蛋白质纯化柱-ni.pdf

_ 地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路 333 号号 A505 室室 邮编：邮编：201203 电邮：电邮： 电话：电话：[phone] 传真：传真：[phone] 网址：网址： 镍镍镍镍离离离离子子子子金金金金属属属属螯螯螯螯合合合合亲亲亲亲和和和和层层层层析析析析介介介介质质质质使使使使用用用用说说说说明明明明书书书书（完完完完全全全全版版版版）一、简介一、简介 金属螯合亲和层析，又称固定金属离子亲和色谱，其纯化原理是利用蛋白质表面的组氨酸与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+形成配位相互作用，从而能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。因此，固定有这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地纯化这类含有多个组氨酸的蛋白以及多肽和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸与固定金属离子结合力要远小于组氨酸残基，对纯化影响不大。纯泰特殊结构设计的镍离子金属螯合亲和层析介质包括Ni-NTA和Ni-IDA两种配体，既具有特异性好、螯合镍更稳定，镍离子脱落少，使用寿命长的优势，同时具有基础层析介质颗粒粒度均匀，流速快的优点，并且物理和化学稳定性好，能耐受更高浓度的还原剂、变性剂和去垢剂，批次重复性好，质量稳定。本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。注：注：镍离子有六个螯合价位，Ni-NTA螯合了四价，剩余两价；而Ni-IDA螯合三价，剩余三价。因此Ni-IDA Agarose结合作用力要比Ni-NTA Agarose强，在同样条件下Ni-IDA Agarose的载量要比Ni-NTA Agarose高，而且洗脱杂质和目标蛋白所用的缓冲液中咪唑浓度更高；但Ni-NTA Agarose更稳定，耐受更强的还原剂，镍离子更不易脱落。具体应用何种介质视个人习惯以及纯化条件而定。二、性能参数二、性能参数 特点 特殊NTA、IDA结构设计，蛋白载量大，专一性高，使用寿命长 基质 6%的交联琼脂糖凝胶 配体 NTA-Ni2+/IDA-Ni2+配体密度 2040mol/ml 吸附载量 30mg蛋白(60kda)/ml 介质平均粒径 100m 最大流速 600cm/h pH范围 310，在位清洗时pH范围可到211 保存温度 +48 保存液体 20%乙醇 三、适用范围三、适用范围 分离His融合蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。四、四、E.coli表达可溶性表达可溶性his重组蛋白纯化操作说明重组蛋白纯化操作说明 1.缓冲液配制?缓冲液A（平衡缓冲液）：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，用高浓度NaOHl调节pH值至8.0。?缓冲液B（洗脱缓冲液）：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，500mM imidazole（咪唑），用高浓度NaOHl调节pH值至8.0。?缓冲液C（咪唑浓度稀释液）：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，用高浓度NaOH调节pH值至8.0。注：注：如使用试剂盒，盒中提供10缓冲液A、1缓冲液B和10缓冲液C的配制干粉。分别在缓冲液A和C的盛装容器中加入双蒸水定容至100ml，得到缓冲液A和C的10倍浓缩液，使用时根据需要取一定量进行10倍稀释，即得到上述正常使用浓度的两种溶液。缓冲液B的每包配制干粉可配制1缓冲液B 500ml，配制时将一包干粉先溶于适量双蒸水中，最后定容至500ml。每种缓冲液均应在稀释成正常使用浓度以后，再调节pH值。?缓冲液D（咪唑梯度洗脱液）：用缓冲液B和缓冲液C按不同比例配制，配制比例如下（100ml总体积）：咪唑浓度 缓冲液C(ml)缓冲液B(ml)0mM 100 0 10 mM 98 2 20 mM 96 4 50 mM 90 10 60 mM 88 12 100 mM 80 20 150 mM 70 30 200 mM 60 40 250mM 50 50 400 mM 20 80 各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45m滤膜过滤备用。2.样品预处理：按每克湿重菌体/45ml缓冲液A的比例充分悬-1-_ 地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路 333 号号 A505 室室 浮离心收集的菌体，400w功率下，每个循环超声3s，冷却2s，共循环180次破碎菌体；4、13000rpm离心15m，收集上清液或用0.45m滤膜过滤，并用高浓度NaOH调节 pH至8.0待上样。3.装柱：?聚苯乙烯层析柱 1)将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。2)打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片11.5cm高度时封闭下端出口，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。3)从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫片与介质接触面滞留气泡（如对实验要求并非十分严格，为提高流速，可不覆盖上垫片）。4)在使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可先用小镊子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，倒出介质，清洗或更换新的垫片后，按2）、3）所述步骤重新装柱；或不更换垫片，用细棒搅拌介质，使其疏松，再装入上端垫片。?玻璃层析柱 1)将层析柱洗净后垂直固定到铁架台上；向柱中加入蒸馏水，排开柱子中的空气，在蒸馏水排尽以前，关闭柱子出口，在柱内保留58cm高度的蒸馏水。2)先将介质混匀，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。3)从上端管口将转换杆出液端缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免转换杆与介质接触面间滞留气泡。4)在使用一段时间后，如果流速减慢，可先卸下上转换杆，将介质倒出，再取出下转换接头中滤网，清洗或更换后重新装柱。4.过柱：1)用510倍介质体积的缓冲液A平衡亲和柱；2)上样；3)用510倍介质体积缓冲液A洗去层析柱中未结合蛋白；4)用缓冲液B和缓冲液C配制的不同浓度缓冲液D洗脱；?最高纯度洗脱方案：用含0、60、100、150、200、250mM 咪唑的缓冲液D分步洗脱，每个梯度23倍介质体积洗脱；?最高收率洗脱方案：先用510倍介质体积含20mM咪唑的缓冲液D洗脱，再用510倍介质体积含250mM咪唑的缓冲液D洗脱。注：注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速保持在0.5ml/min为宜。5.介质清洗与再生：如果使用一段时间以后，介质上有杂质沉积导致介质颜色改变和蛋白结合能力下降，需对介质进行清洗或再生。?介质清洗：1)用10倍介质体积0.5M NaOH过柱，适当调整流速，或洗脱至10倍介质体积时停30min后继续洗脱，保证介质与NaOH溶液接触时间达到30min以上。2)用10倍介质体积去离子水洗去层析柱中的碱液。3)用10倍介质体积缓冲液A平衡层析柱。?介质再生：1)用25倍介质体积脱镍缓冲液（50mM Na3PO4，300mM NaCl，100mM EDTA，pH 8.0）过柱；2)用5-10倍介质体积0.5M NaOH过柱，适当调整流速，如流速较快，则洗脱至10倍介质体积时停30min后继续洗脱，保证介质与NaOH溶液接触时间达到30min以上；3)用10倍介质体积去离子水洗柱；4)用3倍介质体积10mM Na3PO4，1M NaCl，pH 7.4缓冲液平衡层析柱；5)用3倍介质体积20mM NiCl2或NiSO4(溶于去离子水)过柱；6)用3倍介质体积10mM Na3PO4，1M NaCl，pH 7.4缓冲液洗柱；7)用5倍介质体积缓冲液A平衡层析柱。6.介质保存 48条件下，介质可长期保存于20%乙醇中。7.SDS-PAGE检测：1)不同浓度SDS-PAGE分离胶分离范围 邮编：邮编：201203 电邮：电邮： 电话：电话：[phone] 传真：传真：[phone] 网址：网址：-2-_ 地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路 333 号号 A505 室室 邮编：邮编：201203 电邮：电邮： 电话：电话：[phone] 传真：传真：[phone] 网址：网址： 1.低分子量 Marker；2.上样液；3.纯泰NTA-流穿液；4.纯泰NTA-洗脱液；5.对照-流穿液；6.对照-洗脱液 2)SDS-PAGE操作流程 A.每个胶孔最适蛋白上样量为510g。B.将含510g蛋白的样品溶液与loading buffer混匀，90孵育5min，取出后5000rpm离心1 min。C.上样，15mA/30mA恒流或80V/120V恒压电泳。五、五、E.coli表达表达His重组蛋白包涵体纯化操作说明重组蛋白包涵体纯化操作说明 1.缓冲液配制：?缓冲液E：8 M Urea，100 mM NaH2PO4，100 mM TrisCl，用高浓度NaOH调节pH至8.0。?缓冲液F：8 M Urea，100 mM NaH2PO4，100 mM TrisCl，用高浓度HCl调节pH至6.3。?缓冲液G：8 M Urea，100 mM NaH2PO4，100 mM TrisCl，用高浓度HCl调节pH至4.5。各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45 m滤膜过滤备用。注：注：也可按照可溶性蛋白的缓冲液配制与操作方式进行，只需在缓冲液中加入8M脲或6M盐酸胍。2.样品处理：1)冰上融化冻存菌体，待其完全融化后按每克湿重菌体/5ml缓冲液E的比例充分悬浮菌体。2)室温条件下振摇菌体1560min，通过温和涡旋振荡或超声处理裂解菌体，注意避免产生泡沫。溶液变得透明表明裂解完全。3)4、13000rpm离心15min，收集上清液或用0.45m滤膜过滤，并用高浓度NaOH调节 pH至8.0待上样。3.操作步骤：1)用10倍介质体积缓冲液E平衡亲和柱；2)上样；3)用10倍介质体积缓冲液E过柱，重新平衡介质；4)用10倍柱体积缓冲液F过柱，洗去未结合的杂蛋白；5)用510倍柱体积缓冲液G洗脱，收集洗脱液。6)用10倍柱体积缓冲液A重新平衡介质。注：注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速保持在0.5 ml/min为宜。六、实验实例六、实验实例 1.Ni-NTA Agarose 纯化 His-tag 蛋白?层析介质：纯泰NTA 1ml；对照介质（国际领先品牌）1ml?样品：表达可溶性 His-tag 融合 thioredoxin的大肠杆菌 BL21 裂解液?结合缓冲液：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，pH 8.0?洗脱缓冲液：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM imidazole，pH 8.0?流速：纯泰NTA 1ml，0.5ml/min；对照介质1ml，0.5ml/min 2.Ni-IDA Agarose 纯化 His-tag 蛋白?层析介质：纯泰IDA 1ml；纯泰NTA 1ml?样品：表达 His-tag 融合 thioredoxin 的大肠杆菌 BL21 裂解液?结合缓冲液：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，pH 8.0?洗脱缓冲液：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM imidazole，pH 8.0?流速：纯泰IDA 1ml，0.4ml/min；纯泰NTA 分离胶浓度 分离范围 6%50150kD 8%3090kD 10%2080kD 12%1260kD 15%1040kD 1 2 3 4 5 6 1ml，0.5ml/min 1.低分子量 Marker；2.上样液；3.纯泰IDA-流穿液；4.纯泰IDA-洗脱液；5.纯泰NTA-流穿液；6.纯泰NTA-洗脱液 2 3 4 5 6 1-3-_ 地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路 333 号号 A505 室室 邮编：邮编：201203 电邮：电邮： 电话：电话：[phone] 传真：传真：[phone] 网址：网址： 七、题及解决办法七、题及解决办法 述介质清洗步骤清洗介质；提高离。结合 的 his 标签被包裹在蛋白内部，无法解决进行变性处理，再用介质液 pH 值的影响 不同梯度洗脱在纯化过程中沉淀 温度过低 时环境温度。使用的所有与洗脱液 pH 值接近，产生凝聚 析过程中形成沉淀 性处理；或调整上 值，必要时可调节洗蛋白 断裂或酶解 向平衡缓冲液和洗脱液非常关键，在正事项 8.5的平衡液中。提高上样2)浓度为1%3)中不能含有EDTA和柠檬酸盐，也最好不4)影响对蛋白的吸附2.选择和固定 外，客户可以根据需要自：必须用过滤后的金属离子溶液，2)衡柱子。，4)，再用5)缓冲溶液平衡层析6)，要注意在中性条件下，Fe3+-4-纯化过程常见问 纯化过程常见问1.流速过慢 可能原因：1)柱子堵塞解决方法：按前心转速，增加离心次数或用 0.2m 滤膜过滤，尽可能除去上样液中孔径较大的颗粒物质；添加核酸酶降低样品粘度。2)介质背压过高解决方法：重新装柱2.目标蛋白不能与介质可能原因：1)融合蛋白与介质接触并结合 方法：先将目标蛋白纯化。2)缓冲解决方法：纯化前检查平衡缓冲液、液和样品pH值是否符合本说明书中溶液配制的pH要求。3.蛋白可能原因：1)纯化环境解决方法：适当提高操作2)蛋白不稳定，容易产生集聚效应 解决方法：如有必要，可向纯化各环节缓冲液中加入 0.1TritonX-100、0.1Tween-20 或Mg2+等稳定剂。3)蛋白质等电点解决方法：调整洗脱液 pH 值。4.目标蛋白洗脱失败 可能原因：1)蛋白在层解决方法：纯化前先对蛋白进行变洗脱缓冲液的 pH 值。2)蛋白仍然结合在介质解决方法：检查洗脱液的 pH脱液 pH 值至 4.5。5.洗脱液中含有杂可能原因：1)目标蛋白解决方法：降低纯化温度；中加入1mM PMSF抑制蛋白酶活性，或0.1TritonX-100或0.1Tween-20等稳定剂。2)洗脱缓冲液咪唑浓度的影响 解决方法：洗脱缓冲液中咪唑浓度式大量精制以前，要尽可能多的试用多种洗脱条件。例如，平衡缓冲液中是否加入5mM咪唑；洗脱缓冲液中咪唑在什么浓度下能最大限度提高目标蛋白的纯度。例如洗脱液咪唑浓度可以按10mM、20mM一直到100mM设置，然后是200mM、300mM、400mM、500mM，通过SDS-PAGE、CBB染色检测纯化效果。如果40mM和50mM之间效果较好，那就进一步，设置40mM、42mM、44mM、46mM、48mM、50mM咪唑浓度来进行洗脱。总之，洗脱时咪唑浓度梯度设置应尽量细致。八、进阶知识八、进阶知识 1.纯化过程注意1)样品可溶解在pH5.5缓冲液的pH值，可以增大载量。平衡缓冲液和洗脱缓冲液均加入终的Tween-20等表面活性剂可降低非特异性吸附。缓冲液含-巯基乙醇等还原剂。缓冲液中的去污剂一般不会作用。金属离子的除已螯合镍离子的Ni-NTA行螯合多种金属离子，以最大程度地实现纯化的灵活性。操作方法如下1)固定金属离子防止金属盐在介质上沉淀。用25倍介质体积的纯水充分平3)选择合适的金属离子（Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+Fe3+等），溶解在中性或弱酸性的溶液中，浓度为0.10.3M。如果是Fe3+必须在低pH下螯合（pH3），以防止Fe3+产生沉淀。用25倍介质体积的金属离子溶液上柱不少于5倍介质体积的纯水洗涤层析柱，洗去未螯合的金属离子。（也可将清洗过的未螯合填料直接与金属离子溶液混合，摇床震荡过夜，这样螯合效果更好，Ni-NTA Agarose尤其适合用这样的方法。）用25倍介质体积的起始柱，再上样。如果是螯合铁离子很容易被还原而生成沉淀，所以Fe3+溶液的pH最好是35；螯合Fe3+的色谱柱不能长时间保存在中性溶液中，建议每次用完后都要将螯合的Fe3+用50mM EDTA溶液洗净，下次使用时再重新螯合；也可以将介质浸在50mM的EDTA中过夜后再清洗保存。使用金属螯合层析有一九、特色服务九、特色服务 7)个通常的法则，如果不1.购买指定数量的介质，免费赠送优质层析柱。介质规格 赠品层析柱规格 5ml NTA/IDA Agarose1ml 聚苯乙烯层析柱 1 支 10ml NTA Agarose 5ml 聚苯乙烯层析柱 1 支 25ml NTA Agarose 1ml 及 5ml 聚苯乙烯层析柱各 1 支2.接受委托开了解蛋白的结合特性，建议先选用Zn2+，缓冲液可以选择中性的磷酸盐或者醋酸盐缓冲液，NaCl的含量为0.150.5M，作为起始缓冲液。发各种生物大分子的分离纯化介质特殊要求的介质填料，包括偶联各种指定配体。十、产品目录十、产品目录 产品名称 货号 包装规格 说明 市场价 优惠价 折扣率和配套工艺。3.接受委托合成Ni-NTA Agarose X990005 5ml 600 480 省20%Ni-Nose X990025 TA Agar25ml 2100 1780 省20%Ni-NTA Agarose X990100 100ml 6%交联琼脂糖凝胶，动态载量约25mg/ml，享受配套购买缓冲试剂、层析柱 8 折优惠 6800 5600 省20%Ni-NTA Agarose-200ml 单次购买量-询价-Ni-NTA Columns X992021 21ml 含 2 根 1ml 重力预装柱 500 400 省20%Ni-NTA Columns X992015 含 1 根装柱 900 720 省%15ml 5ml 重力预20Ni-NTA Kit X998215 11ml 15ml 含1根1析柱，及 10 倍浓缩的平衡液、洗脱缓冲液配ml和1根5ml聚苯乙烯层制干粉 1400 980 省30%Ni-IDA Agarose X980005 5ml 450 360 省20%Ni-IDA Agarose X980025 1570 1100 省30%25ml Ni-IDA Agarose X980100 100ml，享受配套购买缓冲试剂、层6%交联琼脂糖凝胶，动态载量约30mg/ml析柱 8 折优惠 4570 3200 省30%Ni-IDA Agarose-200ml 单次购买量-询价-Ni-IDA Columns X982021 21ml 含 2 根 1ml 重力预装柱 500 350 省20%Ni-IDA Columns X982015 含 1 根装柱 800 640 省%15ml 5ml 重力预20_ 地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路 333 号号 A505 室室 邮编：邮编：201203 电邮：电邮： 电话：电话：[phone] 传真：传真：[phone] 网址：网址： -5-