环境生物技术实验讲义(1).doc

实验一 细菌淀粉酶和过氧化氢酶定性测定
一、实验目的
①了解过氧化氢酶试验的反应原理和用途。
②了解淀粉酶试验的反应原理和用途。
③通过对淀粉酶和过氧化氢酶的定性测定，加深对酶和酶促反应的感性认识。
二、实验原理
酶是微生物机体内生物合成的一种生物催化剂，它是高分子蛋白质，具有催化生物化学反应加速进行，并具有传递电子、原子和化学基团的作用。微生物的酶按它所在细胞的部位分为胞外酶、胞内酶及表面酶。本实验对胞外酶中的两种即淀粉酶和过氧化氢酶(亦叫接触酶)进行定性测定。
细菌淀粉酶能将遇碘呈蓝色的淀粉水解为遇碘不显色的糊精，并进一步转化为糖，淀粉被酶催化分解后用碘检测不到其变色现象；过氧化氢酶能将过氧化氢快速分解为水和氧气，能用肉眼很容易的观测到产生的气泡。
三、实验仪器和试剂
①试管(15mm-150mm)5支、试管架1个、培养皿(90mm)3套、接种环。
②肉膏胨淀粉琼脂培养基(1L) : 蛋白胨 10g、Nacl 5g、牛肉膏 5g、 可溶性淀粉 2g、 琼脂 15g、 蒸馏水定容到1000ml 121℃ 灭菌20min。
③4％淀粉溶液1滴瓶:4g可溶性淀粉加水至100ml
④革氏碘液1滴瓶:碘1g、KI 2g、蒸馏水300ml （将I与KI先行混合，加入蒸馏水少许充 分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。
⑤9％过氧化氢1滴瓶：30％过氧化氢 30ml 蒸馏水 70ml
⑥枯草杆菌和大肠杆菌斜面各一支。
⑦活性污泥
四、实验方法
(一)生活污水活性污泥混合液中淀粉酶的测定
①取3支干净的试管，按1、2、3对照编号。放在试管架上备用。
②在1号、2号试管内分别加入 5ml、10ml的活性污泥混合液，再在1号和2号试管中分别加10 ml和5 ml蒸馏水。在对照管内加15 ml蒸馏水。
③在1号、2号、3号及对照管中分别加入4％的淀粉液4滴(淀粉液的用量，在做预备实验时根据样品中淀粉酶含量多少而定)，迅速摇匀并记下反应的初始时间。
④在上述3个管内分别加4滴碘液(碘液用量在预备实验时酌定)，迅速摇匀，这时各管均呈蓝色。
⑤观察结果。注意各管的变化，记下各管蓝色完全消失时的时间(即淀粉酶和淀粉反应完全的时间)，并对结果进行分析。
(二)细菌淀粉酶在固体培养基中的扩散实验
①将肉膏胨淀粉琼脂培养基加热融化，待冷至45℃左右倒入无菌培养皿内(每皿约10 ml)，共倒3个，静置待冷凝即成平板。
②在无菌操作条件下，用接种环分别挑取枯草杆菌、大肠杆菌和活性污泥各一环分别在3个平板上点种5个点。倒置于37℃恒温箱内过夜培养。
③观察结果，取出碘液，分别在3个平板内菌落周围滴加20ul碘液，观察菌落周围颜色的变化。若在菌落周围有一个无色的透明圈，说明该细菌产生淀粉酶并扩散到基质中去。若菌落周围仍为蓝色，说明该细菌不产生淀粉酶。
(三)过氧化氢酶的定性测定
①将配备的斜面培养基接种枯草杆菌、大肠杆菌37℃恒温箱内过夜培养。
②用滴管吸取过氧化氢滴加入到菌落上，观察菌落是否有气泡。
五、实验报告
把所观察到的现象记录下来，进行分析。
六、思考题
①淀粉酶定性测定中对照应呈什么颜色?为什么?各菌落呈什么颜色?为什么?
②各菌落滴加过氧化氢后呈什么现象?说明什么问题?

实验二 处理生活污水的活性污泥微生物总DNA的提取
一、 实验目的：
①掌握环境样品DNA提取技术。
②掌握琼脂糖电泳的检测原理和方法。
二、 实验原理：活性污泥是一种以好氧性细菌为主体的微生物和水中的悬浮物质、胶体物质混杂在一起形成的肉眼可见的絮状颗粒，它是废水生物处理过程的主体。
环境样品的微生物总DNA的提取和纯化方法主要由两部分组成：1.温和裂解细胞及溶解DNA的技术，包括物理、化学或酶解作用裂解细胞，是DNA释放出来。2.在环境样品DNA得到充分释放后，通常采用几种化学和酶学方法中的任一种来去除杂蛋白、RNA及其他的大分子。
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应使不同大小的DNA分子分离，把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。溴化乙锭（EB）在紫外光照射下发射荧光，EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物。
三、 实验仪器和试剂：
仪器：核酸电泳系统，凝胶成像分析系统，离心机，移液器，水浴锅，涡旋振荡器，EP管。
试剂：
1、0.1%磷酸钠缓冲液（PH 8.0）100ml ：1M Na2HPO4 93.2ml、1M NaH2PO4 6.8 ml，加热配制。
2、溶菌酶。
3、20% SDS 100ml：20g SDS 加灭菌水定容至100ml，加热。
4、70%乙醇：70ml无水乙醇，加灭菌水30ml。
5、TE缓冲液（PH 8.0）：1M Tris-cl 500ul， 0.2M EDTA 250ul，灭菌水49250ul
6、异丙醇，
7、8mol/LKAc溶液：392.56g KAC 加灭菌水500ml，121℃灭菌20min。
8、1kb DNA分子量标准。
9、1%琼脂糖：0.5g 琼脂糖加5ml 10×TBE，45ml水。
10、10×TBE： Tris-base 54g、Boric Acid 27.5g、Na2EDTA 4.65g 加蒸馏水定容至500ml，用HCL调PH 8.3
11、核酸上样缓冲液：10×ladder
四、 实验方法：
1、 取1g活性污泥，离心12000rpm 3min 去上清，灭菌水洗涤2次，10000rpm 3min,去上清。加1ml 0.1mol/L PH8磷酸钠缓冲液,漩涡震荡器震荡20min。
2、 加溶菌酶5mg，使终浓度为2.5mg/ml，振荡5min,37℃水浴30min。
3、 加120ul20%SDS轻柔振荡15min，6000rpm离心10min。
4、 取上清液加0.2倍体积冰冷的8MKAc，颠倒混匀1min，12000rpm离心10min。
5、 吸取上清液移到新的EP管中，加0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混匀1min，室温下放置10min，12000rpm离心10min。
6、 去上清，加1ml 70% 乙醇洗涤DNA 沉淀，12000rpm离心2min，去乙醇后于37℃干燥 10min。
7、 重复做第6步
8、 每管加100 ul TE+400ul灭菌水+0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，12000rpm离心10min。
9、 弃上清液，将沉淀定容于200ulTE缓冲液中，加0.2倍体积8M KAC，颠倒混匀，室温静置5min，12000rpm离心10min。
10、 吸取上清液移到新的EP管中，加0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，12000rpm离心10min。
11、 弃上清液，用1ml 70% 乙醇洗涤DNA 沉淀、12000rpm离心10min，干燥，溶于200 ul TE缓冲液中。
12、 吸取20ul DNA溶液，在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，检测DNA提取效果。加上1kbMaker作为DNA大小的标准。
五、实验报告
把在1%琼脂糖凝胶观察到的现象记录下来，进行分析。
六、思考题
①SDS和乙酸钾的作用?
②不同浓度的琼脂糖凝胶电泳的分辨率?

实验三 微生物总DNA中的16SrDNA PCR扩增技术
一、 实验目的
①了解以通过引物进行16SrDNA PCR扩增的基本原理
②掌握从活性污泥微生物总DNA中进行16SrDNA PCR扩增的方法
二、 实验原理
RCR是一种选择性体外扩增DNA的方法，类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。
在本实验中，PCR扩增的模板是从活性污泥中提取的微生物总DNA，扩增的目的序列是微生物16SrDNA的V3区。采用的引物是细菌的一对通用引物，正向引物338F:5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCG CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’。反向引物518R：5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’。其中，正向引物338F的5’端连接有40bp的GC 发夹，以增加DNA解链区的GC含量，提高解链温度。
三、 实验仪器和试剂
①样品
从活性污泥中提取得到的微生物总DNA。
②仪器及相关用品
PCR扩增仪，琼脂糖凝胶电泳所需的设备，凝胶成像分析系统，移液枪及吸头，PCR管，高速离心机。
③试剂
Taq DNA 聚合酶，10×PCR反应缓冲液，MgCl2 25mmol/L,四种dNTP混合物各为2.5mmol/L。引物：正向引物及反向引物（浓度为25pmol/L），灭菌的去离子水。模板：从活性污泥中提取得到的微生物总DNA，用灭菌的去离子水稀释10倍后用作模板进行PCR扩增。1kbDNA分子量标准：1.0％琼脂糖；核酸上样缓冲液。
四、 实验方法
1. 建立PCR扩增反应体系
PCR扩增反应体系总体积为50ul，向PCR反应管中依次加入以下试剂：10×PCR反应缓冲液5ul；dNTPs 2ul；MgCl25ul；引物各1ul；模板1ul；Taq DNA 聚合酶2.5U; 去离子水35ul。
在做上述实验的同时，以去离子水代替扩增模板做一次阴性对照。
2．设置PCR反应条件
95℃（5min）→ ｛ 95℃（1min）→55℃（1min）→72℃（1min）｝35个循环→72℃（10min）→4℃备用
3.电泳检查结果
PCR反应结束后，取5ul反应液在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，检测扩增产物。DNA上样时，加上DNA分子量标记作为判断PCR产物大小的参照物。
五、 实验报告
1. 简述通用引物进行16SrDNA PCR扩增的基本原理
2. 进行结果和观察、记录与分析。
六、 注意事项
1. 在配制PCR反应体系的过程中，应在加入dNTP混合物后再加入Taq DNA 聚合酶，因为有些酶的3’→5’外切酶的活性较强，如果反应体系中不含dNTP，可能导致引物分解。
2. 应对吸头和PCR管进行高压灭菌，每次操作前必须更换吸头，以免试剂相互污染。
七、 思考题
1. 以细菌通用引物进行16SrDNA PCR扩增的目的是什么？
2. 影响PCR扩增效率的因素有哪些？
3. 如果出现非特异性的DNA条带，可能的原因有哪些？

实验四 土壤中微生物数量的监测
一、实验目的
①学会土壤悬液的稀释方法
②掌握土壤微生物数量的检测方法
二、实验原理
土壤是微生物生活最适宜的环境，它具有微生物所需的一切营养物质和微生物进行生长繁殖及生存的各种条件，所以土壤中的微生物的数量和种类都很多，它们参与土壤中的氮、碳、硫、磷等的矿化作用，使地球上的这些元素能被循环使用。此外，土壤微生物的活动对土壤的形成、土壤肥力和作物生产都有非常重要的作用，因此，查明土壤中的微生物的数量及其组成情况，对发掘土壤微生物资源和对土壤微生物实行定向控制无疑是十分必要的。
三、实验仪器和试剂
1. 培养基
琼脂培养基: 牛肉膏 1g、酵母膏 2g、蛋白胨 5g、NaCL 5g、琼脂 15g、加水定容至1000ml调PH为7．4
查氏培养基：NaNO3 2g 、K2HPO4 1g 、KCl 0.5g 、MgSO4 0.5 g 、FeSO4 0.01g、蔗糖 30 g、 琼脂 15~20 g 、水 1000 mL 、pH 6.7
2. 灭菌稀释水、灭菌吸管、灭菌培养基
3. 土壤样品、天平、称量纸
四、实验方法
1. 取新鲜土壤样品10g，加入90ml无菌水中，塞上灭菌塞子，在摇床上震荡10min，制成土壤悬液。
2. 按10倍稀释法，将上述土壤悬液稀释至10-6。
3. 分别吸取10-2、10-3的稀释土壤悬液0.1ml，至灭菌培养基中。
4. 将加热完全融化后冷却至45℃的查氏琼脂培养基倾入已加有稀释土壤悬液的平皿中约15ml，摇匀后平置，待其固化。
5. 按同样方法吸取10-5、10-6的稀释土壤悬液0.1ml，至灭菌平皿中，倾入营养琼脂。
6. 营养琼脂平板倒置后于28℃培养，查氏平板于25℃培养。
五、实验报告
根据平板上的菌落数与平皿中土壤悬液稀释倍数算得每克土壤中的微生物数量。
六、注意事项
1. 在营养琼脂平板上长出的菌落以土壤中异养细胞占绝对优势，对偶然出现的霉菌和放线菌菌落可根据菌落外现形态特征的差异而将其删除，必要是可挑取菌落培养物制成悬滴标本后加以观察。
2．.查氏培养基含有3％蔗糖，它能抑制大多数细菌的生长，而霉菌和放线菌能忍受高渗透压，故能在这种培养基上生长，所得菌数为霉菌和放线菌的菌数。
七、思考题
1.为什么说土壤是微生物最好的培养基？
2.如何进行土壤中的微生物的分离和计数？
实验八 油烟污染物降解菌的分离
一、 实验目的：
①掌握用稀释平板分离法分离可降解环境污染物的微生物；
②掌握用划线法分离微生物；
③掌握菌体分离的原理和方法。
二、 实验原理：
油烟污染物由多种有害物质组成，不易于降解。但在长期受油烟污染的土壤中存在着降解油烟的降解菌。故以受油烟污染的土壤为菌体来源分离其降解菌。
菌种分离纯化的方法有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法和选择培养分离法等。最常用的为划线法和稀释法。油烟污染物降解菌可在以金龙鱼油为唯一碳源的选择培养基上生长的菌株。为了获得纯种，必须进一步进行分离纯化。
三、 实验仪器和试剂
仪器：培养皿、三角瓶、试管、接种环、涂布棒、磁力搅拌器、恒温培养箱、
试剂：长期受油烟污染的土壤样品（饭店排油烟口的土壤）、金龙鱼油、
①富集培养基（%）：100ml
蛋白胨1.0g，牛肉膏0.4g，KH2PO4 0.3g，MgSO4 0.02g，琼脂1.2g，pH 7.0；
②选择培养基（%）：100ml
金龙鱼油0.4g，KH2PO4 0.3g，NH4Cl 0.2g，MgSO4 0.02g，琼脂1.2g，pH 7.0；
③选择培养基（%）：100ml
金龙鱼油1g，KH2PO4 0.3g，NH4Cl 0.2g，MgSO4 0.02g，琼脂1.2g，pH 7.0；
四、 实验方法：
1、 菌种的筛选：从饭店排烟口附近长期受油烟污染的采样地点采集土样，用小铲去除表土，取离地面7~8cm深的土壤30~50克。从样品中取出10g土样，放入盛有90ml无菌水三角烧瓶中，在磁力搅拌器上25℃加热搅拌约20min，使样品与水充分混合，将细胞分散，形成均匀混合液，静置5min。然后用无菌移液枪从中吸取lml上清液样品，加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混合，震荡均匀。制成10-1、10-2、10-3、不同稀释度的样品液，分别吸取0.1ml样品液均匀涂布到富集培养基上30℃培养48小时。挑选细菌单菌落划线到表面覆盖有金龙鱼油为唯一碳源的选择培养基平板上，倒置于培养箱内，恒温30℃培养48小时。
2、 纯种分离：挑取在选择培养基上长势最好的菌株在加大金龙鱼的浓度的选择培养基表面作有规则的划线，经过多次由点到线的稀释，最后经培养得到单菌落。
五、 实验报告
1、 描述平板内的菌落和菌落数。
2、 实验过程现象的描述和分析。
六、 思考题
1、选择培养基的作用？
2、菌体的分离原理？

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