流式细胞仪原理及应用(HIV).ppt

碧迪医疗器械（上海）有限公司碧迪医疗器械（上海）有限公司上海市上海市静静安嘉里中心安嘉里中心3 3座座1010楼楼李苏辉李苏辉流式细胞仪原理及仪器维护保养白细胞的组成白细胞的组成 白细胞的组成及其分化抗原白细胞的组成及其分化抗原白细胞在分化成熟过程中，不同的发育阶段和不同亚类的白细胞出现或白细胞在分化成熟过程中，不同的发育阶段和不同亚类的白细胞出现或消失的表面标记，这是区分白细胞的重要标志。消失的表面标记，这是区分白细胞的重要标志。19861986年世界卫生组织年世界卫生组织命名委员会建议应用命名委员会建议应用CDCD系列来统一命名白细胞分化抗原系列来统一命名白细胞分化抗原白细胞（CD45)淋巴细胞单核细胞(CD14/15)粒细胞(CD15)B cell（CD19等）NK cell（CD16/56)T cell(CD3)嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞中性粒细胞巨噬细胞Th cell(CD4)Tc cell(CD8)2SHA-LFR032-20080930-4N 13E for Jerel细胞毒性T淋巴细胞;分泌穿孔素、IFN、TNF等。特点：MHC-1类分子限制、直接接触、反复杀伤自然杀伤细胞（NK)：抗体依赖细胞介导的细胞毒作用、淋巴因子介导细胞毒作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用补体系统的活化（经典、凝集素、替代途径）。作用（溶胞作用、吞噬条理作用、趋化性、炎症反应等）中和抗原：形成免疫复合物，被吞噬细胞清除（条理作用）、毒素中和作用、感染中和作用体液免疫和细胞免疫的作用体液免疫和细胞免疫的作用淋巴因子依赖的细胞毒作用3免疫应答的过程及免疫应答的过程及ThTh细胞的作用细胞的作用 免疫应答：细胞免疫体液免疫Th细胞作用：Th1分泌IL-2、INF等，前者可诱导Th、Tc分裂增值；Th2分泌IL-4、IL-5,可使B细胞活化，产生抗体B细胞完全活化需要Th帮助 4流式细胞仪原理流式细胞术(Flow cytometry)对于处在流动状态的细胞或生物颗粒同时进行多参数的快速的分析和定量的技术5TTCHCDCD3 3CD3CD3CD8CD8CD4CD4流式细胞仪检测原理及在T细胞分析中应用7AnalyzeAnalyzeIncubateIncubate8激发光源与荧光标记物9FACSCalibur流式细胞仪仪器结构液流系统光学系统激光光源激光光源光收集系统光收集系统电子系统光电转换光电转换数据处理系统数据处理系统软件系统10液流系统-鞘液11流式细胞仪原理 Injector Tip荧光信号及前向角、侧向角散射光聚焦的激光光束鞘液鞘液12光学系统激光(Laser,light amplification by stimulated emission of radiation)是一种相干光源，它能提供单一波长、高强度及稳定性高的光照激光波长:488nm,635nm13检测信号 散射光信号FSC:前向角散射光SSC:侧向角散射光(90度散射光)荧光信号荧光染料光学滤片14检测信号15FALS SensorLaser前向角散射光信号 16前向角散射光信号17 散射光信号散射光信号散射光信号前向角散射光信号前向角散射光信号前向角散射光信号(FSC)(FSC)(FSC)FSC-FFSC-Forwardorward (A Angelngel L Light)ight)S Scattercatter在激光束正前方的检测器在激光束正前方的检测器,为前向散射光检测为前向散射光检测器器 FSCFSC的强度与细胞或其他颗粒的大小的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及形状及 optical homogeneity optical homogeneity 有关有关FSCFSC用于检测细胞或其他粒子的表面属性用于检测细胞或其他粒子的表面属性如如:大小大小 18FALS Sensor90LS SensorLaser侧向角散射光信号19侧向角散射光信号20 侧向角散射光信号侧向角散射光信号(SSC)(SSC)SSC-SSSC-Sideide (A Angelngel L Light)ight)S Scattercatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器,也也称为称为9090度散射光检测器度散射光检测器 SSCSSC的强度与细胞或其他颗粒的大小的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及形状及 optical homogeneity optical homogeneity 有关有关SSCSSC用于检测细胞内部结构用于检测细胞内部结构如如:胞浆内颗粒多少胞浆内颗粒多少,核质比核质比 21流式细胞仪的检测信号：散射光FSCFSC，前向角散射光，前向角散射光，代表细胞大小代表细胞大小SSCSSC，侧向角散射光，侧向角散射光，代表细胞粒度代表细胞粒度Right Angle Light Detector Cell ComplexitySSCForward Light Detector Cell Surface Area FSCIncident Light Source22荧光信号荧光信号每种荧光染料均有特定的激发波长,并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长.利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号23光学系统FCM的光学系统是由若干组透镜,滤波片,小孔组成24光路光路 -滤片特性滤片特性 长通滤片 允许长于设定波长的光通过 短通滤片 允许短于设定波长的光通过 带通滤片 允许一定带宽的波长通过25460 500 540460 500 540460 500 540SP 500SP 500LP 500LP 500BP500/50BP500/50 长通 短通 带通光学滤片26荧光信号27荧光信号28 光路光路 -滤片特性滤片特性 当以当以 4545o o 角角放置长通滤片时放置长通滤片时,该滤片可以通过该滤片可以通过一定波长的光一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长同时也可以阻断并折射该波长以下的光以下的光 这种方式的滤片称为二向色性长通滤片这种方式的滤片称为二向色性长通滤片(dichroic filter)dichroic filter)2930光学系统31电子系统当细胞携带荧光素标记物,通过激光照射区时,受激激发,产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号,这些信号经A/D转换成数字信号,送计算机进行储存、作图、统计分析32发射波长Wavelength(nm)40045050055060065070010008006004002000PEFITCPerCP75033流式细胞仪原理荧光信号650nm700nmFL3650 and Above500nm600nmFL1530/30FL2585/42Relative IntensityFITCPEPerCPWavelength(nm)550nm34检测器检测器Photomultiplier tube(PMT)Photomultiplier tube(PMT)将光学信号转变为电脉冲将光学信号转变为电脉冲(数字数据数字数据)信号信号 35单平台绝对计数管中预先加有准确定量的Beads流式细胞仪获取数据后，由各目标群的含量，可以计算出相对含量%由各目标群与Beads的相对量计算，得到该细胞群的绝对含量计算公式：细胞获取数Beads总量细胞/L=Beads获取数 样本量注：Beads总量见TruCOUNT管外包装MultiSET系统中，样本量为50 L36单平台绝对计数使用TriTEST或MultiTEST试剂，在TruCOUNT管中完成全血的淋巴细胞绝对计数TruCOUNT管中预先加有准确定量的Beads，每批TruCOUNT管的Beads含量一致由各目标群与Beads的相对量计算，得到该细胞群的绝对含量使用直接荧光标记抗体组合，一步处理外周血使用免洗技术，溶血后直接上机检测标本操作简便，省时省力，计数结果重复性好37淋巴细胞分析使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析淋巴细胞分析TriTEST：三色试剂CD4/CD8/CD3，CD3/CD4/CD45MultiTEST：四色试剂CD3/CD8/CD45/CD4TruCOUNT：单平台绝对计数管报告Th,Ts,Th/Ts百分含量%与绝对含量cells/uL38TriTEST CD4/CD8/CD3hT Lymph EventshCD3+CD4+%T LymphhCD3+CD8+%T LymphhCD3+CD4+CD8+%T LymphhT H/S RatiohBead EventshCD3+Abs CnthCD3+CD4+Abs CnthCD3+CD8+Abs CnthCD3+CD4+CD8+Abs Cnt39淋巴细胞四色分析hLymph Abs CntLymph Abs CnthCD3+%LymphCD3+%LymphCD3+CD3+Abs CntAbs CnthCD3+CD4+%Lymph CD3+CD4+%Lymph CD3+CD4+Abs CntCD3+CD4+Abs CnthCD3+CD8+%Lymph CD3+CD8+%Lymph CD3+CD8+Abs CntCD3+CD8+Abs CnthCD3+CD4+CD8+%LympCD3+CD4+CD8+%Lymph hhCD3+CD4+CD8+Abs CD3+CD4+CD8+Abs CntCnthT H/S RatioT H/S Ratio40MultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD1941FacsCalibur仪器样本操作仪器校正：加入校正试剂内的液体必须和鞘液桶的一样。仪器校正：加入校正试剂内的液体必须和鞘液桶的一样。样本操作：溶血、有凝块的血不要做样本操作：溶血、有凝块的血不要做 加样前，抗凝血颠倒混匀加样前，抗凝血颠倒混匀8 81010次（避免混匀器混匀）次（避免混匀器混匀）使用反向加样法，枪头贴壁。加样枪在试管内不要放松使用反向加样法，枪头贴壁。加样枪在试管内不要放松 42FACSComp没有通过怎么办？FSC或SSC没有通过：原因：1.由于仪器的管路没有清洗干净2.使用的鞘液杂质太多(换鞘液）BD公司专用鞘液3.校准品失效4.仪器故障措施：1.用蒸馏水高速运行仪器10分钟30分钟2.过滤鞘液3.使用新的校准品4.致电BD工程师43FacsCalibur仪器 BDBD原装鞘液：过滤、消毒。原装鞘液：过滤、消毒。0.22um0.22um滤膜过滤滤膜过滤 鞘液桶放入鞘液桶放入3 3升鞘液（不要放满），清除废液桶废液，装升鞘液（不要放满），清除废液桶废液，装200200毫升漂白剂毫升漂白剂 先开仪器再开电脑先开仪器再开电脑 在按在按PrimePrime按钮去除流动池气泡时，上样架处在偏离位置按钮去除流动池气泡时，上样架处在偏离位置 做好每日维护，建议每次关机时做做好每日维护，建议每次关机时做FacsCleanFacsClean和和FacsRinseFacsRinse清洗。清洗。（1 1）FacsCleanFacsClean，Run Hi Run Hi 支架旁位支架旁位2 2分钟；支架正位分钟；支架正位3 3分钟分钟 （2 2）FacsRinseFacsRinse，步骤同上，步骤同上 （3 3）蒸馏水，）蒸馏水，Run Hi2Run Hi2分钟旁位，分钟旁位，5 5分钟正位（分钟正位（4 4）去除鞘液压力去除鞘液压力（5 5）选择）选择StandbyStandby模式模式1010分钟分钟后关机后关机 月维护中鞘液桶装入月维护中鞘液桶装入FacsClean(0.5FacsClean(0.51 1的漂白剂的漂白剂)，旁路鞘液过滤器。，旁路鞘液过滤器。每每3 3个月个月6 6个月清洗空气过滤网（用水冲洗再晾干）。过滤器个月清洗空气过滤网（用水冲洗再晾干）。过滤器6 6个月更换个月更换44FACSCount45仪器性能样本稳定性制备后室温(2025 0C)储存48小时全血稳定性采集后室温(2025 0C)储存48小时46FacsCount样本处理FacsCountFacsCount质控：正常血，样本用前颠倒混匀（避免质控：正常血，样本用前颠倒混匀（避免混匀器上混匀）。反向加样法，枪头贴管壁混匀器上混匀）。反向加样法，枪头贴管壁,分离最后一滴。分离最后一滴。试剂在开盖前可以在混匀器上颠倒混匀试剂在开盖前可以在混匀器上颠倒混匀每次更换枪头，样本多时，每次更换试剂对管管盖每次更换枪头，样本多时，每次更换试剂对管管盖加入固定液后加入固定液后3030分钟以后再操作更安全分钟以后再操作更安全47FacsCount仪器 用水冲洗开盖器，用轻柔的去污剂或用水冲洗开盖器，用轻柔的去污剂或7070酒精清洗电子酒精清洗电子 加样枪加样枪,用用1 1：1010的漂白剂清洗的漂白剂清洗WorkstationWorkstation 避免在废液桶里装高浓度的漂白剂避免在废液桶里装高浓度的漂白剂 每次试验结束后废液桶必须清空每次试验结束后废液桶必须清空,然后用自来水冲洗然后用自来水冲洗.建议关机后取出废液建议关机后取出废液桶桶,下次实验时再放置在仪器里下次实验时再放置在仪器里 电子加样枪不用时需从支架上取下电子加样枪不用时需从支架上取下.软盘复制（已做过质控的软盘作为母盘）软盘复制（已做过质控的软盘作为母盘）连续做连续做1515个标本需要做清洗，如果试验中间中断个标本需要做清洗，如果试验中间中断1 1小时小时 以上，需要清洗；将装有蒸馏水的上样管置于上样针位置，以上，需要清洗；将装有蒸馏水的上样管置于上样针位置，保持上样针湿润，防治结晶；关机。保持上样针湿润，防治结晶；关机。如果长时间不做试验，建议每周用蒸馏水清洗如果长时间不做试验，建议每周用蒸馏水清洗48FacsCount仪器FacsCountFacsCount的每日维护；的每日维护；1.1.运行运行CLEANCLEAN程序，程序，2.2.上样管放置稀释的上样管放置稀释的FacsCleanFacsClean（稀释（稀释1010倍次氯酸钠）倍次氯酸钠）3 3分钟分钟3.3.再放置装有再放置装有FacsRinseFacsRinse（Tween Tween 稀释稀释1010倍倍1/00%)1/00%)上样管清洗上样管清洗3 3分钟分钟4.4.重新执行重新执行CLEANCLEAN程序，程序，FacsRinse FacsRinse（Tween Tween 稀释稀释1010倍倍1/00%)1/00%)再洗再洗3 3分钟分钟5.5.放置装有蒸馏水的上样管清洗放置装有蒸馏水的上样管清洗3 3分钟分钟6.6.试验结束后，放置装有蒸馏水的上样管浸泡上样针，避免管道试验结束后，放置装有蒸馏水的上样管浸泡上样针，避免管道结晶结晶6.6.仪器无用时建议取出废液桶仪器无用时建议取出废液桶49FacsCount仪器FacsCountFacsCount的长冲洗；的长冲洗；1.1.短路过滤器短路过滤器,并在鞘液桶内和试管中放置稀释并在鞘液桶内和试管中放置稀释5 5倍的次氯酸钠倍的次氯酸钠2.2.运行运行CLEANCLEAN程序程序(二个循环二个循环)后进入后进入UTILITYUTILITY程序，按程序，按“ShutdownShutdown”键，使上样针浸泡在装有次氯酸钠的试管中，将键，使上样针浸泡在装有次氯酸钠的试管中，将仪器电源关掉，让仪器管道浸泡仪器电源关掉，让仪器管道浸泡3030分钟分钟 2.2.倒掉鞘液桶内的次氯酸钠，将鞘液桶洗干净，换上干净的（蒸倒掉鞘液桶内的次氯酸钠，将鞘液桶洗干净，换上干净的（蒸馏水或纯净水），试管中换上蒸馏水或纯净水，再运行清洗程序馏水或纯净水），试管中换上蒸馏水或纯净水，再运行清洗程序一个循环，执行排气泡一个循环，执行排气泡“DrainDrain”命令两次命令两次 3.3.恢复鞘液接头和过滤器的接头到原来位置，排除过滤器内的空恢复鞘液接头和过滤器的接头到原来位置，排除过滤器内的空气，再次运行气，再次运行CLEANCLEAN程序（一个循环），和排气泡程序（一个循环），和排气泡“DrainDrain”.4.4.试验结束后，装有蒸馏水的上样管浸泡上样针，避免管道结晶试验结束后，装有蒸馏水的上样管浸泡上样针，避免管道结晶50联系方式技术支持：赵阳阳邮箱：sunny_电话：[phone]硬件工程师：李晨电话：[phone]全国技术维修服务电话：4008199900-251谢 谢BDBD生物科学生物科学