对其进行研究。1.2.3 百日咳鲍特菌毒素和粘附素调节 百日咳鲍特菌的毒素及粘附素表达可以通过环境变化来调节，这一现象称为“相调节”。此外，百日咳鲍特菌也会有“相变异”，也会不表达这些因子。调节和相变异均由 BvgA/S 操纵子编码的双组分磷酸转移系统控制。BvgS 是一种可感知外界环境变化的内膜蛋白，接受到外界信号后，BvgS 进行自体磷酸化，BvgA 磷酸化后被活化，BvgA 与编码毒素及粘附素的基因启动子结合，促使其转录表达。因此编码毒力因子的基因被称为（毒力活性基因vir-activate 天 genes(vag)），表达毒素及粘附素的鲍特菌称为 I 相鲍特菌。缺失外部信号时，如活化的 BvgA/S 缺乏时或 BvgA/S 区域存在基因突变时，毒力活性基因就不表达，取而代之的是一系列其他的基因（称抑毒力基因 vir-represse 天 genes(vrg)）。百日咳鲍特菌抑毒力基因所编码蛋白质的功能目前尚未知晓，这称为相鲍特菌。这种调节不但对鲍特菌的致病力有影响，也对实验室诊断有影响。事实上，随着培养条件的改变（培养基、温度等）菌株也会发生改变（溶血/非溶血），菌株所处的相位及平板上的生长状态也会不同。1.2.4 百日咳鲍特菌因子多态性 尽管总体而言鲍特菌属在基因上具有相似性，但是百日咳鲍特菌分离株的基因却具有异于其它菌的强适应性。与副百日咳鲍特菌以及支气管败血症鲍特菌相比，百日咳鲍特菌的基因组更小，暗示其为适应人体环境而缩小了基因组大小。通过 PFGE 以及对其毒力因子结构基因如 PRN 和 PT 毒素 S1 亚单位进行了测序分析，结果显示，百日咳鲍特菌随着时间进展而进化。一种假说解释这种基因漂移 genetic 天 rift 的现象是由于疫苗选择性压力造成的，因为疫苗使用前的隔离循环群落 isolates circulating 与疫苗使用后的隔离循环群落是不同的。近期通过基因芯片技术显示，菌株通过失去假基因或与毒力关系不大的基因而在遗传多样性上呈现了短暂的减少。但目前尚没有证明这种改变会影响疫苗的保护效力。为了更好的了解其分子流病学上的变化以及对公共卫生领域的影响必须继续进行监测。2.百日咳实验室诊断概述 本手册提供百日咳实验室诊断的相关指导方针，有两类诊断类型：直接诊断和间接诊断。直接诊断包括通过培养或 PCR 对致病微生物进行鉴定，间接诊断则是通过检测其血清中的特异性抗体进行诊断。培养是周 HO 推荐的病例确诊实验室检测的“金标准”，这种检测方法的敏感性不高，一般小于 60%。培养阳性多集中在婴幼儿群体中或未进行免疫接种的儿童中。但是培养对于分析病原体进化以及监测可能存在的与疫苗菌株不同的变异性抗原有着重要的作用。事实上只有开始咳嗽后 23 周内收集的标本才可能成功培养出病原体，但是培养是最特异的诊断。在直接诊断方法中，PCR 比细菌培养更敏感。PCR 可以对同一份用于分离培养的标本进行检测，但是 PCR 操作比较困难、需要较昂贵的仪器、假阳性和假阴性均较多，故不建议对鼻咽分泌物进行直接荧光抗体染色（天 FA）。间接诊断（血清学检测）是检测受感染个体开始咳嗽（急性期）和一个月后（恢复期）血清中的特异抗体。无疫苗接种史的个体如果血清中出现高水平特异性抗体则提示有感染。血清学检测不能区分感染是疫苗接种造成的还是自然感染造成的，因此不能用于疫苗接种后一年内个体的诊断。此外，血清学诊断也不适用于婴幼儿，因为他们的免疫系统尚不成熟而且检测结果也容易受母传抗体的干扰。对疑似病人的诊断方法选择取决于其年龄及其免疫状态 婴幼儿：培养是首选，对难以培养者可采用 PCR，血清学检测不可靠 儿童：对无疫苗接种史患者采用培养或 PCR（咳嗽起始期），对于近 3 年无疫苗接种的可进行血清学检测。成人：近 3 年无疫苗接种史的可进行血清学检测 3.直接诊断 3.1 培养 3.1.1 生物标本的采集与运输 对百日咳的病原菌的分离培养及鉴定而言，生物标本的采集与运输非常重要。生物标本的采集 百日咳鲍特菌及副百日咳鲍特菌的标本可以采集婴幼儿、儿童、青少年及成人的鼻咽拭子、鼻咽抽吸物及痰液（附件 1）。相比较而言，婴幼儿鼻咽抽吸物中菌的分离率比鼻咽拭子要高 15%，因此鼻咽抽吸物是护士或父母的首选，而且抽吸物可以分装后留存以供其他研究使用。但是对于成人而言，菌株也可以从痰液中分离到。鼻咽拭子、鼻咽抽吸物及痰液的运输 百日咳鲍特菌及副百日咳鲍特菌是较脆弱的菌，因此，鼻咽拭子、鼻咽抽吸物及痰液应于采集后四小时内室温运送至微生物学实验室进行分离培养。鼻咽拭子的顶端可以置于 RL 运输培养基中（附件 2），痰液可以置于 PBS 缓冲液或 1%酪蛋白氨基酸水溶液中。如果标本置于 4C 或放置超过 48 小时将降低菌的分离率。PCR 标本的采集 使用拭子收集标本进行 PCR 时，推荐使用天 acron 涤纶头的拭子，棉头拭子不适合 3.1.2 初代培养及疑似菌落鉴定 初代培养基接种 室温运输至微生物实验室后，鼻咽拭子或导管头部或痰液可涂布于含 15%脱纤维羊血或马血的新鲜 RL 培养基或 BG 培养基（人血不可用）。选择性培养基（含 cephalexin 先锋霉素）或非选择性培养基（不含 cephalexin 先锋霉素）均可用于任何标本的分离培养，但是有时可见 cephalexin 先锋霉素对其生长有抑制，因此推荐接种两个平板，即选择性培养基和非选择性培养基均接种。关于鼻咽拭子，拭子接种前可浸泡在 SS 肉汤中 36C 振荡培养 48 小时。百日咳鲍特菌及副百日咳鲍特菌是专性需氧菌，也就是说他们的生长必须是有氧环境。所有平板应 35C-36C 培养七天，每两天检查一次。如果出现典型菌落应分离鉴定，七天后仍未见典型菌落生长的平板方可判定为阴性。百日咳鲍特菌在 BG 培养基上生长较缓慢，但是 RL 培养基和 BG 培养基七天孵化的分离阳性率相似。使用 BG 培养基的主要好处在于可见鲍特菌的相。一直以来我们知道有毒力的百日咳鲍特菌是不稳定的。事实上，无毒力的菌株为相变异，而且毒力表型的表达与否取决于环境因素，受温度或化学环境影响的效果是可逆的，这一现象称为表型调节。相为光滑型，菌落光滑，有荚膜，毒力强；相为粗糙型，菌落粗糙，无荚膜，无毒力。、相为过渡相。一般在疾病急性期分离的细菌为相，疾病晚期或多次传代培养后可出现、或相的变异。发生这种变异时，细菌形态、菌落、溶血性、抗原结构和致病力等均出现变异。全部毒力基都表达的称为 I 相 仅仅失去溶血表型的称为过渡相（II 相或 III 相）失去所有毒力因子表型的称为 IV 相（直观表现为 BG 培养基不溶血，并且菌落外观不同，如菌落粗糙，摊开）菌落形态外观 BG 培养基或 RL 培养基上生长的百日咳鲍特菌或副百日咳鲍特菌为细小、圆形、光滑、凸起、白色、不透明的菌落，如同水银微沫（培养 3 天后菌落直径约 1mm）副百日咳长得较快，呈灰白色。在 BG 平板上鲍特菌的所有种属均溶血，与百日咳鲍特菌相反，副百日咳由于产酪氨酸酶所以在 BG 平板呈褐色，3 到 7 天表现的这种菌落称为 I 相菌落，但是依据生长条件的不同，菌落形态也可变化，呈 II 相 III 相和 IV 相菌落。中间相（II 或 III 相）菌落除了不溶血之外，其他菌落特征与 I 相菌落一致。IV 相菌落表现的更大（三天培养后直径约 2mm），不溶血，白色扁平菌落。平板应在第三天和第七天进行检查，如果第三天发现疑似菌落应重新分离到新鲜 RL 或 BG培养基上，7 天后,平板可废弃。菌落的镜检 当发现典型菌落后应进行革兰染色（附件 5），百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌为小的非运动性革兰阴性球杆菌。3.1.3 百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌的鉴别 对菌落形态符合的菌落可采用以下步骤进行百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌的鉴别 1.对已分离、纯化的菌落进行革兰染色。2.在 BG 或 RL 完成次代培养后，检测其生化反应，如：氧化酶、尿素酶、硝酸盐还原酶以及碳水化合物利用等实验（附件 6）。3.使用抗百日咳和抗副百日咳的免疫荧光抗血清进行确证鉴定（附件 7），此步骤可使用种特异抗血清检测鲍特菌特异的表面抗原。4.百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌的主要特征见表 1 3.1.4 百日咳鲍特菌的血清分型 可采用单克隆抗体对菌株菌毛为 Fim2 和 Fim3 型进行分型（附件 8），不可分型的分离菌株可送至国际参比实验室 3.1.5 百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌的存储 百日咳鲍特菌分离株可冻存在 BSA/谷氨酸盐溶液（附件 9），这些分离株可存储至少 2 年（-40C）或 4 年(-80C)。3.2 PCR 检测 PCR 是近年来用于在疫苗试验或流行病学调查方面检测百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌的直接方法。目的天 NA 片段包括：插入序列 IS481（用于百日咳鲍特菌的检测）或 IS1001（用于副百日咳鲍特菌的检测），近来研究显示，基于 IS 的检测百日咳鲍特菌的 PCR 与霍氏鲍特菌有交叉。虽然曾有芬兰和荷兰的患者调查显示，霍氏鲍特菌不是百日咳样综合征的病原体，因此在实际工作中不会出现 IS481 和 IS1001PCR 检测工作的混淆，但是，很多使用该序列的实验室结果显示 PCR 非常敏感。至于霍氏鲍特菌感染人类及携带情况的关联仍有待讨论。近十年的世界范围内临床验证显示，对于婴幼儿或年纪较小的儿童而言，鼻咽抽吸物和鼻咽拭子是 PCR 的最佳样品，甚至可以直接进行 PCR 不需进行天 NA 提取。对于成人而言，因为粘液不足，需要进行天 NA 提取（如果鼻咽抽吸物或鼻咽拭子不宜获取也可采用痰液）。PCR 虽然昂贵但是与培养相比更快速，更敏感，所以 PCR 可以作为百日咳快速诊断的选择之一，但是相关试剂必须采用推荐的代理商(Riffelmann et al 2005 J.Clin Microbiol 43(10):4925-4929).(附件 10、附件 11)。4.间接诊断 4.1 凝集试验 尽管已有商品化的试剂，通过检测凝集素诊断并不敏感。4.2 抗毒素和粘附素检测 流行病学研究或疫苗试验常采用 PT 抗体、FHA 抗体和 PRN 抗体的 ELISA 检测技术。参考血清和抗原可从巴斯德实验室之类的质控实验室获得。（附件 13）附件 1:鼻咽抽吸物的采集 A.1.1 材料 每个受检者均需独立包括以下材料：一次性手套 可控吸引管 100mL 塑料无菌螺盖管 5cc 无菌塑料吸管 存放设备的自封口塑料袋 外科口罩 毛巾料 每一次出诊要准备：处理手套用的自封口塑料袋 A.1.2 试剂 PBS(磷酸盐缓冲液)pH=7.4。A.1.3 鼻咽抽吸物采集 获取标本所有操作均应尽量避免污染管道或容器等。感染患者的咳嗽也可能对设备造成污染，所以在完成鼻咽抽吸物采集前，协助人员应避免直接接触受试者及其家庭成员，以减少由衣物造成的污染。PCR 可以检测出很微量的死菌，因此只有当受试者被安置好并做好插管准备后才能将设备从无菌的自封袋中取出。选择一个较少被家庭使用的区域进行鼻咽抽吸物（NPA）采集，比如家庭娱乐室或厨房的污染就可能高于其他的房间；采集设备下放置洁净纸巾；受检者为儿童时应由家长抱住，家长应带口罩；当受检者就位，准备进行 NPA 采样，带上手套，将设备移出口袋放置在干净纸巾上，拧松塑料管螺盖，但是向管中插入导管前不要打开螺盖；启用注射器，去除塑料头；固定注射器，连接到导管一端，检验灌注；去除导管包装；轻轻缓慢的插入导管至鼻孔，如果需要前进至前鼻孔后部可轻轻转动导管，直至插入至鼻咽部（约鼻后 10cm），如果出现呕吐感则显示导管插入过深；一旦到达位置，边利用注射器抽吸边退出导管；一旦导管退出鼻腔，不可再碰触导管头，打开螺盖将导管置入其中，保持导管与注射器的连接，之后拧紧管口，这样有助于防止管中样品被污染；对螺口管进行标记并放置妥当，将导管和注射器置入塑料袋并封口，脱手套后置入塑料袋中以备处理；对每个家族成员均重复如上操作；运输 NPA 样品；注意：NPA 样品容易脱水，而百日咳鲍特菌无法在干燥环境存活。因此，如果样品需用于培养，应在离开受检者房间后尽快用含 1%水解酪蛋白氨基酸的 PBS 对样品进行冲洗。以上操作应在生物安全柜内完成，如果没有生物安全柜应注意该操作应在没有百日咳鲍特菌污染的柜台或桌面进行。应尽最大可能避免被别人所携带的百日咳鲍特菌（活的或死的）对 NPA设备或样品造成污染。因此对样品的操作禁止在受检者家中或正在进行百日咳相关检测的实验室进行。附件 2 R-L 培养基 A.2.1 材料 9cm 培养皿 4 mL 玻璃瓶 巴斯德吸管 移液管 1、2、5、10ml 塑料移液管 培养基分配器 螺旋瓶盖 超净台 A.2.2 试剂 RL 培养基：炭琼脂培养基：称取 51g OXOI 天 charcoal me 天 ium；溶入 1L 蒸馏水中；使用培养基分配器或常规分装 15.3 mL 已溶解培养基到干净玻璃管中；已单独封口的螺口盖封口；120 20min 高压灭菌；4存储，最长时间 4 周。头孢氨苄的准备：用 2mL 灭菌双蒸水溶解药品 20mg（一瓶）；再用 48mL 灭菌双蒸水稀释上述药物溶液；分装药物溶液（终浓度 0.4mg/mL），用 1.5mL EP 管分装，每管 850uL；记录制备时间及有效期；-20存储，最长可存 6 个月；羊血或马血 每块培养基 1.7mL 血。参考菌株：Bor天etella pertussis Tohama I(CIP 8132 可从巴斯德实验室购买)用于培养的实验质控及孵化条件测试；A.2.3 R-L 琼脂平板的制备：培养基平板应于洁净环境的超净台或生物安全柜内制备；将含有 R-L 培养基的管子置于 52C 水浴，溶解培养基；培养皿应于无菌条件开封，置于超净台或生物安全柜中；从 52C 水浴锅中取 5 个管，洗净管壁后置于超净台试管架或燃烧的本生灯附近；吸取 8.5mL 血液（5 管总量），分装每管 1.7mL，封紧管口，轻柔颠倒混匀 3 次；将总量 17mL(15.3 ml+1.7 ml)培养基倒入培养皿，缓慢摇匀使其分布均匀；培养基凝固后将其从超净台或生物安全柜中移出，做好批次标志（以防部分血液存在污染），室温过夜；进行无菌性验证和生长验证，将接种和不接种参考菌株的培养基置于同一条件培养数日，无菌性验证应无菌落生长，生长验证应在三天后可肉眼观察到菌落生长；R-L 培养基转运管的制备 准备相应数量的转运管；在超净台旋开螺盖 每管 1.5mL 混合物（血-炭琼脂培养基混合物）含头孢氨苄的 R-L 培养基平板的制备 融化适量的头孢氨苄储备液（4mg/mL）每管加入 2.5mL 血后加入 170uL 头孢氨苄储备液，使其每管 40ug 记录制备批次，并在制备好的平板盖上做好标记 瓶子封口，倾斜放置管子，使其凝固，管子头可以放置在培养皿上，高度约 1cm 制备好的平板用塑料袋包装，存储于 4 制备好的平板和管子可以在 4存储 2 周，之后应丢弃。附件 3 Bor 天 et Gengou 培养基（包金氏培养基）A.3.1 材料和设备 9cm 培养皿 4 mL 玻璃瓶 巴斯德吸管 自动移液器（200uL 和 1000uL）或常规移液器 1、2、5、10ml 塑料移液管 200uL 和 1000uL 枪头 培养基分配器 螺旋瓶盖 超净台 A.3.2 试剂 B-G 培养基准备：Bor天et Gengou agar me天ium(天IFCO)ref.248200:(Beckton 天ickinson Biosciences,2350 Qume 天rive,San Jose,CA 95131-1807,USA;Tel:[phone];Fax:[phone]).存储条件：4存储，最长时间4周 称取30g Bor天et Gengou agar me天ium，溶解于含10mL 甘油的1L蒸馏水中煮沸 用5N NaoH 调节 PH 到 7.4。记录制备批号 每管分装 15.3mL 培养基 一次性螺盖塞封闭 121 20min 灭菌 冷却后 4存储 可存储 12 周 头孢氨苄的准备：用 2mL 灭菌双蒸水溶解药品 20mg（一瓶）；再用 48mL 灭菌双蒸水稀释上述药物溶液；分装药物溶液（终浓度 0.4mg/mL），用 1.5mL EP 管分装，每管 850uL；记录制备时间及有效期；-20存储，最长 6 个月；参考菌株：Bor天etella pertussis Tohama I(CIP 81.32 可从巴斯德实验室购买)用于生长实验质控及孵化条件测试；A.3.3 B-G 培养基制备 培养皿置于超净台或生物安全柜；将装有 B-G 培养基的管子置于 52水浴锅，使培养基完全溶解；培养皿应于无菌条件中开封，置于超净台或生物安全柜中，5 个一组；5 个平皿应同时在超净台中准备或置于燃烧的本生灯附近；从 52C 水浴锅中取 5 个管，洗净管壁后置于超净台试管架或燃烧的本生灯附近；吸取 8.5mL 血液（5 管总量），分装每管 1.7mL，封紧管口，轻柔颠倒混匀 3 次；将总量 17mL(15.3+1.7 ml)培养基倒入培养皿，缓慢摇匀使其分布均匀；培养基凝固后将其从超净台或生物安全柜中移出，做好批次标志（以防部分血液存在污染），室温过夜；进行无菌实验和生长实验，将接种和不接种参考菌株的培养基置于同一条件培养数日，没接种的培养基应无菌落生长，接种过的培养基应在三天后可肉眼观察到菌落生长；含头孢氨苄的 R-L 培养基平板的制备 融化适量的头孢氨苄储备液（4mg/mL）每管加入 2.5mL 血后加入 170uL 头孢氨苄储备液，使每管 40ug 记录制备批次，并在制备好的平板盖上做好标记 制备好的平板用塑料袋包装，存储于 4 制备好的平板和管子可以在 4存储 2 周，之后应丢弃。附件 4：Stainer Scholte me 天 ium SS 培养基 A.4.1 材料 各种玻璃容器 天平 磁力搅拌器及磁力棒 pH 计或量程在 7-8 的 pH 试纸 高压锅 塑料瓶和塑料管 150mL 无菌瓶 0.22um Millipore 滤器 注意：使用无菌操作 培养基用双蒸水配制 物质均应使用天平精确称量 pH 计应校准并使用探头测定温度；A.4.2 试剂 溶液 1%新鲜配制氯化钙溶液：氯化钙 250mg H2O 至 25mL 10浓缩液 试剂 谷氨酸钠 214 g L-脯氨酸 4.8 g 氯化钠 50 g 磷酸二氢钾 10 g 氯化钾 4 g 氯化镁 2 g Tris base(C4H11NO3)30.05 g Rf:T1503;Purity 99.9%;Sigma 1%氯化钙溶液 40 ml 蒸馏水 1000 ml HCl 调整pH值 pH 7.6 蒸馏水定容至 2000 ml 分装为 200mL，-20储存 方案：1L 烧瓶置于磁力搅拌器；烧瓶内放置干净磁力棒；倒入 700mL 纯净蒸馏水；调整磁力搅拌器功率，使溶液均匀平稳混匀；按需求称取各化学品，配制培养基；按顺序缓慢地加入各化学品，使其充分溶解，防止块状形成；加入 20mL 1%氯化钙；用浓盐酸调整 pH 值至 7.6 移出磁力棒后，精确定容终体积为 1L；封口后颠倒混匀；按工作需要将混匀后培基分装为 20mL 或 200mL；按生产日期，有效期及产品名称对分装的瓶子进行标记；-20储存 完善培基制备记录；-20可保存六个月；10添加剂 大烧杯中溶解：L-胱氨酸 8g 浓盐酸 20mL 120mL 溶液中含：FeSO4.7H2O 2g 抗坏血酸 4g 烟酸 0.8g 定容至 200mL 按 5mL 分装-20储存 1SS 培养基 确认瓶子在冻存过程中没有损坏；用 37水浴锅将 10浓缩液溶解；将所用容器均进行双蒸水冲洗；准备 2L 烧瓶；冲洗后装入 1800mL 无菌双蒸水；加入 200mL 溶解的 10浓缩液；封口后颠倒数次混匀 200mL 分装入锥形瓶；120 20min 灭菌 1SS 培养基添加剂的添加：1添加剂配制：谷胱甘肽 100mg 10添加剂 1mL 无菌双蒸水定容至 10mL 每 200mL1SS 培养基加入 1SS 培养基添加剂 2mL，添加后请立刻使用。附件 5 革兰染色 A.5.1 材料 染色桶 分离用的镊子 载玻片 A.5.2 试剂 龙胆紫溶液（试剂）*龙胆紫 1g*结晶苯酚 2g*浓度为 95 的乙醇 10ml H2O 定容至 100ml 复方碘溶液*碘 1g*碘化钾 2g H2O 定容至 200ml 品红溶液*品红基础粉 1g*结晶芬酸 5g*浓度为 95 的乙醇 10ml*H2O 定容至 100ml A.5.3 方案 利用 BGS 或 RL 培养基分离后的菌悬液来染色 方法*用无水乙醇洗脱玻片上可能存在的油脂*晾干*记录待检菌株的编号*用接种环将准备好的菌液粘匀到玻片上*在本生灯附近待菌液变干*在酒精灯上快速通过几次，以固定菌，也可用甲醇（95%-100%）固定，晾凉*滴上龙胆紫溶液，覆盖 10s*迅速利用流动水冲洗*滴上碘液溶液处理 15s*迅速利用流动水冲洗*用乙醇漂白直到肉眼看不到洗脱液有色*迅速利用流动水冲洗*用番红液复染 30s*用水洗净并用虑纸吸干 A.5.4 结果 显微镜观察：用 100 倍的油镜看：若显色为紫色则为革兰阳性菌，红色、粉色为革兰阴性菌 做好结果记录 百日咳鲍特菌应该为革兰阴性菌 附件 6 氧化酶实验，硝酸盐-还原酶试验，尿素酶试验，碳水化合物利用试验 A.6.1 材料*5ml 塑料吸管*细菌孵化器 A.6.2 试剂*盐水：用双蒸水配制 9gNACL/L*API 20 E 试剂包(ref 09567B Biomerieux SA,69280 Marcy lEtoile,France)*色氨酸脱氨酶（T 天 A）三氯化铁 3.4g H2O 定容至 100ml*吲哚（IN 天）对二甲氨基苯甲醛 5g 异戊醇 75ml 37%盐酸 25ml*Voges Proskauer 1(VP1)氢氧化钾 6g H2O 定容至 100ml*Voges Proskauer 2(VP2)阿耳法萘酚 40g 乙醇 100ml*硝酸盐(NIT1)磺胺吡啶酸 0.8g 5N 乙酸 100ml*硝酸盐 2(NIT2)N-N-二甲基-1-萘胺 0.6g 5N 乙酸 100ml A.6.3 方案 菌悬液制备*确认 B-G 培养基上的菌是溶血的*挑菌于 4.5 ml 无菌盐水中混匀，最后菌悬液 OD 应该为 1.0 API 20 E 接种 微型管的管子应该带一个杯状凹 未标记的微型管应该