RNA提取和Northern blot.doc

模块二 总RNA的提取与Northern杂交
一、总RNA的提取
1. 实验目的
核酸是生物遗传的物质基础，决定生物体的遗传、变异、生长和发育。在基因工程中，核酸分子是主要的研究对象，因此核酸的分离、提取是分子生物学研究中很重要的技术。RNA是用来在转录水平上研究基因的表达与调控机制的载体，它是基因操作的重要对象，纯度高、浓度高、完整性好的RNA为基因的下游操作可以提供良好的保证，RNA的提取是基因工程操作中最常用、最基本的实验技术。
RNA的提取对分子生物学的研究至关重要。纯度高、完整性好的RNA可以用于Northern杂交、mRNA纯化、cDNA文库的构建和体外翻译、RT-PCR等。RNA主要存在于细胞质中，约占75％，另外10％在胞核中，15％在细胞器中。RNA主要包括3种：rRNA占80％~85％；tRNA占l0％~15％；mRNA占1％~5％。
本实验以芜菁直根皮为材料，学习植物基因组织总RNA的快速提取。通过本实验使学生学习掌握甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的方法和技术。
2. 实验原理
RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂硫氰酸胍，可以溶解蛋白质、破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNAase，所以RNA从细胞中释放出来时不会被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过苯酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。
硫氰酸胍—酚—氯仿法提出RNA：硫氰酸胍与β-巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；硫氰酸胍使蛋白质变性，从而释放RNA。
甲醛与谷氨酸残基的单亚氨基基团形成不稳定的碱基配对，这些配对通过阻止链内碱基配对而是RNA维持在变性状态。由于此种配对不稳定且容易被稀释除去，因此只有当甲醛存在于缓冲液或凝胶中时，RNA才能维持在变性状态。
变性消除了二级结构的单链RNA在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率与其大小的对数成正比。
有溴化乙锭存在时，电泳后28SrRNA和18SrRNA应当能清楚地在紫外灯下看到，有时能看到一条由tRNA和5SrRNA组成的、较模糊、迁移较快的带。如果RNA没有被降解，28SrRNA的亮度应当是18SrRNA亮度的1.5-2.0倍，且这两条带都没有弥散现象。mRNA是不可见的，除非过量上样。
3. 实验设备
移液器，tip头， tip头盒、台式高速离心机，研钵，1.5ml离心管 ，三角瓶，磁力搅拌器，试剂瓶，-80℃冰箱，水平凝胶电泳槽，稳压电泳仪，微波炉，50ml三角瓶
4. 实验试剂
RNA提取液： 0.8mol/L盐酸胍，0.4mol/L硫氢酸铵，0.1mol/L醋酸钠（pH5.0），5%甘油，38%Tris-饱和酚。
10×MOPS缓冲液（吗啉代丙烷磺酸，2-(N-morpholino )propane sulfonic acid）：0.2mol/LMOPS，50mmol/L醋酸钠，10mmol/LEDTA。
RNA上样缓冲液：62.5% 去离子甲酰胺，16% 10×MOPS，22%甲醛。
电泳缓冲液：用无菌水稀释10×MOPS，使终浓度为1×MOPS。
其他试剂：琼脂糖，1mg/ml溴乙锭，溴酚蓝，甲醛，β-巯基乙醇，氯仿，异戊醇，75%乙醇，1.2MNaCl，异丙醇，灭菌的ddH2O。
5. 实验步骤
（1）于1.5ml Eppendorf管中加入1ml RNA抽提液、30µl β-巯基乙醇。
（2）用液氮预冷研钵及三角瓶、钥勺，将直根皮放入预冷研钵后，加入液氮，迅速冷冻后快速研磨至粉末状。
（3）迅速用钥勺加粉末于抽提液中，剧烈震荡混匀10分钟。
（4）加入350µl氯仿/异戊醇，剧烈震荡混匀5分钟。4℃、12000rpm离心15min。
（5）取上清液于一新管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，剧烈震荡混匀10分钟。4℃、12000rpm离心10min。
（6）取上清液于一新管中，加入300µl 1.2M NaCl、等体积异丙醇，混匀室温放置10min。
（7）4℃、12000rpm离心10min，弃上清，75%酒精洗沉淀， 4℃、12000rpm离心5min。弃上清，空气干燥10-20 min，加20 µl无菌水溶解沉淀。
（8）用透明胶带将胶板的两端封好。
（9）电泳胶的制备
试剂
用量
琼脂糖(0.8%)
0.16 g
10×MOPS
4.8 ml
水
15.2ml
（10）倒胶：在距底板0.5-1.0 mm的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中（注意不要出现气泡），凝胶厚度在3-5 mm之间。
（11）RNA样品变性：在1.5ml灭菌离心管中加入3.2 ml上样缓冲液，1.3 mlRNA样品，混合震荡，使之充分混匀，手掌离心机离心10s。65℃金属浴5 min ，冰上冷却后，手掌离心机离心10s。
（12）在凝胶完全凝固后（室温下30-40 min），撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有1×MOPS的电泳槽中，轻轻地拔去梳子，且使缓冲液没过胶面约1 mm。电泳槽中的缓冲液最好与制胶所用的缓冲液是同一批次的，若两种缓冲液中的离子强度及pH不一致，将影响核酸的迁移率。
（13）点样：将冷却的变性RNA样品与1 ml溴酚蓝混合后，用微量取样器慢慢将混合物加入上样孔中。
（14）盖上电泳槽并通电，使RNA向阳极（红线）移动。采用65V电压进行电泳。小电泳槽V=50-65v；中电泳槽V=100v；大电泳槽V=150v。
（15）当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后（约半小时），切断电流，取出玻璃板，在紫外灯下观查凝胶。
6. 作业
（1）按要求认真撰写报告，包括实验目的、实验原理、实验材料、实验用品及药品、实验步骤。
（2）如何避免或减少RNA的降解？
7. RNA制备中的关键因素
RNA酶的特点：
（1）存在广泛：尘土、实验器皿、试剂、汗液及唾液当中均有RNA酶（RNase）存在。
（2）活性稳定：耐热、耐酸碱，用水煮沸都不能使其失活，蛋白质变性剂可使之暂时失活，一旦去除变性剂后RNase会恢复其活性。
（3）其发挥活性不需辅助因子：二价离子整合剂不能抑制其活性。
创造无RNase的环境：
（1）避免手、唾液的污染：戴口罩、手套，并经常更换（使用一次性手套）。
（2）空气中的细菌等微生物：在超净台中操作，工作区域应与进行普通微生物实验的区域分隔开来，特别是那些用于细菌接种、培养基和试剂配制的区域，这些区域富含RNA酶。
（3）玻璃器皿的处理：用水清洗干净后，200℃干烤4小时。
（4）塑料用品的处理：尽量使用一次性塑料制品，并高压灭菌。
（5）RNA电泳槽的处理：需用去污剂洗涤，用水冲洗，乙醇干燥，再浸泡于H2O2溶液中10分钟后，用0.1 ％DEPC处理过的水彻底冲洗。
（6）降低RNase活性：尽量在冰浴中操作。
去除内源RNase的污染：
（1）在细胞破碎的同时，RNase也被释放出来，原则上应尽可能早地去除细胞内蛋白并加入RNase抑制剂。
（2）去除蛋白质的试剂：
由于RNase为一种蛋白质，故去除蛋白质的试剂可非特异地抑制RNase的活性。如酚、氯仿，其作用是使蛋白质与核酸解离，同时作为蛋白质变性剂，可以抑制RNase的活性；并且酚与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制；蛋白酶K，与1%~2%的SDS合用其效果更佳；阴离子去污剂，常用的有SDS、十二烷基肌氨酸钠等，可以解聚核酸与蛋白质的结合，并且与蛋白质带正电荷的侧链结合，在高盐存在下形成SDS-蛋白质复合物而沉淀。
（3）解偶剂（胍类）：盐酸胍、异硫氰酸胍。目前认为，异硫氰酸胍是一种RNase最有效的抑制剂。制备RNA时，如果缓冲液中含有异硫氰酸胍，则可在破碎细胞的同时也使RNase失活。异硫氰酸胍有破坏细胞结构、使核酸从核蛋白中解离出来，并对RNase有强烈的变性作用。异硫氰酸胍与β-巯基乙醇（破坏蛋白质的二硫键）合用，使RNase被极度抑制。
（4）低特异性的RNase抑制剂：
DEPC：是很强的核酸酶抑制剂，与蛋白质中的组氨酸的咪唑环结合，使蛋白质变性。因此，凡是不能用高温烘烤的材料皆可用DEPC处理（0.1％溶液浸泡过夜*，然后再用蒸馏水冲净。试剂亦可用DEPC处理，再煮沸l 5分钟或高压以除去残存的DEPC。否则，如不除尽DEPC，它能使嘌呤羟甲基化从而破坏mRNA的活性。另外，注意配制含有Tris的试剂不能用DEPC处理，因为DEFC在Tris中迅速分解。注意：DEPC可能是致癌物，应小心操作。
（5）RNase特异抑制剂：
RNase 阻抑蛋白质（RNasin）：它与RNA酶紧密结合，使其失活。与l mmol／L β-巯基乙醇合用，能发挥最大抑制作用。但不应使用已多次冻融或在氧化条件下保存的抑制剂，因为这会使蛋白质变性，使被结合的RNA酶释放出来。贮存：存放于50％的甘油或5 mmol／L β-巯基乙醇中，-20℃保存。反复冻融，RNasin极易被破坏。
8. 实验结果：

二、Northern杂交
1. 实验目的
在转录水平上研究和了解基因的表达与调控是基因工程操作的重要内容。Northern杂交可以测定总RNA或poly(A)+RNA中特定mRNA分子的大小和表达丰度，RNA分子在变性琼脂糖凝胶中电泳，按其分子的大小分开，然后将RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上，经过自外交联固定，用探针与之杂交，经显影后可以得到待测基因RNA表达水平的情况。
利用Northern杂交可以检测不同生长发育阶段和不同的组织部位相关基因的表达情况。
通过本实验学习Northern杂交基本原理,学习掌握Northern杂交的基本实验步骤和检测方法.
2. 实验原理
要证明外源基因在植物染色体上整合的最可靠的方法是分子杂交，只有经分子杂交鉴定过的植物才可以称为转基因植物。同时也可以利用Northern杂交来检测不同生长发育阶段和不同的组织部位相关基因的表达情况。分子杂交鉴定包括两大部分内容，一是核酸分子杂交，其中又包括Southern杂交及Northern杂交。二是属于蛋白质分子“杂交”的Western杂交。
核酸分子杂交是指非同一分子来源但具有互补序列(或某一区段互补)的两条多核苷酸链，通过Watson—Crick碱基配对形成稳定的双链分子的过程。若其中的一条链被人为标记上，该标记可以通过某种特定方法检出，即成为所谓的探针。
探针与其互补的核苷酸序列杂交后，杂交体也就带上了同样标记，可被检测出来。这样，以特定的已知核酸序列做探针，就可以在诸多的核苷酸序列中，通过杂交探测出与其互补的序列，因而分子杂交是进行核酸序列分析，重组子鉴定，及检测外源基因整合及表达的强有力的手段。它具有灵敏性高、特异性强(可鉴别出20个碱基对左右的同源序列)的特点，是当前鉴定外源基因整合及表达的权威方法。
分子杂交可以在液相及固相中进行。目前实验室中广泛采用的是在固相膜上进行的固一液杂交。根据杂交时所用的具体方法，核酸分子杂交又可分为印迹杂交、斑点(dot)杂交、狭槽(slot)杂交和细胞原位(insitu)杂交等。印迹杂交是一种将核酸凝胶电泳、印迹技术、分子杂交融为一体的方法。被检的RNA分子经琼脂糖凝胶电泳分离后原位转移到固相膜上，杂交液中的探针与印迹到固相膜上的特异片段发生杂交。分子杂交的实验涉及三大内容，即制备杂交探针；制备被检的核酸或蛋白质样品(或标本)；印迹及杂交。
Northern杂交是以DNA或RNA为探针，检测RNA链，用于外源基因转录产物特异mRNA的检测。整合到植物染色体上的外源基因如果能正常表达，在转化植株细胞内将有其转录产物——特异mRNA生成。将提取的植物总RNA或mRNA用变性凝胶电泳分离，不同的RNA分子将按分子量大小依次排布在凝胶上，将它们原位转移到固相膜上，在适宜的离子强度及温度下，探针与膜上同源序列杂交，形成RNA—DNA杂交双链。
通过探针的标记性质可以检出杂交体。根据杂交体在膜上的位置可分析出杂交RNA的大小。若经杂交，样品中无杂交带出现，表明虽然外源基因已经整合到植物细胞染色体上，但在该取材部位及生理状态下该基因并未有效表达。
3. 实验设备
移液器，tip头， tip头盒、手掌型离心机，水浴摇床，X-光片，暗室，摇床，杂交袋，3M滤纸，普通滤纸，尼龙膜，托盘，玻璃板,封口膜，1000克重物，吸水纸，暗盒，保鲜膜，手术刀片，刀柄，水平凝胶电泳槽，稳压电泳仪，微波炉，紫外凝胶呈像系统。
4. 实验试剂
（2）20Х SSC：在800 mL水中溶解175.3 g氯化钠，88.2 g柠檬酸钠，用HCl 调节pH值至7.0，加水定溶至1 L。高压灭菌。
（3）5Х BufferⅠ（pH 7.5）：0.5 mol/L maleic acid，0.75 mol/L氯化钠。
（4）BufferⅡ：10 %（W / V）Blocking。
（5）Buffer Ⅲ（pH 9.5）：0.1 mol/L Tris，0.1 mol/L氯化钠。
（6）预杂交液：7 %（W / V）SDS；50 mmol/L 磷酸钠（pH 7.0）；2 %（W / V）Blocking；5Х SSC；50 ％（V / V）甲酰胺。
（7）0.1 %（W / V）Sodium N-lauroyl Sarcoine。
（8）10 %（W / V）Blocking：用BufferⅠ配置。
（9）鲑精DNA（10 mg / mL）；显影液；定影液。
5. 实验步骤
（1）对提取的总RNA进行含量测定。
（2）根据测定值进行浓度调整。调总RNA浓度至1 μg/μL。
（3）制备大板胶。用15 μg样品进行甲醛变性胶电泳（0.7 %琼脂糖凝胶），电压为50 V，电泳时间为5 hr。
（4）紫外凝胶成像检测电泳效果。
（5）将电泳好的胶，切去上样孔和边缘至合适大小。
（6）托盘中倒入20Х SSC，放置支持物，在支持物上搭建滤纸桥，滤纸桥两端浸于20Х SSC中。滤纸桥用20Х SSC润湿。赶气泡。
双层滤纸
玻璃板
托盘

（7）将胶背面向上置于搭建的滤纸桥上，胶的大小应在玻璃板上的滤纸大小范围内。

反面
正面

（8）在胶上放置与胶等大的尼龙膜和3 MM滤纸。
（9）用玻璃棒或试管轻轻地赶气泡。

（10）封口膜封边，放上叠好的吸水纸（5~8 cm高），压上约1 kg的重物。
（11）转膜过夜后，取出尼龙膜，用铅笔标记，50 ℃烘干30 min。短波紫外线固定30 sec。
（12）变性25 μL鲑精DNA（100 ℃，5 min，之后置于冰上）。
（13）将尼龙膜置于杂交袋内，在杂交袋内加入5 mL预杂交液和变性的鲑精DNA。
（14）尽量排除袋内气泡，使预杂交液均匀分布在膜上，封闭杂交袋。
（15）置于50 ℃恒温水浴中，震荡保温1 hr。
（16）在预杂交袋中加入变性好的探针5 μL，赶气泡、封袋，50 ℃水浴震荡过夜。
（17）杂交完成后，取出尼龙膜，置于2Х SSC，0.1 %SDS中室温震荡5 min。
（18）0.1Х SSC，0.1 % SDS，65 ℃，震荡30 min。
（19）2 Х SSC，0.1 % SDS，0.3 % Tween 20，室温震荡5 min。
（20）封闭液（bufferⅠ: bufferⅡ=1:9），将膜封于杂交袋中，室温震荡45 min。
（21）配置封闭液[含anti-digoxigenin-AP 1 μL（bufferⅠ:bufferⅡ=1:9）]，将膜封于杂交袋中，室温震荡45 min。
（22）2Х SSC，0.1 % SDS，0.3 % Tween 20，室温震荡15 min，两次。
（23）将膜放于一边封口的杂交袋中，滴加显色液（含1 % CDP-star的buffer Ⅲ），去除气泡，黑暗条件下显色5 min。
（24）取出杂交袋后夹在吸水纸中间吸去多余的显色液，封袋。
（25）将封好的膜放入暗盒，在膜上放置X光片，盖好暗盒，曝光45 min。
（26）X光片影液和定影。观察杂交结果。
6. 作业：
（1）按要求认真撰写报告，包括实验目的、实验原理、实验材料、实验用品及药品、实验步骤。
（2）详细阐述Nothern 杂交的基本原理。
（3）Nothern 杂交时注意哪些问题才能够得到好的杂交结果？
7. 实验中应该注意的问题
（1）准确的调节总RNA的浓度，保证上样的质量。
（2）低电压长时间电泳，以保证杂交质量。
（3）转膜时应该使所有的RNA分子都转移到尼龙膜上，才能够保证杂交结果的准确性。
（4）掌握紫外固定的时间，时间过长会造成核酸的断裂。
（5）保证杂交时间和探针的加入量。
（6）保证洗膜的质量，保证杂质的洗脱。
（7）严格控制曝光时间以得到清晰的杂交结果。
8. 实验结果
利用PAL探针检测不同光照时间处理的津田芜菁块根皮中PAL基因的表达情况。Dark、6 hr、12 hr、18 hr、24 hr和48 hr是指黑暗处理条件、恒定光照处理6 hr、12 hr、18 hr、24 hr和48 hr的块根皮。
Dark 6 hr 12 hr 18 hr 24 hr 48 hr
PAL
rRNA

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