流式细胞仪原理与应用.doc

流式细胞仪原理与应用流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。流式细胞仪的技术指标与主要构造流式细胞仪主要由以下五部分构成:流动室及液流驱动系统激光光源及光束形成系统光学系统信号检测与存储、显示、分析系统细胞分选系统。l 主要技术指标 1流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。2流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上600个荧光分子,两个细胞间的荧光差5%即可区分。3前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2m.5m。4流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到90%病例CD10+，而婴儿CD10+病例50%。FAB分类为L1、L2，白血病细胞的FS和SS都很低;一般TdT、HLA-DR、CD19阳性，大多数病例CD24、CD34阳性，本型细胞膜免疫球蛋白(Ig)阴性。此型有CD10+、CD10-两个亚型，CD10+型预后较CD10-型好。前B细胞ALL：前B细胞ALL在发育阶段上较B祖细胞ALL晚，占儿童ALL的25%，在成人ALL占的比例还不清楚。一般CD24、HLA-DR、CD19、CD10、cCD22阳性，CD34阴性,鉴别特点时有胞浆重链。此型预后较B祖细胞ALL差，可能与t(1;19)有关，t(1;19)占前B细胞ALL的25%，此型CD34-，而B系列ALL中CD34-是独立的预后不良标记。B细胞ALL：B细胞ALL占所有ALL的2%-5%；B细胞ALL更为成熟，白血病细胞的FS和SS较B-祖细胞ALL明显增加，在FSSS直方图或SS(线性或对数)CD45直方图中处于淋巴细胞和单核细胞区域。典型标记是细胞膜免疫球蛋白（sIg）阳性,表型一般为CD19、CD20、CD22、CD24阳性,多数病例CD10+，但sIg和成熟抗原出现可区别于更早的B系ALL。此型FAB分类一般为L3,罕见病例有B细胞ALL标记而FAB分类一般为L1，这些病人多有t(1;19)和t(14;18)。T细胞ALL：T细胞ALL占儿童ALL的15%,成人ALL的25%。多数表型为胸腺细胞型，最常见的是晚期胸腺皮质细胞亚型，CD1+、CD2+、CD5+、CD7+,CD4+CD8+，CD3表达较少，TdT常阳性；另一常见亚型是早期胸腺皮质细胞亚型，CD2+、CD5+、CD7+、TdT+。髓质期亚型较少见，CD2+、CD5+、CD7+，CD3+CD4+或CD3+CD8+，TdT表达较少。前T细胞亚型，仅有CD7和cCD3而无其他T系抗原表达，预后较差。T系肿瘤性疾病多有特异性正常抗原表达的下调或表达该分化阶段正常不应出现的抗原。成人T细胞ALL预后较好，而儿童T细胞ALL较儿童B-祖细胞ALL和前B细胞ALL预后差，虽然各亚类预后仍不甚明确，但CD10阴性者预后不良。ALL的免疫学分型经过1986年前分为五型，1986-1994年分为两大类九型,九十年代后期(1997)分为四型的过程。1986年前的五型，是当时单克隆抗体和检测手段的反映；随着新的单克隆抗体（主要是T、B淋巴细胞亚群的McAb）的发现和临床大量病例的检测，不仅弄清了T、B淋巴细胞的来源、分化发育过程，而且使免疫分型更加细致，因而出现了1986-1994年分为两大类九型；但按照细胞的分化发育阶段分型的两大类九型分型法对临床略显繁琐，指导治疗、判断预后临床实用性也不够强，因此又出现了以上简单的四型分类法。经过对比不难看出，四型分类法的B-祖细胞ALL型实际上包含了两大类九型分类法的非T-ALL的、3个亚型，而型即是前B细胞ALL型，型是B细胞ALL型；而T细胞ALL型是两大类九型中T-ALL的三型合并为一型。两大类九型分类法的非T-ALL的型分类为急性未分化白血病（见后）。ALL也可按DNA含量分类，用流式细胞仪很容易测定DNA含量，DNA含量分为两个亚类：超二倍体和亚二倍体，前者预后好，后者预后差。2.急性髓细胞白血病(AML)攪目前所有粒、单核系的单克隆抗体基本无分化发育阶段特异性,因此AML的免疫学分型FAB-M0、M1、M2界限不十分明显;但M3多不表达HLA-DR和CD34，常表达CD13、CD33、CD9、CD38；GPA在鉴别红白血病(M6)时可提供帮助;巨核细胞白血病(M7)则有CD41、CD42、CD61为系列特异标记,为确诊的重要指标。由于白血病的异质性,同一FAB分类的白血病抗原表达并不完全相同。M0：M0白血病细胞的FS和SS都很低，在SSCD45直方图中处于原始淋巴细胞区域。M0的白血病细胞至少表达一个髓系特异性标记如MPO、CD13、CD116，MPO较CD13、CD116更敏感；一般淋巴系标记是阴性的，但可能表达CD7或CD4；一般CD34、HLA-DR阳性。有研究显示AML复合表达CD7和CD34预后不良。M1：M1的白血病细胞抗原表达类似于M0并与M0不好区分，M1一般表达CD13，CD33和HLA-DR，CD34表达较M0少，部分可能表达CD15，较少病人可能表达CD4。M2：M2与M1的主要区别是分化成熟增加，原始细胞减少；CD34表达较M1少，CD15表达较M1增加，大部分病例HLA-DR阳性，CD13表达强于CD33；部分M2表达CD19和CD56伴有t(8;21)，罕见的伴有t(8;21)的M2不表达CD13，CD33和CD14但MPO阳性。M3：M3白血病细胞由于它的高颗粒性而SS增大；M3的白血病细胞一般表达CD13，CD33，部分病人可能表达CD2，但HLA-DR阴性，CD34一般为阴性，复发病人阳性；部分病人可能表达CD56，表达CD56者应作基因检查(APL/RAR)以排外髓/NK细胞急性白血病(详见后)。M4、M5：M4、M5的免疫表型相似，重要表型特点是表达CD13、CD33、CD14、CD15和HLA-DR，部分病人表达CD4、CD7,部分病人可能表达CD56，表达CD2多为M4E0，常伴有16号染色体异常，预后好。M6：M6较少见，一般表达HLA-DR、CD34、CD13、CD33，GPA对确定红系有用。M7：M7占成人ANLL的1%、儿童的4%。成人M7多见于二次性白血病,即CML.BC或MDS-RAEB或MF白血病变。而儿童M7多为原发。M7免疫学表型一般为:CD41+,CD42+,CD61+,CD33+/-,CD13+/-,CD34+,DR+/-,CD10-。特异性标记CD41、CD42、CD61阳性可确诊M7，但要注意排外血小板粘附于细胞上的假阳性结果。3急性未分化白血病用流式细胞仪分析仅有大约1%的急性白血病不能分类，典型急性未分化白血病仅有HLA-DR和CD34表达而无系列特异性抗原表达。4杂合型白血病真正的双系列表型白血病是伴有t(9;22)或有11q23MLL（myeloid/lymphoidormixedlineageleukemia髓/淋系或混合性白血病）基因重排的病人，以往报道的许多杂合型白血病多是由于方法学问题不能排除非白血病细胞的干扰，或将非特异弱表达当作特异表达，如前所述白血病细胞毕竟不是正常造血细胞,其抗原表达与正常造血细胞并不完全相同，部分丧失了系列专一性和分化的严格性，因此不要轻易定型杂合型白血病，国际上杂合型白血病尚无统一诊断标准。5慢性粒细胞白血病急性变(CMLBC)慢性粒细胞白血病(慢粒CML)是一种多能造血干细胞疾病,其转归多为急性变。慢粒急变(CMLBC)涉及所有造血细胞系列,往往不易从形态学上确定急变类型,50%-60%为AML变,30%左右为ALL变。AML变可表达AML的所有表型，大多数ALL变为B细胞来源,其中cALL及前B-ALL多见,罕见T-ALL变。6B淋巴系细胞增殖性疾病B淋巴系细胞增殖性疾病中包括B慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、B幼淋细胞白血病（B-PLL）、毛细胞白血病（HCL）和多发性骨髓瘤（MM）/浆细胞白血病和部分淋巴瘤，淋巴瘤免疫分型将在不同章节中描述。B-CLL：B-CLL的白血病细胞一般表达CD19、CD20、CD43和CD79a，CD5与以上抗原复合表达，sIgM、sIgD、CD11c和CD25也常表达但表达较弱，CD10、CD22阴性。伴染色体异常者预后较差。B-PLL：流式细胞仪在区分B-PLL和B-CLL中十分有用,B-PLL通常sIg表达强,CD5阴性而CD22阳性,困难的是原发B-PLL和由B-CLL转化为B-PLL的区分,由B-CLL转化来的B-PLLCD5阳性而CD22表达弱,类似于B-CLL。HCL：HCL一般表达成熟B细胞标记:CD20、CD22、CD19、CD79、sIg，CD11c、CD22高表达，CD25中等度以上表达，一般CD21-，典型病例CD5-、CD10-、CD23-，但有少数病例可阳性。CD103是HCL最可信的标记，可用来与其它B细胞白血病鉴别。浆细胞瘤：由于大多数多发性骨髓瘤病人骨髓标本中含骨髓瘤细胞少及瘤细胞丧失了大多数B细胞系特异性标记，用流式细胞仪分析多发性骨髓瘤（MM）/浆细胞白血病较为困难，典型的浆细胞CD38强表达而CD45弱表达。一般浆细胞sIg弱表达,cIg阳性。7T淋巴系细胞增殖性疾病T淋巴系细胞增殖性疾病中包括T幼淋细胞白血病（T-PLL）、NK细胞白血病（T-LGL、NK-LGL）和成人T淋巴细胞白血病（ATL）、T慢性淋巴细胞白血病(T-CLL)。T-PLL：T-PLL的白血病细胞一般表达CD2、CD3、CD5和CD7，大多数病人CD4+CD8-,但偶有CD4+CD8+,单独表达CD8者少见,本病常伴有14q11和14q32改变,有CD4+CD8-表型者预后较好,本病较B-PLL恶性度高。NK细胞白血病：NK系列白血病最早描述的是大颗粒淋巴细胞白血病（LGL）,LGL有两种类型：T-LGL和NK-LGL，T-LGL表达CD3、CD8、CD2、CD16、CD11b、CD57、而CD56、CD5、CD7、CD4和CD25多阴性，有TCR基因重排。NK-LGL表达CD2、CD16和CD56，而CD3、CD4多阴性，CD8、和CD57弱表达或阴性，无TCR-基因重排。最近NK系列白血病又有新的亚型发现，如急性前髓系/NK细胞白血病、急性髓系/NK细胞白血病、原始NK细胞白血病、NK样T细胞白血病。急性前髓系/NK细胞白血病是一种最近认识的不同类型的白血病,其特点是有明显髓外涉及,不成熟的原始淋巴细胞样形态,伴MPO-、CD7+、CD33+/CD13+、sCD3-、cCD3-、CD56+,预后不良。急性髓系/NK细胞白血病，形态学和免疫表型类似于M3,但无RAR基因重排，一般HLA-DR-、CD33+、CD13+、CD56+，多见于老年病人，对维甲酸无反应。原始NK细胞白血病，无髓系和淋巴系抗原，CD56+、cCD3+/-、CD2+/-、CD4+/-、CD7+/-，少数有TCR基因重排，而无TCR-基因重排。NK细胞系列白血病的新亚型是近10年才较多注意到的白血病,其临床特点,免疫表型,染色体及基因改变需进一步积累病例研究才能彻底明了。大约10%-20%左右的急性白血病表达CD56，除了原始NK细胞白血病、NK样T细胞白血病、急性髓系/NK细胞白血病、急性前髓系/NK细胞白血病外，大部分表达CD56的急性白血病是FAB分类的M2、M3、M4、M5型，这类病人究竟是急性髓系/NK细胞白血病还是急性髓系细胞白血病伴NK抗原表达有待进一步研究，鉴于急性白血病部分丧失了系列专一性和分化的严格性，可能称为急性髓系细胞白血病伴NK细胞抗原表达较为合适。成人T淋巴细胞白血病(ATL)：大多数ATL细胞表达激活T细胞表型：CD3、CD4、CD5、CD25、HLA-DR、TCR，一般CD7-和CD8-,常有粘附分子L-选择素的异常表达；伴有p53异常者预后不良。T-CLL：T-CLL少于CLL总数的1%，细胞形态学类似与一般CLL，但临床发展较快，但多数病人表达CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、少数病人表达CD8。l 血液学应用：淋巴瘤免疫分型 目前淋巴瘤的分类方法已从LSG的形态学分类逐渐转变为REAL分类法,REAL分类法是以肿瘤发生源为基础的分类方法,在原来的形态学基础上加上免疫学分型后再加以分类,这种分类方法不仅能够推断肿瘤的发生源,对治疗也有指导意义。因此淋巴瘤的免疫分型越来越重要。如同白血病免疫分型一样，淋巴瘤的免疫分型也是利用单克隆