第一节 间接法测抗体.doc

第一节 间接法测抗体
1. 基本原理
将特异性抗原包被在固相载体上，形成固相抗原，加入待检标本（含相应抗体），其中抗体与固相抗原形成抗原-抗体复合物，再加入酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体，亦称二抗），与上述抗原-抗体复合物结合。此时加入底物，复合物上的酶则催化底物而显色。
2. 试剂与设备
z 纯化抗原。
z 酶标抗体（辣根过氧化物酶标记抗人免疫球蛋白）
z 底物 (邻苯二胺OPD或四甲联苯胺TMB)
z 底物缓冲液（Na2HPO4 0.184g +构椽酸0.047g + H2O10ml + H2O2 5ul）
z PBS（见附录）
z pH9.6碳酸盐缓冲液CBS（见附录）
z 洗液（PBS +0.05%体积的Tween20）
z 稀释液（100ml PBS + 1g牛血清血蛋白）
z 终止液（２mol/L H2SO4）
z 酶标板（聚苯乙烯板）
z 微量加样器
z 吸水纸
z 封口胶带
z 酶标仪
z 洗板机等。
3. 实验步骤
一 予试验
（一）抗原包被的酶标板的制备
１. 以碳酸盐缓冲液将抗原稀释成适当浓度（参考：5ug/ml），加入酶标板（50ul/孔），以胶带封口，于4℃过夜。
２. 弃抗原液，以双蒸水冲洗3次，自然干燥后以胶带封口。此为已知抗原包被的酶标板，备用。
（二）底物浓度的摸索
在底物缓冲液中加入不同量的底物（参考：5mg/10ml），加入酶标板中（50ul/孔），以胶带封口，37℃避光保存2h，在没有明显变色的条件下选择尽可能大的底物浓度。
（三）酶标抗体浓度的摸索 1
用稀释液稀释酶标抗体至适当倍数（参考：40~4000倍），加入已包被抗原的酶标板中（50ul/ 孔），封口后于37℃作用30min。以洗液连续冲洗5次，然后于吸水纸上拍干，加入已摸索好的底物封口后于37℃作用2h，在没有变色的条件下选择尽可能大的酶标抗体浓度。
（四）待测标本浓度的摸索
选择明确为阴性的标本，以稀释液做适当稀释（至少5倍以上，参考：100倍），封口后于37℃作用1h，按上述条件洗板（连续冲洗5次），加入已确定浓度的酶标抗体，再洗板，再加入已确定的底物，选择无明显发色的最大浓度的标本。
二 正式试验
１. 以稀释液将待检标本做适当稀释（予试中确定）加入包被有已知抗原的酶标板中（50ul/孔），加封口胶带于37℃作用30min.
２. 弃反应液，以冲洗液连续洗板5次并于吸水纸上拍干。
３. 加入酶标抗体（浓度在予试中确定）。加封口胶带后于37℃作用30min。
４. 重复第2步.
５. 加底物（浓度在予试中确定），加封口胶带后于室温下避光作用5-60
６. min，其间不时观察，显色满意后加终止液50ul/孔。
７. 于酶标仪测定OD值，OPD用492nm测定，TMB用450nm测定。
注意事项
１. 每次实验均应做阴性对照、阳性对照及空白对照（以PBS代替标本），后者为本底值，在分析实验结果时应扣除本底值，阳性对照>阴性对照>空白对照实验成立。
２. 常规ELISA宜用1%BSA封闭包被有抗原的孔，但经验表明这样做往往会较大程度地降低实验灵敏性，必要时可用含0.05%Tween20的 PBS液代替1%BSA对酶标板进行封闭（４℃过液），通常将各种反应条件予试好，可省略封闭步骤。
３. 将牛乳以滤纸过滤，加等量的PBS可代替稀释液使用。
４. 样本不宜在包被有抗原的酶标板中直接进行稀释，而应另取一块空板将标本稀释后再把标本移到包被有抗原的酶标板中。
５. 手工冲洗时应确保洗液不从孔中溢出，用洗板机冲洗时，应确保各道冲洗头进出洗液通畅。
６. 底物采用OPD较灵敏，但稳定性差，TMB较稳定，但灵敏度稍逊。
７. TMB可配成1%的溶液保存，用底物缓冲液临用时稀释使用，在予试中实际是确定二者配合的比例，确定完毕后可将二者调成等体积的应用液。分装后分别于-20℃冻存，每次使用时取出一对混合后使用，可使用2个月。
８. 阴性对照稍有显色为最佳终止显色时间，这一时间宜控制在10~30min，适当延长（如1h）可稍有增敏作用，时间太短需重摸实验条件。 2
９. 以酶标记抗体详见第二篇。
参考文献
１. Reen DJ. 1994. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Methods Mol Biol. 32:461-6.
２. McLaren ML, Lillywhite JE.1981. Indirect enzyme linked immunosorbent assay (ELISA): practical aspects of standardization and quality control. Med Lab Sci. 38(3):245-51.
３. Khatkhatay MI, Desai M. 1999 A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J Immunoassay. 20(3):151-83.
（刘辉 程桂芝）

第二节 双抗体夹心法测抗原
1. 基本原理
将已知的特异性抗体包被在固相载体上，形成固相抗体，加入待检标本(含相应抗原)，抗原与固相抗体结合成复合物，再加入特异性酶标抗体，使之与已形成的抗原-抗体复合物结合，当加入与酶相应的底物时，酶催化底而显色，根据颜色的有无和颜色的深浅对待测抗原进行定性和定量。
2. 试剂与设备
z 纯化抗待测抗原的抗体（包被用）。
z 酶标抗体（辣根过氧化物酶标记抗待测抗原的抗体）
z 底物 (邻苯二胺OPD或四甲联苯胺TMB)
z 底物缓冲液（Na2HPO4 0.184g + 构椽酸0.047g + H2O 10ml + H2O2 5ul）
z PBS（见附录）
z pH9.6碳酸盐缓冲液CBS（见附录）
z 洗液（PBS +0.05%体积的Tween20）
z 稀释液（100ml PBS +1g牛血清血蛋白）
z 终止液（２mol/L H2SO4）
z 酶标板（聚苯乙烯板）
z 微量加样器
z 吸水纸
z 封口胶带
z 酸标仪
z 洗板机等
3. 实验步骤
一 予试验 3
（一）抗体包被的酶标板的制备
１. 以碳酸盐缓冲液将抗体稀释成适当浓度（参考：5ug/ml），加入酶标板（50ul/孔），以胶带封口，于4℃过液。
２. 弃抗体液，以双蒸水冲洗3次，自然干燥后以胶带封口。此为由已知抗体包被的酶标板，备用。
（二）底物浓度的摸索
在底物缓冲液中加入不同量的底物（参考：5mg/10ml），加入酶标板中（50ul/孔），以胶带封口，37℃避光保存2h，在没有明显变色的条件下选择尽可能大的底物浓度。
（三）酶标抗体浓度的摸索
用稀释液稀释酶标抗体至适当倍数（参考：40~4000倍），加至已包被抗体的酶标板中（50ul/ 孔），封口后于37℃作用30min。以洗液连续冲洗5次，然后于吸水纸上拍干，加入已摸索好的底物封口后于37℃作用2h，在没有变色的条件下选择尽可能大的酶标抗体浓度。
（四）待测样本浓度的摸索
选择明确为阴性的标本，以稀释液做适当稀释（至少5倍以上，参考：100倍），封口后于37℃作用1h，按上述条件洗板（连续冲洗5次），加入已确定浓度的酶标抗体，再洗板，再加入已确定的底物，选择无明显发色的最大浓度的标本。
二 正式式试验
１. 以稀释液将待检标本做适当稀释（予试中确定）加入至包被有已知抗体的酶标板中（50ul/孔），加封口胶带于37℃作用30min。
２. 弃反应液，以冲洗液连续洗板5次并于吸水纸上拍干。
３. 加入酶标抗体（浓度在予试中确定）。加封口胶带后于37℃作用30min。
４. 重复第2步.
５. 加底物（浓度在予试中确定），加封口胶带后于室温下避光作用5-60min，其间不时观察，显色满意后加终止液50ul/孔。
６. 于酶标仪测定OD值，OPD用492nm测定，TMB用450nm测定。
注意事项
１. 每次实验均应做阴性对照、阳性对照及空白对照（以PBS代替标本），后者为本底值，在分析实验结果时应扣除本底值，阳性对照>阴性对照>空白对照实验成立。
２. 包被抗体与酶标抗体都用单克隆抗体时不应采用识别同一位点的单克隆抗体，而应采用识别不同位点的两个单克隆抗体。
３. 包被抗体与酶标抗体如果分别采用单克隆抗体和多克隆抗体时，宜用单克隆抗体作为包被抗体，以多克隆抗体作为酶标抗体。
４. 其它注意事项同酶联免疫间接法。 4
参考文献
１. Reen DJ. 1994. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Methods Mol Biol. 32:461-6.
２. Voller A, Bartlett A, Bidwell DE. 1978. Enzyme immunoassays with special reference to ELISA techniques. J Clin Pathol..31(6):507-20.
（刘辉 程桂芝）

第三节 竞争法测抗原
1. 基本原理
将特异性抗体与固相联结，形成固相抗体，加入待测标本（含相应抗原）和相应的一定量的酶标抗原，待测标本中的抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，待测标本中抗原含量越高，则与固相抗体结合亦越多，使得酶标抗原与固相抗体结合的机会就越少，甚至没有机会结合。加入底物后不显色或显色很浅，显色深者为阴性。
2. 试剂与设备
z 纯化抗待测抗原的抗体（包被用）。
z 酶标抗原（辣根过氧化物酶标记纯化的待测抗原）
z 底物 (邻苯二胺OPD或四甲联苯胺TMB)
z 底物缓冲液（Na2HPO4 0.184g + 构椽酸0.047g + H2O 10ml +H2O2 5ul）
z PBS（见附录）
z pH9.6碳酸盐缓冲液CBS（见附录）
z 洗液（PBS +0.05%体积的Tween20）
z 稀释液（100ml PBS +1g牛血清血蛋白）
z 终止液（２mol/L H2SO4）
z 酶标板（聚苯乙烯板）
z 微量加样器
z 吸水纸
z 封口胶带
z 酸标仪，
z 洗板机等。
3. 实验步骤
一 予试验
（一）抗体包被的酶标板的制备
１. 以碳酸盐缓冲液将抗体稀释成适当浓度（参考：5ug/ml），加入酶标板（50ul/孔），
5
以胶带封口，于4℃过液。
２. 弃抗体液，以双蒸水冲洗3次，自然干燥后以胶带封口。此为由已知抗体包被的酶标板，备用。
（二）底物浓度的摸索
在底物缓冲液中加入不同量的底物（参考：5mg/10ml），加入酶标板中（50ul/孔），以胶带封口，37℃避光保存2h，在没有明显变色的条件下选择尽可能大的底物浓度。
（三）酶标抗原浓度的摸索
选择明确为阴性的标本，加至已包被抗体的酶标板中（50ul/ 孔）；用稀释液稀释酶标抗原至适当倍数（参考：40~4000倍），同时加入酶标板中（50ul/ 孔），混合后封口后于37℃作用30min。以洗液连续冲洗5次，然后于吸水纸上拍干，加入已摸索好的底物封口后于37℃作用30min，在保持有明显变色的条件下选择尽可能小的酶标抗原浓度。
注意事项
１. 每次实验均应做阴性对照、阳性对照及空白对照（以PBS代替标本），后者为本底值，在分析实验结果时应扣除本底值，阳性对照<阴性对照<空白对照实验成立。
２. 一般认为小分子抗原宜用本法检测，而大分子抗原则宜采用夹心法检测，但具体宜采用哪种方法应根据试验决定，本发与夹心法相比在操作上减少一步。包被抗体与酶标抗体如果分别采用单克隆抗体和多克隆抗体时，宜用单克隆抗体作为包被抗体，以多克隆抗体作为酶标抗体。
３. 血清标本中抗原浓度一般较低，故一般用原倍标本进行检测，必要时可进行稀释测定，但应重新摸索酶标抗原的浓度，以确保方法的灵敏性。
４. 以酶标记抗原的方法同酶标记抗体，详细参见第二篇。
５. 其它注意事项同酶联免疫间接法。
参考文献
１. Reen DJ. 1994. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Methods Mol Biol. 32:461-6.
２. Voller A, Bartlett A, Bidwell DE. 1978. Enzyme immunoassays with special reference to ELISA techniques. J Clin Pathol..31(6):507-20.
（刘辉 程桂芝）

第四节 酶联免疫试验的量反应分析
1. 基本原理
不同的酶联免疫方法检测结果的OD值均与标本中待检的抗原或抗体的量相关（间接法和夹心法正相关，竞争法负相关），因此可以利用OD值对标本中的待检物质进行定量分析。 6
标准曲线测定方法
１. 按表1－1配制标准品。
表1－1 配制标准品步骤表
孔号 待检标本量 PBS量 总量(ul) 单位
１ 100 0 100 100
２ 90 10 100 90
３ 80 20 100 80
４ 70 30 100 70
５ 60 40 100 60
６ 50 50 100 50
７ 40 60 100 40
８ 30 70 100 30
９ 20 80 100 20
10 10 90 100 10
2. 将上述样品用新建立的方法进行检测，得到各标本浓度（单位）对应的OD值。
3. 以OD 值为Ｘ轴，标本浓度为Ｙ轴作图。
注意事项
１.一般而论，酶联免疫方法线性范围较窄，如采用曲线拟合或半对数描图可能会增加线性范围。
２.通常，酶联免疫反应曲线是规则的，如果曲线不规则说明实验稳定性差，宜做平行样修正。最好做三平行样取中间值，也可做双平行样 ，取算术平均值，但做双平行样时两个样本检测值相差>20%时宜将该数值全部删除。
３.通过平行样做出的标准曲线，待测样也应同样做平行样进行分析，否则无效。
４.在线性范围内最高值与最低值是 应在５倍以上才能定量分析，否则宜采用质反应资料分析。
５.每次实验均应做标准曲线。
参考文献
１. McLaren ML, Lillywhite JE.1981. Indirect enzyme linked immunosorbent assay (ELISA): practical aspects of standardization and quality control. Med Lab Sci. 38(3):245-51.
２. Engvall E. 1977. Quantitative enzyme immunoassay (ELISA) in microbiology. Med Biol. 55(4):193-200.
（刘辉 程桂芝）
第五节 酶联免疫试验质反应分析
1. 基本原理
根据检测标本OD值，对标本中待测物质做出有或无的判定（即阳性反应或阴性反应）。
2. 判定界值的确定
１. 以阴性对照2.1倍为界值，此法的思想是认为阴性标本的2.1倍处的OD值是线性的中间点，此点比较敏感和稳定。
２. 以（阳性＋阴性）／２为界值，此法的思想是认为在阳性OD值的50%处的变化的最为敏感和稳定，即（OD阳－OD阴）／２的OD值，实际判定的界值还应加上阴性的本底OD值，（OD阳－OD阴）／２＋OD阴＝（OD阳＋OD阴）／２。此法多用于竞争法。
３. 以阴性标本对照的均值加上２个标准差为界值，即Ｘ＋２Ｓ。此法的基本思想是测定值高于Ｘ＋２Ｓ，说明肯定不是零值，应判定为有，即阳性。此法多用于判定有或无其临床意义有重大差别的实验，如病毒抗原、疫苗的抗体反应等。
注意事项
１. 由于酶联免疫方法本身的稳定性和线性都不太理想，因此酶联免疫反应的质反应结果较常采用，有时可参考上述方法将量反应结果转变成质反应结果进行分析，以提高结果的可靠性。
２. 判定界值是根据对照标本作出的，因此每次实验对照标本应足够多（每种对照不应少于3个），以确保实验之间的可比性。
３. 酶标质反应试验检测标本一般不必做平行样，故其实际效率并不低。
参考文献
1. McLaren ML, Lillywhite JE.1981. Indirect enzyme linked immunosorbent assay (ELISA): practical aspects of standardization and quality control. Med Lab Sci. 38(3):245-51.
2. Voller A, Bartlett A, Bidwell DE. 1978. Enzyme immunoassays with special reference to ELISA techniques. J Clin Pathol. 31(6):507-20.
3. Voller A, Bidwell DE, Bartlett A. 1982. ELISA techniques in virology. Lab Res Methods Biol Med. 5:59-81.
（刘辉 程桂芝） 8