六淀粉样变的诊断和分型进展李剑.pdf

基于质谱蛋白质组学的淀粉样变分型方法基于质谱蛋白质组学的淀粉样变分型方法李剑北京协和医院血液内科淀粉样变是一种机制尚不明的系统性疾病淀粉样变是一种机制尚不明的系统性疾病致淀粉样蛋白:具有反向平行的折叠二级结构伴侣蛋白共沉积 SAP蛋白 ApoE蛋白 Apo A-IV蛋白靶器官损害 沉积效应 直接细胞毒作用疑疑诊淀粉样变的可能诊淀粉样变的可能 非糖尿病性肾病综合征 非缺血性的向心性肥厚的心肌病 不明原因肝大或者胆管酶增高 周围或自主神经病变 不可解释的面部或颈部瘀斑或出血 巨舌如如何诊断？何诊断？病理学诊断 组织活检中发现均质粉染物质 刚果红染色阳性活检部位活检部位阳性率阳性率骨髓60%腹壁皮下脂肪70%唇腺50%舌体80%受累器官(肾-肝-心)90%识别刚果红识别刚果红:荧光荧光 vs 偏振光偏振光类型类型前体物前体物来源来源治疗治疗AL轻链克隆性浆细胞化疗/ASCTAA血清致淀粉样变蛋白A肝脏原发病治疗SSA野生型甲状腺转运球蛋白肝脏对症处理ATTR突变型甲状腺转运球蛋白肝脏肝移植AFib纤维蛋白原链肝脏肝移植AApoA1载脂蛋白A1肝脏/小肠肝移植透析相关2微球蛋白-间断血滤淀粉样变的类型淀粉样变的类型多样多样:刚果红刚果红染色阳性不够染色阳性不够非非AL型并不少见型并不少见Mayo诊所的肾脏淀粉样变亚型分布情况,%英国注册登记研究AL型型 vs.M蛋白蛋白 有M蛋白+是否就是AL型淀粉样变？AL型淀粉样变是否都要有M蛋白+？AL型淀粉样变绝大部分都有型淀粉样变绝大部分都有M蛋白蛋白N=133例AL型淀粉样变 血免疫固定电泳(S-IFE)尿免疫固定电泳(U-IFE)血清游离轻链比(FLCR)至少1个阳性M蛋白蛋白+AL型型心脏淀粉样变性心脏淀粉样变性n=143ATTR(57%)AL(43%)SPEP/IFE/U-IFE+n=76ALn=56ATTRn=20FLCR+n=61ALn=53ATTRn=8组织内淀粉样变蛋白的鉴定方法组织内淀粉样变蛋白的鉴定方法 免疫组化法/免疫荧光法(IHC)免疫电镜荧光法 已知突变基因的DNA测序 质谱法 新鲜组织全蛋白质谱 激光显微切割+质谱 假阴性率高 316例AL型中只有121例有阳性组化结果 商品化抗体种类少 抗体质量影响 蛋白构象变化导致抗体结合位点丧失 假阳性率高-缺乏主导蛋白 组织泛染，-均阳性 标本处理过程中蛋白杂质污染免疫组化法不再推荐用于免疫组化法不再推荐用于AL淀粉样变分淀粉样变分型型 高通量分析 直接显示全部蛋白构成，无需逐一检测各种致病性蛋白 蛋白鉴定不受构象变化影响 鉴定突变型蛋白不依赖于基因检测 利于发现新的致病蛋白种类激光显微切割联合质谱蛋白质组学激光显微切割联合质谱蛋白质组学(LMD/MS)微量蛋白提取微量蛋白提取LMD/MS鉴定亚型有着高特异性和敏感性鉴定亚型有着高特异性和敏感性N部位部位敏感性敏感性特异性特异性备注备注113神经100%100%部分为IHC分型失败病例241心脏98%100%IHC分型成功率为42%321神经100%NA均为IHC失败病例。10例ATTR的LMD/MS分型结果与基因检测完全相符4127肾脏96%NA大部分为IHC失败的病例；发现了新亚型ALect2福尔马林固定后的石蜡包埋组织 回顾性分析 会诊分析 无需新鲜组织冻存显微切割 准确定位出淀粉样变物质沉积区 实现病变与正常组织的准确分离LMD/MS的方法学优化的方法学优化蛋白提取质谱前处理质谱结果分析最佳的蛋白提取液微滤膜使用微波处理加速流程emPAI定量蛋白P积分&D积分的设定1.5h2.5h2h最佳蛋白提取液的确定最佳蛋白提取液的确定最佳蛋白提取液的确定最佳蛋白提取液的确定:0.2%Zwittergent肽段数肽段数蛋白数蛋白数谱图数谱图数 种肽段的蛋白数肽段的蛋白数总的蛋白丰度总的蛋白丰度平均蛋白丰度平均蛋白丰度质质谱结果的解读谱结果的解读:利用利用P积分确定是否为淀粉样变积分确定是否为淀粉样变 P-score(%)=(emPAIamyloid)(emPAItotal)100(emPAIamyloid)=致病蛋白emPAI+各种伴侣蛋白emPAI(emPAItotal)=所有蛋白的emPAI总和 测定20例确诊淀粉样变 vs 18例正常对照标本P积分=5.0:诊断淀粉样变的敏感性100%;特异性83.3%质质谱结果的解读谱结果的解读:利用利用D积分确定是否为何种淀粉样变积分确定是否为何种淀粉样变 D-score=emPAI1st emPAI2ndemPAI1st emPAI1st=丰度最高的致淀粉样变蛋白的emPAIemPAI2nd=丰度次高的致淀粉样变蛋白的emPAI 阳性对照组的D积分=0.320.93D积分=0.3可以确定出丰度最高的致淀粉样变蛋白的致病蛋白PUMCH的的LMD/MS研究研究 2000年1月至2014年6月期间我院确诊的138例系统性淀粉样变患者 有器官肿大和(或)器官功能不全的临床表现 组织活检可见粉染无定形物质沉积，刚果红染色阳性 P积分=5.0&D积分=0.3确定亚型分型组织类型分型组织类型(n=138)分型组织涉及各个脏器 腹壁脂肪最为常见具具体分型结果体分型结果 除了8例分型失败和4例分型不确定外 总体诊断阳性率为91%轻链型淀粉样变最为常见 发现了一些以往少见的淀粉样变性类型脂肪组织是最为容易分型失败的组织类型脂肪组织是最为容易分型失败的组织类型LMD-MS问题问题 蛋白提取量？标本处理过程中的污染问题？一定要有刚果红染色阳性区域？次显微镜下沉积？编号编号LMD/MS诊断诊断周边刚果红染色阴性区域组织周边刚果红染色阴性区域组织LMD/MS结果结果1AL-AL-2AL-AL-3ATTRATTR4AL-AL-5AApoA-II-6AL-7ATTR-8AL-AL-9AL-AL-刚果红染色阴性刚果红染色阴性 否定淀粉样变否定淀粉样变？新鲜新鲜标本的质谱蛋白质学分析标本的质谱蛋白质学分析:Mayo的的脂肪抽吸物研究脂肪抽吸物研究刚果红染色N=95阳性有典型的临床表现N=43阴性N=52阴性(真)无典型临床表现N=32阴性(假)有典型临床表现，其他部位活检证实为淀粉样变N=20标本标本(n=75)MS+MS-CRS+(n=43)376CSR-(N=32)131MS诊断的敏感性88%,特异性96%蛋白提取-MS分析腹壁脂肪抽吸涂片-刚果红染色新鲜标本的新鲜标本的MS:Mayo的的脂肪抽吸物研究脂肪抽吸物研究 比较CRS+vs CRS-患者的MS谱 3种伴侣蛋白的含量明显高于CRS阴性组 至少存在2/3伴侣蛋白+致淀粉样变蛋白诊断淀粉样变 20个CRS假阴性的患者 13/20 MS可以检测到典型的蛋白组成 质谱检测比刚果红染色更为敏感(微量-显微镜不能检测到的淀粉样变沉积物）新鲜标本的新鲜标本的MS:心脏活检物的研究计划心脏活检物的研究计划临床疑诊病例(刚果红染色阴性)比较质谱结果淀粉样变特异性的MS谱包括伴侣蛋白+致病蛋白阴性对照(正常心肌组织)阳性性对照(刚果红染色+)质谱检测质谱检测质谱检测淀粉样变Case 1 女,47y,病程15m 活动性气短,心功能3级 Echo:室间隔增厚,EF 45%,符合浸润性心肌病 血FLC-R:6.5/97,尿IFE:Lambda+cTnI 0.35;proBNP 4687 24h UP 1.32g ALP正常 腹壁脂肪-直肠-齿龈活检均阴性 心肌活检:光镜(-)；刚果红阴性？Case 1 MS结果符合淀粉样变有ApoE,Apo A-IV,和SAP蛋白3种伴侣蛋白+高水平的lambda链P积分=14.6D积分=0.79电镜结果支持淀粉样变电镜结果支持淀粉样变原发性轻链型(lambda链)淀粉样变(Mayo分期3期)累及心脏-肾脏血清IFE/尿IFE/血清FLC局灶型AL免疫荧光或LMD/MS确认为轻链型系统型AL抗浆细胞治疗进一步寻找其他原因活检证实存在刚果红染色阳性考虑不像AL型筛查其他原因是否为系统性病变阳性阴性阴性或不确定阴性阳性阳性AL型淀粉样变的诊断流程型淀粉样变的诊断流程总结总结 质谱蛋白质学方法可以有效地鉴定出系统性淀粉样变的亚型 质谱蛋白质学方法可能比刚果红染色更为敏感，可以有效地诊断出亚显微镜下的沉积物 激光显微切割 vs 新鲜标本的MS鉴定各有优势谢谢关注！谢谢关注！