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沉淀与结晶
沉淀 — 初分离过程 结晶 — 一般为分离的后续步骤，属于成品化过程
共同点：沉淀和结晶在本质上同属于新相析出的过程，主要是物理变化 。
区 别：形态的不同。同类分子或离子以有规则排列形式而析出称结晶，同类分子或离子以无规则的紊乱排列形式而析出称为沉淀。
沉淀法分离目标产物的范围和方法：
l 蛋白质（酶） ：中性盐盐析法、等电点法、有机溶剂沉淀法、金属离子沉淀法。
◎盐析法：盐析法又称中性盐沉淀法，在发酵液中加入中性盐能破坏蛋白质或酶的胶体性质，消除微粒上的电荷，促使蛋白质或酶沉淀，一般应用于蛋白质分离和酶制剂工业的发酵液提取。
原 理:

蛋白质或酶的沉淀是由于盐类的加入使其溶解度变化所致，在浓盐溶液中蛋白质的溶解度(s)和溶液离子强度（r/2）呈下列关系： lgs＝b一 K(r／2)
其中 b——假定离子强度等于零时，溶解度s的对数； K——盐析常数； r/2——离子强度，
溶液离子强度 ci —溶液中各种离子的摩尔浓度；Zi —各种离子所带的电荷数。
因此用盐析法分离蛋白质时可以有两种步骤：
1在一定的pH及温度条件，改变盐的浓度(即离子强度)达到沉淀的目的，称为“K”分级盐析法。
2．在一定的离子强度下，改变溶液的pH及温度，达到沉淀的目的，称为“b”分级盐析法。一般粗提蛋白质时常用第l法，进一步分离、纯化时常应用第2法。
◎盐析的影响因素
A 盐析剂的种类
不同的盐其盐析效果各不相同。一般来说，含有多价阴离子的中性盐的盐析效果较好。
生产上最多用的盐析剂是硫酸铵，这是因为它在较低温度时，溶解度也相当高，例在20℃时其溶解度为75.4％，而Na2SO4为18.9％，NaH2PO4为7.8％都很小，在常温下(NH4)2SO4的饱和溶液便足以使大多数的酶沉淀，且无破坏作用，(NH4)2SO4的另一优点是压滤出来的废液可直接作农肥用，这样可以回收约一半的费用，并且没有废液的污染。
B 盐析剂的用量
盐析剂的用量与所沉淀的酶的种类和酶液中杂质的性质、数量有关，应以收率最高的用量为标准。具体用量需通过对比试验和生产实践摸索才能确定。
C 盐析的温度
盐析时温度的选择要以不降低酶的活力为原则，应在其保持稳定的温度范围内进行盐析，但也需适当地顾及盐析效果，可以根据实验结果决定，一般规律是温度愈低沉淀的形成愈不容易，但也有相反的情况。实际上可供选择的范围较大，所以多数是在常温下进行盐析。
D 盐析的pH值
盐析的pH选择也要以不降低酶的活力为原则。同样也要通过试验决定，加盐后的酶液形成沉淀的pH值(等电点)与原来酶液相比，改变不大。由于蛋白质在等电点时最易沉淀，故可选择等电点的PH值作为盐析的pH值。但为防止pH值对酶活力的影响，可通过试验选择在酶稳定的pH范围内进行盐析。
E 溶液中杂质的影响
酶液中杂质的组成以及这些成分对盐析效果的影响是极为复杂的，尤其是溶液中所含的各种蛋白质和其它酶对需要提取的酶会相互作用。盐析条件的选择应以最大可能沉淀出需要的酶为原则，要通过试验具体选择。此外，特别重要的是重金属离子的影响，重金属的存在会导致酶的大量损失。例如，所用器具产生铜锈可使酶活力大幅度降低，根据试验，十万分之一的硫酸铜会使脂肪酶的活力损失90％左右。
◎有机溶剂沉淀法
原理：有机溶剂可能破坏蛋白质或酶的某种键如氢键，使其空间结构发生某种程度的变形，致使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏 水层，从而使蛋白质或酶沉淀，当蛋白质或酶的空间结构发生变形超过一定程度就会导致完全的变性。
有机溶剂沉淀法的优点：某些蛋白质沉淀的浓度范围相当广，所得产品的纯度较高，从沉淀的蛋白质或酶中除去有机溶剂是很方便的，而且有机溶剂本身可部分地作为它们的杀菌剂，因而使有机溶剂法有可能用于大规模的蛋白质分级过程中。
缺点：需要耗用大量的溶剂，溶剂的来源，贮存都比较困难或麻烦，并且提炼操作需在低温下进行，使用上有一定的局限性，收率也比盐析法低。
影响有机沉淀的因素：
1、有机溶剂的种类： 丙酮为最佳，乙醇次之，甲醇更次，乙醇是最常用的沉淀剂，在沉淀过程中乙醇与水混合时放出大量的稀释热，使溶液的温度显著升高。一般温度越低沉淀越完全，所以沉淀过程必须注意冷却降温。使沉淀在较低的温度下进行。
2、稳定剂的加入：在沉淀过程中，加入一些对酶有保护作用的盐类，对减少酶活的损失，提高收率十分有利，并且还可以使沉淀物凝聚而易于过滤。
◎非离子型聚合物沉淀法
非离子型聚合物：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和葡聚糖等高聚物，最常用的是PEG-4000和PEG6000。
原理：PEG沉淀作用的机理主要是基于体积的不相容性，即PEG分子从溶剂中空间排斥蛋白质，优先水合作用的程度取决于所以PEG的分子大小和浓度，对蛋白质的排斥作用导致蛋白质浓度增加，水合作用降低，相互作用增强，进而产生沉淀。
非离子型聚合物沉淀蛋白质的计算公式与盐析法相似： lgS = b - Kc
此方法的优点：（1）：室温（2）：沉淀颗粒大，易收集（3）：可提高蛋白质的稳定性
缺点：PEG从蛋白质中去除困难，需要用超滤、液液萃取等方法
◎聚电解质沉淀法
聚电解质：含有重复离子化基团的水溶性聚合物。聚丙烯酸、聚乙烯亚胺、羧甲基纤维素和离子型多糖如肝素等。
原理：高分子量聚电解质：聚合物架桥机理 低分子量聚电解质：电荷中和作用机理
◎金属离子沉淀法
原理：某些金属离子能与蛋白质分子中的特殊部位起反 应，造成等电点的转移，从而降低蛋白质的溶解度。
三种类型：（1）能与蛋白质中的羧基、氨基和含氮杂环的化合物结合的金属离子，如Mn2+，Fe2+，CO2+，Cu2+，Zn2+，Cd2+；
（2）能与蛋白质中羧基结合的金属离子 ，如ca2+，Ba2+，Mg2+，Pb2+ ；
（3）能与巯基结合的金属离子，如Ag+, Hg2+ , Pb2+
上述诸金属离子中用得较多的是Zn2+，Ca2+，Mg2+及Ba2+的硫酸盐。Mn2+对沉淀核酸特别有效，金属离子与蛋白质、核酸、有机酸、多肽等结合后常形成不溶性基质，它们有些是不可逆反应，特别是巯基。使用时还应注意金属离子加入后引起的pH变化不应与蛋白质的等电点相差过大。

◎结 晶
晶体：分子、原子或离子的有规则地排列方式具有一定的熔化温度(熔点)和固定的几何形状，在物理性质方面又往往具有各向异性的现象。抗生素、氨基酸等可以得到一定晶形的产品。
沉淀：分子、原子或离子的无规则地排列，蛋白质多为无定形物质。
当有效成分从液相中变成固相析出时，如若条件控制不同，可以得到不同形状的晶体，也可能是无定形物质。
◎等电点沉淀或结晶法
等电点法主要用于一些两性电解质的产物中，例如抗菌素(四环素)、氨基酸(谷氨酸)以及水化程度不大或憎水性的蛋白质例如酪蛋白等，下面我们以谷氨酸为例来讨论等电点法的具体应用。
谷氨酸沉淀或结晶的原理:
:

谷氨酸在等电点时，绝大部分以偶极离子(GA±)状态存在，分子内部正负电荷相等，并含有等量的带不同电荷的阳离子(GA+)和阴离子(GA—)，因此，溶液的总静电荷等于零。谷氨酸分子之间由于相互碰撞，并通过静电引力的作用结合成较大的聚合体而沉淀。
工业生产中等电点法提取谷氨酸，就是利用这一特征。
在30℃时不同pH值下谷氨酸的溶解度
pH值
0．9
1．4
2．0
2．4
2．8
3．2
谷氨酸溶解度，g／100mL
13.12
4.75
2.11
1.27
1.08
1.06
◎谷氨酸结晶的性质
A 谷氨酸结晶
a—型结晶：是大型结晶，在纯谷氨酸溶液中为斜方六面晶体(观察等电析出的晶体为四面晶体)。纯度高、颗粒大、质量重、易沉降、与母液分离容易，是一种理想的结晶；
b—型结晶：晶粒细、纯度低、质量轻、难沉降、不易沉淀析出。
因此在生产中要控制结晶条件，以析出a—型结晶，如出现b-型结晶则沉淀物细、结晶不易沉降、分离困难、收率大减。
B 影响结晶的条件
1．发酵液中谷氨酸浓度对晶型的影响。
谷氨酸浓度%
b—型结晶含量%
含水分 (%)
纯度，
(%)
谷氨酸浓度，%
b—型结晶含量， %
含水分(%)
纯度，
(%)
8
20
13．3
96．6
15
100
37．3
90．0
10．2
58
25．5
95．2
20．3
100
43．2
85．3
2．结晶析出温度对晶型的影响
析出温度 (℃)
a、b-型的比例
含水分 (％)
纯度(％)

析出温度 (℃)
a、b型的比例
含水分(％)
纯度(％)

10
全部a—型
19.80

95

40
a、b-型各半
a、b-型各半
30.8
92.3
20
全部a—型
15.03

94.8

50
主要b--型
主要b--型
38.0
90.8
30
多数a--型，少量b-型
18.32

95.5

60
全部b—型
全部b—型
37.2
90.7

3．残糖对晶型的影响
葡萄糖含量，(％)
晶 型
1
a-型及b-型
2
b—型
5
b—型
4．其他氨基酸对晶型的影响
对照物

加入的氨基酸种类

添加氨基酸后b—型 晶体的含量
对照物

加入的氨基酸种类

添加氨基酸后b—型 晶体的含量
100％b-型
L—天冬氨酸
52％
100％b-型
L—亮氨酸
48％
100％b-型
L—苯丙氨酸
43％
100％b-型
L—胱氨酸
54％
100％b-型
L—酪氨酸
28％

◎结晶的基本原理：
将一个被溶解物放入一个溶剂中，由于分子的热运动，必然发生两个过程：
(1)固体的溶解，即被溶解物质(溶质)分子扩散进入液体内部。
(2)物质的沉积，即溶质分子由液体中扩散到固体表面进行沉积，一定时间后，这两种分子扩散过程达到动态平衡。我们将能够与固相处于平衡的溶液称为该固体的饱和溶液。

图中两条曲线将温度—浓度图分成三个区域：
(1)稳定区：其浓度等于或低于平衡浓度，在这里不可能发生结晶。
(2)介稳区：又可细分为两个区：第一个分区称为亚稳区，位于平衡浓度与低于它就基本上不可能发生均相成核的浓度之间；第二个分区称为过渡区，与这个区相对应的浓度则是有能自发成核的浓度，但不马上发生，而是要经过某一时间间隔才发生，总的来说，在介稳区，结晶不能自动进行，但如加入晶体，则能诱导结晶进行。这时，主要是二次成核。这种加入的晶体称为晶种。
(3)不稳定区：溶液处于不稳定态，特点是结晶马上开始，均相成核，出现连生体和树枝状的结晶。与这一状态相应的浓度是超过过饱和曲线的浓度。
◎结晶过程的步骤：
结晶是从均一的溶液中析出固相晶体的一个操作，常包括为三个步骤：形成过饱和溶液；形成晶核和晶体生长。
1、过饱和溶液的形成
结晶的首要条件是过饱和，制备过饱和溶液的方法一般有四种：
(1)化学反应结晶：调节pH值或加入反应剂，使生成新的物质，其浓度超过它的溶解度。例如在红霉素醋酸丁酯提取液中加入硫氰酸盐溶液并调节溶液的pH值为5左右，生成红霉素硫氰酸盐析出。
(2)将部分溶媒蒸发：例如真空浓缩赤霉素的醋酸乙酯萃取液，除去醋酸乙酯后，即成结晶析出。
(3)将热饱和溶液冷却：例如冷却已有少量结晶析出的红霉素丙酮浓缩液至4℃左右，放置4个小时，红霉素结晶就能大量析出，
(4)盐析结晶：在溶液中，添加另一种物质使原溶质的溶解度降低，形成过饱和溶液而析出结晶。加入的物质可以是能与原溶媒互溶的另一种溶媒或另一种溶质。例如利用卡那霉素易溶于水而不溶于乙醇的性质、在卡那霉素脱色液中加入95％乙醇，加入量为脱色液的60％一80％，搅拌6小时，卡那霉素硫酸盐即成结晶析出。
2、晶体的生成
在溶液中分子的能量或速度具有统计分布的性质，在过饱和溶液中也是如此。当能量在某一瞬间，某一区域由于布朗运动暂时达到较高值时会析出微小颗粒即结晶的中心称为晶核，晶核不断生成并继续成长为晶体。一般地说，自动成核的机会较少，常需借外来因素促进生成晶核，如机械震动，搅拌等。
3 晶体的成长
晶核一经形成，立即开始长成晶体，与此同时，新的晶核还在不断生成。所得晶体的大小，决定于晶核生成速度和晶体成长速度的对比关系。如果晶体生长速度大大超过晶核生成速度，过饱和度主要用来使晶体成长，则可得到粗大而有规则的晶体，反之，过饱和度主要用来生成新的晶核，则所得晶体颗粒参差不齐，晶体细小，甚至呈无定形。
有机化合物的晶体生长是依靠了构成单位之间相互作用力来实现的，在离子晶体中，构成单位靠静电引力结合在一起，在分子晶体中，靠氢键结合在一起，如果分子带有偶极矩，那末它也靠静电力结合。
若要获得比较粗大和均匀的晶体，一般温度不宜太低，搅拌不宜太快，并要控制好晶核生成速度大大小于晶体成长速度，最好在较低的饱和度下即将溶液控制在介稳区内结晶，那么在较长的时间里可以只有一定量的晶核生成，而使原有的晶核不断成长为晶体。
加入晶种，能控制晶体的形状、大小和均匀度，但首要的晶种自身应有一定的形状、大小和比较均匀，不仅如此，加入晶种还可使晶核的生成提前，也就是说所需的过饱和度可以比不加晶种时低很多。所以，在工业生产中如遇结晶液浓度太低而结晶发生困难时，可适当加入些晶种，能使结晶顺利进行。
重结晶

◎成品干燥
升华干燥：升华干燥法(也称冷冻干燥)的原理是湿物料从冻结状态下除去水分，并且是其中水分不经过液态直接升华成气态而脱水的干燥过程。
与其它方法相比，升华干燥法具有被干燥材料的结构变化最小以及干燥温度较低等特点。因此升华干燥可用于特别热不稳定的产品上，例如活的微生物体、酶、某些抗生素等等。

（上右二图）细胞死亡可能是在升华干燥过程中过分脱水(或在升华以后的最后干燥造成的）。为了保
护细胞，使其在冷冻和以后的干燥中不致死亡采用了特殊的保护介质，包括甘油、蔗糖、乳糖、聚乙烯吡咯烷酮和其他物质，阻滞胞内生成冰，减少电解质浓缩，并从深度不可逆的脱水作用下来保护细胞。

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