显微镜的使用与维护_百替生物.pdf

实验一、显微镜的使用与维护 一、显微镜的组成(仿Olympus)1.机械部分 镜头转换器；粗、细准焦螺旋；载物台；刻度尺；镜臂；镜座 2.光学部分 (1)放大系统 物镜(三个)；目镜；镜筒 放大倍数=目镜倍数物镜倍数 (2)集光系统 光栅；聚光镜；反光镜；开关 二、使用 1.开关：动作要轻、慢，不使用时要及时关闭。2.调焦距：先用粗准焦螺旋，再用细准焦螺旋。3.安指针：加拿大树胶、头发 4.观察：低倍镜 高倍镜 三、维护工作 1.擦镜头时，用双层镜头纸对折，从中间向周围擦，不能用滤纸或其它 物品代替镜头纸。每次实验完毕，镜身要用纱布擦干净。清洗液(1)乙醚：无水乙醇=85:15(冬春季)或80:20(夏秋季)(2)二甲苯 2.载物台上的载玻片和盖玻片要清洁，切勿污染物镜或其它部件。3.显微镜不可上锁，如不小心会损伤粗、细准焦螺旋。4.由低倍向高倍转换时，可稍微下降载物台，以免损伤显微镜。5.存放时，将载物台降到最低点，并把镜头移开。所需材料及药品 接线板、乙醚:无水乙醇=80:20、牙签、加拿大树胶、镜头纸 第一大实验 细胞学实验 实验一、细胞固定、染色原理与方法 一、固定与固定液 (一一)固定固定：将新鲜的活组织从生物体取下后，立即投入固定剂中，借助化学药品的作用，使细胞保持原有形态、结构的一种手段。 1.目的 (1)迅速防止细胞死亡后的变化,防止自溶、腐败，尽量保持生长状态结构。(2)使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前的形态。(3)使组织内各种物质成分产生不同的折光率，便于观察和鉴定。(4)使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。(5)防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。2.时期 (1)有丝分裂：有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织，根尖取材容易，操作和鉴定方便。(2)减数分裂：选取适当大小的花蕾是观察花粉母细胞减数分裂的关键性的第一步。此时的植株形态及花蕾大小依植物的类别及品种有所不同。小麦小麦：在植株开始挑旗，旗叶与下一叶的叶耳间距为3-4cm，花药长度大致在1-2mm左右，黄绿色时取材最好。如花药为绿色时则为时过早，花药为黄色，则已过时。一般上午8-10点为取材最佳时间。玉米玉米：一般夏玉米在7月份取材，以上午7-8点为好。在玉米雌穗未抽出前的7-10天手摸植株上部(喇叭口下部)有松软感觉，表明雄花序即将抽出。用刀在顶叶近喇叭口处纵向划一刀，切口长10-15cm，剥出雄花序，顶端花药长3-5mm，花药尚未变黄时取材。蚕豆蚕豆：从现蕾开始，上午10-11点可选取2-3mm大小的花蕾或一小段花序。蚕豆开花的次序是由下而上，由外而内。3.固定时的注意事项 (1)固定液量：20倍于材料的体积，以免固定液被稀释。(2)选择合适的固定液：渗透力强的固定液既可以迅速进入组织中，又不使组织过度收缩或膨胀。(3)固定的时间要合适：与材料的大小和温度有关：材料大则时间长，材料小则时间短；温度高则时间短，温度低则时间长。经固定的材料如不及时使用，可以经过90%酒精换到70%酒精中各半小时，再换入一次70%酒精，在0-4冰箱内可保存半年。经过较长时间保存的材料进行观察前可以换新的固定液再处理一次，效果较好。(二二)固定液固定液 固定液包括简单固定液和混合固定液两种。简单固定液就是用一种药品作为固定液，如乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞等。简单固定液只对细胞的某种成分固定效果较好，而不能将所有的成分都保存下来。混合固定液是指两种或两种以上的化学物质的混合液，如卡诺氏固定液等。1.固定液的条件 (1)迅速渗入组织,杀死原生质。在杀死的短时期中,细胞形态不致有所变化。(2)必须具有渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定。(3)尽可能避免使组织膨胀或收缩。(4)使细胞内的成分凝固或沉淀。(5)增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别。(6)增加媒染作用和染色能力。(7)使组织变硬，具有一定的硬度。(8)固定以后能起到保存的作用。 (9)在凝固原生质以后，增加细胞对于各种穿透的抵抗力，不致于因以后的处理而使固定的原生质变形。2.常用的几种固定液 (1)酒精：有固定、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白，但对核蛋白固定效果较差(亲和力小且易自溶)。酒精固定的特点是杀死快，渗透力强，对组织收缩较大(可收缩20%左右)，可使材料变硬。酒精常用于混合固定液中，但由于它本身是一种还原剂，很容易氧化成乙醛，甚至氧化成醋酸，因此最好不与三氧化铬、重铬酸钾及锇酸等氧化剂配合使用。但与甲醛、醋酸或丙酸配合，用作固定效果很好。酒精能溶解脂肪及凝脂，故不宜用来固定脂类材料。(2)甲醛水溶液：甲醛在水中的溶解度为37-40%，渗透力强，固定均匀，对组织收缩作用小，一般用于固定大材料。市售溶液中含量下降，因形成三聚甲醛而失效。(3)冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶，所以又称为冰醋酸。常用0.3-0.5%的浓度作为固定液。冰醋酸对材料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精、氯仿混合。(4)AF液：90ml乙醇+10ml甲醛 用于固定大块组织。(5)卡诺氏固定液：冰醋酸:氯仿:无水乙醇=1:3:6 改良卡诺氏固定液:冰醋酸:无水乙醇=1:3 二、染色与染色原理 根据染料的来源不同可分为天然染料(苏木精、洋红等)和人工合成染料（煤焦油染料，如碱性品红等）。1.苯与苯的取代物 苯 醌(红色)苯酚 三硝基苯 2.染料的分子结构 呈酸或碱性，溶于水，可电离，可与材料结合。助色团：溶于水(-O+H+)，色源(发色团)：不溶于水，不电离，三硝基苯酚(苦味酸)呈酸性，含有酸性助色团，可以提供阴离子，与碱性物质生成盐。色源(红色)，助色团(-NH2+H+OH-NH3+OH)，三氨基三苯基氯化甲烷(碱性品红)，呈碱性，含有碱性助色团，可以提供阳离子，与酸性物质生成盐。3.酸性与碱性染料 (1)酸性染料：具有酸性助色团，可电离出阳离子，染色成盐时起阴离子作用。如-OH -O+H+-COOH-COO+H+PH低时易染色。(2)碱性染料：具有碱性助色团，可电离出阴离子，染色成盐时起阳离子作用。如-NH2 -NH3+OH -NH2+HCl-NH3+Cl PH高时易染色。4.染色原理 (1)化学作用 碱性染料染细胞核；酸性染料染细胞质。(2)物理作用 染料通过毛细作用或渗透作用进入组织内部；组织吸附染料；染料进入细胞，由于吸收作用而留在细胞内部。三、常用染料 1.染细胞核 (1)苏木精 苏木用乙醚连续提取即可得到苏木精。苏木精为黄棕色结晶，溶于酒精、甘油，可氧化生成苏木 红。常用于永久切片的制作，亲水力弱，不可单独使用。(2)卡红(洋红、胭脂红）取自雌胭脂虫，方法是将晒干后的成虫磨碎提炼出胭脂虫红，然后用明矾去杂质。卡红是一种复杂的化合物，起作用的是卡红酸。卡红在中性溶液里溶解度很小，所以要用酸性或碱性溶液溶解。醋酸洋红：45%醋酸100ml与1-2g卡红混合，煮沸，充分溶解，凉后过滤。1-2个月后加媒染剂铁即可使用。主要染细胞核，若时间太长，细胞质也被染红。(3)碱性品红 染细胞核的特异染料。2.染细胞质 伊红Y、刚果红、苦味酸、酸性品红（品红+磺基）四、洋葱根尖有丝分裂的观察 流程流程：固定好的根尖水洗2-3次1N HCl7-8min水洗2-3次取材(1/2分生区)切碎染色6-7min加盖玻片轻敲压片观察。1.材料准备材料准备：将洋葱放在加满水的广口瓶上，使其根茎部接触水面，然后转移到25-28的条件下培养。待根尖长到2cm左右使，在上午9-10点剪取根尖备用。2.预处理：预处理：为了有利于对有丝分裂过程中染色体的观察和计数，在固定前应对根尖进行预处理，这样可以改变细胞质的粘度，破坏和抑制纺锤体的形成，使染色体适度缩短和分散。预处理的方法有低温预处理和药物预处理。(1)低温预处理 将材料浸在蒸馏水中，放在1-4冰箱内离体处理24h。此法效果很好，对染色体无破坏作用，染色体缩短均匀，简便易行，各种作物都适用。(2)药物预处理 0.05-0.2%秋水仙素溶液与室温下处理 2-4h，对抑制纺锤体活动效果明显，易获得较多的中期分裂相，且染色体收缩较直，有利于染色体结构的研究。饱和对二氯苯溶液室温下处理 3-5h，对阻止纺锤体活动和缩短染色体效果也较好，但对染色体小而多的植物来说个利于染色体的计数。0.002-0.00mol/L8-羟基喹啉18条件下处理5-6h，可以引起细胞粘度的改变，导致纺锤体活动受阻，使中期染色体在赤道面上保持相应的排列位置。缢痕区也较为清晰。一般认为对中等或长染色体的植物较合适。70ppm放线菌酮和250ppm8-羟基喹啉的混合液于25条件下，根尖不离体处理5h，可获得大量的分裂相，是最值得首选的预处理方法。3.固定：固定：:预处理后的根尖用蒸馏水冲洗2-3次，然后移入Carnoys 固定液中，室温下固定2-24h 后，用70%酒精冲洗2次转入70%酒精中于4冰箱中保存，最好不要超过2个月。如经过较长时间保存的材料，在使用前可以用固定液在处理一次。4.解离：解离：解离有酸解和酶解两种方法，可以使分生区组织细胞间的果胶质分解，细胞壁软化或部分分解，使细胞和染色体容易压平。酸解一般用1N HCl在60水浴中处理7-8min即可。5.压片和染色压片和染色：取处理好的根尖置于载玻片上，用吸水纸吸去多余的液体，用刀片将根尖的分生组织切下并切碎，加1-2滴改良苯酚品红染液，6-7min后加盖玻片。用铅笔的橡皮头或小镊子的柄端轻敲盖玻片，使材料均匀分散，然后压片。压片时用力要适当，不要移动盖玻片。6.镜检：镜检：低倍镜下找到分生区细胞，其特点为等直径细胞。细胞质浓厚，细胞核较大，占细胞体积的3/4。可以观察到有丝分裂过程中不同分裂时期的染色体。选取不同分裂时期的典型细胞，换高倍镜观察，注意细胞核染色体及纺锤体的变化动态。 注意事项：(1)取材：取分生区，尽量要小；(2)解离要软，水洗要彻底，否则不易着色；(3)压片前先敲，可使细胞分散开；(4)防止出气泡。五、作业：绘制有丝分裂各个时期的分裂相。所需材料及药品 洋葱 改良苯酚品红 1N Hcl(浓HCl82.5ml1000ml)附：改良苯酚（石炭酸）品红染液 （见：遗传学实验-第二版，刘祖洞，江绍慧编。P.209）母液A：取3g碱性品红，溶解在100ml的70洒精（可长期保存）。母液B：取母液A10ml，加入90ml的5苯酚水溶液。苯酚品红：取45ml的母液B，加入6ml冰醋酸和6ml 37甲醛。改良苯酚品红：取2-10ml 苯酚品红染液，加入98-90ml 的45冰醋酸和1.8g山梨醇即可。改良苯酚品红配成后可立即使用，但着色能力较差，一般在配制两周后染色能力显著增加。实验二、孚尔根(Feulgen)核染色法 一、实验目的 学习和掌握对植物组织及细胞中鉴定 DNA 分布的孚尔根反应染色方法，以及对切片或染色体处理的压片方法，为今后的有关实验和科研工作准备条件。二、实验原理 孚尔根染色法是鉴别细胞中 DNA 反应的组织化学方法。细胞内的 DNA(通常位于核及染色体上)在 1N HCl 60水解时部分地破坏了脱氧核糖与嘌呤碱之间的糖苷键而使嘌呤碱脱掉，从而使脱氧核糖的第一个碳原子上潜在的醛基获得了自由状态。而无色的亚硫酸品红是由偏重亚硫酸钠、盐酸和碱性品红配制成的。偏重亚硫酸钠与盐酸能产生亚硫酸根，当具有醌式结构的碱性品红分子与亚硫酸根结合后，醌式结构的共轭双键被打开，碱性品红变为无色。当用这种无色的亚硫酸品红去染经酸解的细胞时，就会与染色体 DNA 上游离的醛基结合，又出现了呈现红色的醌式结构，从而使DNA分子着色。这一反应是1924年由Feulgen 和Rossonbek 所发现和确定的，已广泛用作鉴别 DNA 的一种特异性检查方法。其优点是制片清洁，染色体清晰，组织软化好，易于压片，还可以对染色体 DNA 的含量进行测定。其缺点是，染色体较软，容易缠绕，不易分散，在加强前处理使染色体缩短的情况下，可获得较好的效果。另外，对小型染色体的材料效果较差。这一方法在切片、涂片上研究核及染色体时能减少细胞质着色对观察的影响。因此在细胞学研究中受到了普遍的重视。水解是本实验成败的关键之一。温度应保持在60 0.5之间(用两支温度计相互校正)。如果温度过低或时间过短，酸解不够，醛基暴露不充分，染色会过浅；若温度过高或时间过长，会造成酸解过度，使 DNA 完全解聚，糖与醛基之间的键被破坏，流离的核酸分子会扩散到细胞质中，从而造成染色浅或不均一的现象。水解的时间很重要，因为核酸的水解有两个过程。第一，嘌呤碱很快被除掉，脱氧核糖中潜在的醛基显露出来。第二，组蛋白和核酸越来越多地被除掉。在短时间的水解作用以后，第一个过程占优势，这时候用 Schiff 试剂染色，染色体的染色作用最强。随水解作用的继续进行，第二个过程逐渐变成优势，因此水解液中的 Schiff 反应增强，而染色体中的Schiff反应减弱。最后，第二个过程超过第一个过程时，染色体也随之停止反应。 RNA分子中也有嘌呤碱，那么经酸解后，用Schiff试剂染色时，为什么不能使RNA分子着色呢？这是由于在酸解的情况下，RNA 分子较 DNA 分子稳定，它的醛基难以游离出来。所以，利用孚尔根法染色时，只能使DNA分子着色而不能使RNA分子着色。影响孚尔根反应的主要因素有以下几个方面：(1)水解时间和温度水解时间和温度：这是实验的主要关键。水解适当时，染色体着色较深而细胞质不显颜色，水解不足，染色体着色浅淡，细胞质中可能有其他醛基存在而显示扩散的红色。水解过度，则染色体着色不匀，这是由于DNA解聚而产生的游离核酸分子从染色体扩散到细胞质中，使细胞普遍着色。随着时间的过度，会使水解液中的反应增强，而细胞不能着色。(2)固定液的成分固定液的成分：不同成分的固定液常出现不同的颜色反应。含铬酸的固定液产生红色，酒精-醋酸固定液产生红色、紫红色，只用酒精的呈现紫色，用含甲醛的固定液则呈现强烈的紫红色。当需要对染色体中的DNA 定量测量时，一般只能用不含金属离子和甲醛的固定液，如酒精-醋酸固定液等。(3)SO2含量含量：Schiff试剂中的SO2含量也影响孚尔根反应的颜色表现。SO2含量低时呈红色，含量高时则偏向蓝色。(4)染色质中染色质中 DNA 的含量的含量：供试材料的染色质中DNA 含量的不同是影响显色反应强度的根本因素。不同生物和不同的组织与细胞中 DNA 含量不同，显色强度也各异，并且二者之间是正相关的。由于上述因素和实践了解，具有大、中型染色体的材料，如百合科及部分禾本科植物材料，适于用孚尔根反应，小型染色体的材料特别如玉米、水稻等不适于用孚尔根法染色，它们的染色体用孚尔根法时着色是很浅的。三、实验步骤 1.取经预处理并固定好的洋葱根尖，用水洗2-3分钟，放入室温条件下的1N Hcl处理根尖材料2-3分钟。2.将根尖换入60预热的Hcl，置于恒温水浴中，在60 0.5的条件下水解8-10分钟。3.吸出热Hcl，换入室温1N Hcl再处理1-2分钟，然后水洗2-3次。4.吸净水分，加入Schiff试剂，盖上盖子，在黑暗条件下染色30分钟，也可过夜。5.用水漂洗，去掉细胞中残存的一些有色的品红分子。6.取根尖置载玻片上，用镊子夹碎后，加一滴45%醋酸，然后盖上盖片。压片、观察。四、注意事项 1.Schiff试剂及时取放，及时清洗吸Schiff试剂的吸管。2.黑暗条件下染色。五、作业 1.绘制你所观察到的图象，并说明是有丝分裂的哪一个时期。2.直接固定和经过预处理后固定的洋葱根尖，其分裂相有何不同？所需材料及药品 洋葱根尖 1N HCl 45%醋酸 0.2%秋水仙素 碱性品红 偏重亚硫酸钠 水浴锅(60水浴)100温度计 具塞试管 吸管 滤纸条 霉菌培养箱 附：Schiff试剂的配制方法 Schiff试剂：即脱色亚硫酸品红。溶解1g碱性品红于200ml 煮沸的重蒸馏水中，轻加摇动。继续煮5分钟使 之完全溶解，冷却至50-55时过滤到棕色有塞子的试剂瓶中，加入1N HCl20ml，继续冷却至25，再加入1g偏亚硫酸钾(K2S2O5)或偏亚硫酸钠(Na2S2O3)。摇动使溶解，密闭瓶口置黑暗低温处或冰箱内(4左右)18-24h 后检查。试剂如透明无色或呈淡黄色时即可使用。如有不同程度的红色未褪，可加入0.5-1g活性炭，激烈震荡1分钟，仍在低温下静止1 小时或过夜。然后用粗滤纸迅速过滤后使用。密封瓶口，包以黑纸，在 5以下冰箱内可以保存5-6个月。实验三、玉米花药小孢子形成 一、实验目的 1.掌握制备植物细胞减数分裂玻片标本的技术和方法。2.了解高等植物细胞减数分裂过程，观察染色体的动态变化。二、实验原理 减数分裂是生物在形成性细胞过程中的一种特殊方式的细胞分裂，在此过程中先由有性组织（花药或胚珠）中的某些细胞分化为二倍性的小孢子母细胞或大孢子母细胞，这些细胞连续进行两次细胞分裂即减数第一分裂和减数第二分裂，结果一个小孢子母细胞形成4个小孢子，一个大孢子母细胞形成一个大孢子，它们都只具有单倍的染色体。减数分裂在遗传上有重要意义。性母细胞(2n)经过减数分裂形成染色体数目减半的配子(n)。经过受精作用雌雄配子融合为合子，染色体数目恢复为 2n。这样在物种延续的过程中确保了染色体数目的恒定，从而使物种在遗传上具有相对的稳定性。另外，在减数分裂过程中包含有同源染色体的配对、交换、分离和非同源染色体的自由组合，这些都是遗传学分离、自由组合和连锁互换规律的细胞学基础。在这些基本规律的作用之下，导致了各种遗传重组的发生，而遗传重组又是生物变异的重要源泉。在适当时候采集植物的花蕾制备染色体标本即可在显微镜下观察到植物细胞的减数分裂。三、实验方法和步骤 1.取材和固定：取材和固定：取处于大喇叭口期的玉米穗，摸到无穗苞时，上午8-10点固定(Carnoys固定液)24h。玉米的花有三个花药，而且三个花药是同步发育的。一般取3-4个小花，每花各剥取一个花药(约1.5-2mm)，横切几段。2.染色：染色：用醋酸洋红或改良苯酚品红2滴染色10-15分钟。3.压片镜检：压片镜检：注意：花粉母细胞大而圆，壁薄。花药颜色变黄，则其中均为花粉粒。在小而绿的花药中才有处于减数分裂的细胞。四、作业 绘制你所观察到的减数分裂过程的分裂相。所需材料及药品 固定的玉米雄穗 改良苯酚品红 实验四、小麦与蚕豆的小孢子形成 一、取材 1.小麦(2n=42)：4月底，旗叶高于旁叶2-3 cm。小麦为复穗状花序。成熟的顺序为由中间到两边，成熟时雄配子为三核花粉。2.蚕豆(2n=12)：蚕豆为头状花序，一朵小花有10个花药，有大有小，取其中的一大一小即可。花粉粒为椭圆形，有嵴，多个萌发孔。二、固定 通常取幼小花药压片时，可以直接放在醋酸洋红液中同时进行固定和染色。但是先经过固定的材料，更易于染色和保存。一般材料可用Carnoys固定液固定2-24h，经80%和70%酒精中各半小时，然后保存在70%酒精中，对细胞学观察效果较好。三、染色和压片 根据花药大小横切3-4段(或加以纵切)，加1滴醋酸洋红（或改良苯酚品红）染液。用解剖针轻压花药，使花粉母细胞从切口出来。静置染色5-10分钟。此时，可从不同大小的花中连续取出几个花药进行同样的染色处理，然后依次取载玻片在酒精灯上横过几次轻微加热，注意不可使其沸腾。同时用解剖针轻压并拨动火药以促进着色，进一步去除残存的花药壁，加盖玻片，使染色液刚好布满，在盖玻片与载玻片之间成一薄层(不能过多，以防止花粉母细胞溢出盖玻片的边缘)。在盖玻片上覆以吸水纸，用拇指均匀用力压下，勿使盖玻片移动。四、镜检 小麦：小孢子单核花粉二核花粉三核花粉（成熟的花粉粒）蚕豆：在减数第一分裂完成后不形成细胞板，所以不形成二分孢子。减数第二分裂发生在不同的平面，形成立体锥状排列的四分孢子，外被胼胝体。胼胝体解体后细胞游离出来。在蚕豆的四分孢子立体观中，有时会出现空的细胞（即细胞内无染色体）的现象。五、作业：绘制你观察到的减数分裂过程的分裂相，并标明材料。所需材料及药品 小麦花药 蚕豆花药 改良苯酚品红 实验五、蝗虫精巢减数分裂观察 一、实验目的 了解动物精子形成过程中的动态变化。二、实验原理 减数分裂是配子形成过程中一种特殊形式的有丝分裂，也叫成熟分裂。在高等动物的有性生殖过程中，雄性个体生殖腺（精巢）中的精原细胞(2n)生长分化为初级精母细胞(2n)，初级精母细胞经过减数第一分裂产生两个次级精母细胞(n)，再经过减数第二分裂和一系列的变化最后形成四个精子(n)。雌性个体的生殖腺（卵巢）中的卵原细胞(2n)经过生长分化形成初级卵母细胞(2n)，初级卵母细胞经过减数第一分裂形成大小悬殊的两个细胞，大的叫 次级卵母细胞(n)，小的叫第一极体(n)，它们各自进行减数第二分裂分别产生一个大的卵细胞(n)和三个第二极体(n)，因此可以用高等动物的精巢或卵巢作材料进行减数分裂的研究。精子的形成过程(变态)：精细胞 枣核状 柳叶状 精子 1.特点：(1)连续两次核分裂，而染色体只复制一次，结果产生了四个核，染色体数目减半。(2)前期特别长，而且变化复杂，包括同源染色体的配对、交换和分离。(3)DNA的合成一直延续到粗线期。2.交叉、交换与端移：(1)交换是同源染色体非姊妹染色单体间片段的交换，导致等位基因的交换，造成非等位基因的重组。(2)交叉是曾经发生过交换的地方，指在双线期由于同源染色体间的斥力大于引力，原来交换的地方没有断开出现一个缠绕的图象。交叉是同源染色体相应片断交换的结果，可在双线期观察到。(3)交换发生在粗线期早期。偶线期染色体联会，形成联会复合体。它是发生交换必不可少的结构。(4)DNA合成延续到粗线期，用来修复交换后的缺口。(5)随着同源染色体的分开，交叉向染色体的两端移动，交叉数目减少，叫做端移 力的来源：力的来源：同源染色体之间的斥力；着丝点之间的极向运动；纺锤丝之间的拉力。交换发生在粗线期早期，偶线期形成联会复合体，没有它就不会有交换和交叉。3.异固缩：指染色体或染色体的某些部位与其它某些染色体不同步的形成螺旋化的现象。包括正异固缩(早于其它染色体)和负异固缩(晚于其它染色体)。三、蝗虫精巢减数分裂观察 1.染色体组成：雌性：2n=24(22 XX)雄性：2n=23(22 XO)2.实验步骤：(1)取材与固定：活的雄蝗虫固定去掉第一对步足及翅剪去背部的胸腹几丁质皮，见到黄色的团状物为脂肪，其内便是栉比排列的精巢小管。精巢小管的上皮为扁平上皮细胞，呈片状。(2)染色压片：取2-3个精巢小管于载玻片上，将其撕碎，加入1-2滴改良苯酚品红，6-7min后压片。(3)观察：细线期、偶线期不易见到，前期I有核仁、核膜，核仁亮。粗线期同源染色体已经配对，可以观察到具有螺旋结构的11个不同的二价体。X染色体为端棒状，属于正异固缩。双线期可见交叉染色体，呈洇墨迹状，但较细。终变期洇墨迹明显，边缘不光滑。从边缘起毛刷状，可以成堆。X染色体为单价体。中期 I 染色体边缘光滑，进一步短粗。单价体落后，随机到一极去（为 X 染色体）。其它以四分体为单位排列到赤道板上。 后期I、末期I染色体距离比较远，遥遥相对，但同在一个细胞里。中期II染色体呈菊花状。后期II染色体呈四堆。二分体：每一条染色体含有两条染色单体，故称为二分体。四分体：配对的同源染色体称为双价体，也叫四分体。四、作业 绘制减数分裂各时期的分裂图象。所需材料及药品 雄蝗虫 改良苯酚品红 实验六、减数分裂小测 学 号 细 偶 期 粗 线 期 双 线 期 终 变 期 中 期 I 后 期 I 末 期 I 二 分 孢 子 中 期 II 后 期 II 末 期 II 四 分 孢 子 花或 粉精 粒子 背 景 注意事项：1.材料不限，考试时间为1小时；2.每人限看20次，每个时期最多看2次；3.不得交换片子，否则双方均按0分记；4.服从老师的判定，不得干扰考试纪律。第二大实验 果蝇大实验 实验一 果蝇形态观察 一、实验目的 1.了解果蝇生活史中各个不同阶段的形态特点；2.区别雌雄果蝇以及几种常见突变类型的主要性状特征；3.掌握实验果蝇的饲养、管理及实验处理方法和技术。二、实验材料、用具及试剂 双目解剖镜、放大镜、小镊子、麻醉瓶、白瓷板、新毛笔、乙醚、酒精 三、实验内容 1.果蝇的生活史 果蝇属于昆虫纲，双翅目，果蝇属，与家蝇是不同的种。果蝇的生活周期长短与温度关系很密切。30以上的温度能使果蝇不育和死亡，低温则使它的生活周期延长，同时生活力也降低，果蝇培养的最适温度为20-25。10 15 20 25 卵 幼虫 8天 5天 幼虫 成虫 57天 18天 6.3天 4.2天 从表中可以看出，25时，从卵到成虫约10天；在25时成虫约活15天。卵：羽化后的雌蝇一般在 12 小时后开始交配，两天后才能产卵。卵长 0.5mm，为椭圆形，腹面稍扁平，在背面的前断伸出一对触丝，它能使卵附着在食物(或瓶壁)上，不致深陷到食物中去。幼虫：从卵孵化出来后，经过两次蜕皮，发育成三龄幼虫，此时体长可达4-5mm。肉眼可见其前端稍尖部分为头部，上有一黑色斑点即为口器。口器后面有一对透明的唾液腺，透过体壁可见到一对生殖腺位于躯体后半部上方的两侧，精巢较大，外观上是一明显的黑点，而卵巢则较小，可以此作为鉴别。幼虫活动力强而贪食，它们在培养基上爬行时，留下很多条沟，沟多而且宽时，表明幼虫生长良好。蛹：幼虫生活7-8天准备化蛹，化蛹前从培养基上爬出，附着在瓶壁上，逐渐形成一梭形的蛹.在蛹前部有两个呼吸孔，后部有尾芽，起初蛹壳颜色淡黄而柔软，以后逐渐硬化，变为深褐色，表明即将羽化了。成虫：幼虫在蛹壳内完成成虫体型和器官的分化，最后从蛹壳前端爬出。刚从蛹壳里羽化出来的果蝇虫体比较长，翅膀尚未展开，体表尚未完全几丁质化，故呈半透明的乳白色。透过腹部体壁，可以看到黑色的消化系统。不久，变为短粗圆形，双翅展开。体色加深。如野生型初为浅灰色，然后呈灰褐色。2.形态构造 头部：有一对复眼，三个单眼和一对触角。胸部：有三对足，一对翅和一对平衡棒。腹部：背面有黑色环纹，腹面有腹片，外生殖器在腹部末端，全身有许多体毛和刚毛。3.成虫雌雄的鉴别 雌果蝇 雄果蝇 体形较大 体形较小 腹部椭圆形，末端稍尖 腹部末端钝圆 腹部背面有明显的五条黑色条纹 腹部背面有三条黑色花纹，前两条细，后一条宽且延续至腹面 腹部腹面有明显的6个腹片(刚毛围成一圈)四个腹片 无性梳 第一对跗节基部的一节有性梳 成虫 蛹 卵 三龄幼虫 一龄幼虫 二龄幼虫 外生殖器外观比较简单 外生殖器外观较复杂，刚羽化的幼蝇用低倍镜可明显观察到生殖弧、肛口板及阴茎 4.果蝇常见的几种突变类型 果蝇常见突变形状特征 突变形状名称 基 因 符 号 形 状 特 征 所在染色体 白眼 w 复眼白色 X 棒眼 B 复眼横条形 X 檀黑体 e 体呈乌木色，黑亮 IIIR 黑体 b 体呈深色 IIL 黄身 y 体呈浅橙黄色 X 残翅 vg 翅退化，部分残留不能飞 IIR 焦刚毛 sn 刚毛卷曲如烧焦状 X 小翅 m 翅较短 X 四、果蝇的性别决定 1.染色体组成 果蝇为二倍体2n=8,核内有丝分裂：不涉及细胞分裂和核分裂的染色体分裂方式。体联会：一些特殊的体细胞中（如果蝇唾腺细胞）的染色体经多次复制却不分开，依旧紧密地排列在一起就象减数分裂中的联会现象一样。染色体组：来自二倍体生物的正常配子的所有染色体。连锁群：来自配子中的每条染色体及其携带的基因。雌雄基因平衡理论：对果蝇而言，X染色体上有决定雌性的基因，常染色体上有决定雄性的基因存在，其比值决定果蝇的雌或雄，Y染色体只与育性有关，而与性别无关。2.果蝇的性别决定 果蝇的性别决定为XY型，Y染色体在性别决定上不起作用，只与育性有关。含有Y染色体，可产生正常的配子，不含Y染色体，则配子不育。性别决定与性比值（性指数）有关。X/A=1 则为雌性；X/A=0.5 则为雄性。X/A1，为超雌；X/A0.5，则为超雄；0.5X/A1则为中间性。雌雄基因平衡理论：果蝇X染色体上有很多雌性基因，常染色体上有很多雄性基因，Y染色体上很少或没有与性别决定有关的基因，因此性别决定于基因的平衡。3.果蝇的连锁群 X 染色体上有141 个基因；第2 染色体上有228 个基因；第3 染色体上有156 个基因；第4 染色体上有12个基因。4.同源染色体：来源相同、结构相似、控制的形状相同，在减数分裂中配对的一对染色体。五、实验步骤 1.麻醉 2.分辨雌雄蝇 3.观察结果 +e y w B wy vg 勺翅 缺刻 三隐性 体 色 灰 黑棕 黄 灰 灰 黄 灰 灰 灰 灰 眼色形 红 红 红 白 红棒 白 红 红 红 白 翅 形 长 长 长 长 长 长 残 勺 缺刻 与腹部末端平齐 刚 毛 直 直 直 直 直 直 直 直 直 曲 X染色体：焦刚毛(sn)，小翅(m)；第2染色体：黑身，残翅；第3染色体：檀黑身；第4染色体：无眼(ey)。附：果蝇培养基的配置(1000ml用量)玉米面 红糖 琼脂 干酵母 正丙酸 85g 65g 8.5g 7g 5ml 水溶琼脂加红糖加搅好的玉米面煮沸加水到1000ml冷却50左右加入酵母粉加入正丙酸（防腐剂）。培养瓶处理：150，3min 干热灭菌（带瓶塞）。实验二、果蝇杂交试验 一、实验目的 通过对果蝇的杂交实验，能基本掌握果蝇的杂交技术。并验证与加深理解三个遗传规律。二、实验用具及材料 野生型果蝇及各种突变型果蝇、培养瓶、麻醉瓶、放大镜、毛笔或解剖针、洁净的白瓷板、乙醚、记录本 三、研究概况 1.验证了分离规律和自由组合规律，说明其不仅适合于植物，也可用于动物。2.1910年，摩尔根发现白眼果蝇突变体，观察到交叉遗传现象。因为白眼w在X染色体上，为体X遗传。XWXW X+Y X+X+XWY XWY白 X+XW红 X+X+红 X+Y红 X+Y红 X+X+红 XWY白 X+XW红 即W基因由外公经由女儿传给了外孙，称为交叉遗传或绞花遗传。3.1916年，Bridge 发现X染色体不分开实验，证明白眼基因在X染色体上。四、果蝇材料的几大优点 1.个体小，生长快，周期短，每12天左右即可完成一个世代。2.易饲养，饲料简单易得，常温下易生长繁育。3.繁殖能力强，每只受精雌蝇可产卵400-500个，短期内可获得多数子代，有利于遗传学分析。4.突变形状多，而且多是外观形态学突变，易鉴别。5.幼虫的唾腺染色体为巨大染色体，容易做基因定位，建立连锁群。五、实验原理 遗传基本规律：分离规律；自由组合规律；伴性遗传规律；连锁与互换规律。1.一对相对性状：长翅(雌)残翅(雄)；残翅(雌)长翅(雄)2.两对相对性状：灰残(雌)檀黑长(雄)；檀黑长(雌)灰残(雄)3.伴性遗传：红(雌)白(雄)；白(雌)红(雄)4.三点测交；三隐性(雌)野生型(雄)六、杂交步骤 雌蝇羽化后12h不交配，两天内不产卵。按组合收集雌雄蝇(老师完成)杂交（记住杂交日期，并注明班级学号）7-8 天后蛹变黑时，放去成蝇（记日期）即放去种蝇2-4天，5-6天，7-8天后观察F1，选出5-6对雌雄蝇做兄妹交（记录F1的性状，统计数字）7-8 天后放飞F1代蝇（记录日期）2-4 天，5-6 天，7-8 天后观察F2代蝇，统计各种性状F3代出来后停止记录。七、统计分析 将记录结果整理，分别做 X2测验，看其是否符合遗传规律。F1代要多于 30 只，F2代要多于 50 只。记录好放飞时间（亲代和F1代）。三点测交计算图距。重组值=重组合/（亲组合+重组合）图距=重组值或重组值之和 交换值小于50%，而图距可以大于50%。基因直线排列定律（Sturtevant,1913)：三点实验中，两边的两个基因间的重组值一定等于另外两个重组值之和减去两倍的双交换值。并发率=观察到的双交换百分率/两个单交换百分率乘积 干涉（干扰）=1-并发率 发生一个单交换往往影响其临近的单交换。注意事项 1.挑果蝇时，除了要注意雌雄外，还要注意性状，防止因果蝇混杂而引起实验结果的失败。2.不可麻醉过度。3.放到培养瓶中时要先把瓶子倾斜，待果蝇苏醒后再把瓶子竖起来，防止果蝇粘在培养基中而不能苏醒。4.剩余的果蝇可放到大瓶子中，以保留种用。5.写好标签放到培养箱中。实验三、果蝇唾腺染色体的观察 一、实验目的 练习取出果蝇等幼虫唾腺的技术和制作唾腺染色体标本的方法。同时，根据唾腺染色体上带纹的形态和排列识别不同的染色体，也是进一步研究和鉴别果蝇染色体结构变异的有用方法之一。 二、果蝇唾腺染色体的有关知识 1.发现 1881 年，意大利的细胞学家巴尔比尼（Balbiani)在双翅目昆虫摇蚊幼虫的唾腺细胞间期核中发现了一种巨大的染色体，由于存在于唾腺细胞中，所以又称为唾腺染色体。1933年，美国学者贝恩特（Painter）等又在果蝇核其它双翅目昆虫的幼虫唾腺细胞间期核中发现了巨大染色体。这种染色体宽约5m，长400m，相当于普通染色体的100-150倍，因而又称为巨大染色体。2.原因 (1)染色体螺旋化程度不高。(2)果蝇幼虫的唾腺细胞在发育过程中，细胞核内的DNA 多次复制，但细胞、细胞核不分裂，复制后的染色单体DNA也不分开，形成了多线染色体。(3)同源染色体相互靠拢在一起呈现一种联会状态，使其比一般的体细胞染色体粗大。3.基本概念 核内有丝分裂：不伴随核分裂和细胞分裂的染色体分裂。核内复制；不伴随细胞内核分裂的染色体复制现象。体联会：唾腺细胞中的染色体复制后，所有同源染色体一直处于紧密配对的前期状态，如同减数分裂的联会，这种现象称为体联会。4.果蝇的染色体组成 由于在唾腺细胞中8条染色体之间以着丝粒相互连结在一起形成染色盘或异染中心和同源染色体之间的假联会，经减性染料染色后，可以观察到一个染色较深的染色盘和以染色盘为中心向外辐射出的5条染色体臂。在这些染色体臂上可以看到染色深浅不同的者写，被称为明带和暗带的横纹，这些横纹的位置、宽窄、数目都具有物种的特异性，不同物种，不同染色体的不同部位形态和位置是固定的，因此根据染色体各条臂带纹特征和各条臂端部带纹的特征能准确识别各条染色体。在染色体臂上还可看到某些带纹通过染色体的界旋、膨大形成的疏松区和巴尔比尼环，其富含转录出来的 RNA，因此不着色，是基因活动的区域。在个体发育的不同阶段，疏松区或巴尔比尼环在染色体上出现的部位不同，因此可以研究基因的表达，开展各种染色体变异的研究等等。果蝇共有4 对染色体。其中一对为性染色体（XY 或XX），XX 染色体为顶端着丝粒染色体，呈杆状，Y 染色体为“J”形；第二对、第三对染色体均为中央着丝粒染色体，呈“V”形；第四对染色体短小，为顶端着丝粒染色体，呈点状，附在染色盘边缘。由于唾腺染色体的假联会，X染色体的一端在异染中心上，另一端游离；而第二对、第三对染色体着丝粒在中央，可以从异染中心呈“V”字形向外伸展出四条臂（2L、2R、3L、3R），Y染色体着丝粒附近的异染色质参与了染色中心的形成，所以理想的片子，不管雌雄果蝇的唾腺细胞在显微镜下均可见五条长臂（X、2L、2R、3L、3R)和一条短臂（第四条染色体臂不易观察）。雄果蝇唾腺细胞中的X染色体臂比雌果蝇的稍细。在染色体臂上可观察到许多明暗相间的带。(1)果蝇染色体有102个区，每个区又有AF六个亚区，每个亚区又有1,2,3等亚亚区。(2)疏松区有许多灯刷状物质（灯刷染色体）(3)唾腺染色体的末端有不同的特征，可以借此来鉴别各条染色体。5.特点 (1)巨大；(2)体联会现象决定了染色体只有半数； (3)各个染色体中异染色质多的着丝粒部分相互靠拢形成染色中心；(4)横纹有深浅、数目、疏密的不同，各自对应排列，这意味着基因的排列，具有种的特异性。(5)多线染色体（与中期高度螺旋的染色体相区别）若有缺失、易位、倒位、重复等现象，很容易在唾腺染色体上识别出来。三、幼虫的培养 发育充足、肥大的三龄幼虫，唾腺和唾腺细胞发育良好。利用这样的唾腺细胞才能制备出理想的染色体玻片标本。因此要求培养基营养丰富，含水量较高，比较松软，发酵良好。将果蝇放入培养瓶中（果蝇不应过多，半磅牛奶瓶 10 对左右）于 15-18的稍低温度条件下培养，接种 12小时后，将成虫移出，控制成虫的排卵持续时间，以免产