DB33∕T 2300-2020 单胞藻规模化培养技术规范(浙江省).pdf

ICS 65.150 CCS B 51 DB33 浙江省地方标准 DB33/T 23002020 单胞藻规模化培养技术规范 Technical specification for large-scale cultivation of microalgae 2020-12-30 发布 2021-01-30 实施 浙江省市场监督管理局 发 布 DB33/T 23002020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本标准由浙江省农业农村厅提出。本标准由浙江省水产标准化技术委员会归口。本标准起草单位：浙江省海洋水产养殖研究所，浙江永兴水产种业有限公司，宁波大学。本标准主要起草人：柯爱英、徐继林、周朝生、肖国强、蔡景波、黄振华、曾国权、胡园、朱洁、吴越、王瑶华。DB33/T 23002020 1 单胞藻规模化培养技术规范 1 范围 本标准规定了单胞藻规模化培养的培养条件和设施、培养方法、日常管理、收获和保存等内容。本标准适用于水产苗种培育和养殖生产中的单胞藻培养。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过规范性文件的引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期的对应版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB 11607 渔业水质标准 NY 5051 无公害食品 淡水养殖用水水质 NY 5052 无公害食品 海水养殖用水水质 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 指数生长期 细胞迅速生长繁殖，藻细胞数量随着培养时间的延长呈几何级数递增的时期。3.2 一级培养 以0.3 L5.0 L广口瓶或三角烧瓶作培养容器，严格消毒，用滤纸封口的培养方式。3.3 二级培养 用容积为50 L100 L白塑料桶、尼龙袋、光生物反应器等作为培养容器，严格消毒，连续充气的培养方式。3.4 三级培养 采用育苗场现有的水泥培养池、帆布池等作为培养容器，消毒，连续充气的培养方式。4 培养条件和设施 4.1 培养用水 海水应符合GB 11607、NY 5052规定。淡水应符合GB 11607、NY 5051规定。4.2 设施设备 DB33/T 23002020 2 主要有蓄水池、沉淀池、过滤池、输水管、保种室、培养池、光生物反应器等设施。场地要求光线明亮，通风条件好，配备显微镜、生物培养箱、空调、冰箱等设备。配套供水、供气、供电设施。4.3 培养容器 一级培养的容器主要有0.3 L5.0 L的三角烧瓶，二级培养主要采用10 L20 L玻璃广口瓶、50 L100 L白色塑料桶、光生物反应器等；三级大面积培养主要采用水泥池、帆布池等。5 培养方法 5.1 器具消毒 5.1.1 高温消毒法 5.1.1.1 培养用的玻璃器皿和金属工具适用于煮沸消毒、烘箱干燥消毒、高压灭菌等高温消毒；5.1.1.2 培养用的充气管、散气石适用于煮沸消毒。消毒的方法见附录 A。5.1.2 化学药品消毒法 5.1.2.1 酒精消毒适用于手、镊子、瓶口的消毒。5.1.2.2 将高锰酸钾、漂白粉或漂白片、盐酸配成溶液适用于玻璃器具、塑料容器、充气管、散气石、玻璃缸、水泥池、管道等消毒。消毒方法见附录 A。5.2 培养用水消毒 5.2.1 加热消毒法 5.2.1.1 一级培养用的水经砂滤、脱脂棉过滤，煮沸 5 分钟10 分钟，冷却后使用。5.2.1.2 二级培养用水经砂滤、250 目筛绢袋过滤煮沸 5 分钟10 分钟，冷却后使用。5.2.2 漂白粉或漂白片消毒 5.2.2.1 容积 50 L100 L 塑料桶，加水后用漂白片消毒，有效氯浓度为 20 mg/L50 mg/L，中和去除余氯后使用。5.2.2.2 水泥池加水后泼洒 80 目过滤过的漂白水，有效氯浓度为 15 mg/L30 mg/L，中和去除余氯后使用。5.2.2.3 光生物反应器直接注入有效氯浓度为 50 mg/L100 mg/L 漂白水消毒，中和去除余氯后使用。光生物反应器长期培养藻类后消毒采用盐酸 1000 mg/L+250 mg/L 次氯酸钠混合消毒液在缓冲罐里，用水泵循环到管道里，消毒混合液可以重复使用。5.3 接种 5.3.1 藻种质量 藻种应无污染，无杂藻、藻细胞无附壁。5.3.2 接种浓度 接种时间宜在早上6：0010：00进行，藻种在指数生长后期，一级培养接种浓度为1：51：10；二级培养接种浓度1：101：50；三级培养根据天气、生产需要来接种，接种浓度1：151：30。5.4 培养条件 水产养殖常用微藻种类生态条件参数见附录B。5.5 培养液 常用培养液配方见附录C、附录D。6 日常管理 DB33/T 23002020 3 6.1 观察与处理 6.1.1 观察 定期显微镜检查，从藻细胞的形态、悬浮、污染情况等了解细胞生长是否正常。注意观察藻液颜色，有无附壁、沉淀、菌膜和敌害生物，如发现异常应立即舍弃，并及时重新接种培养。6.1.2 一级培养 空调控温，光照用日光灯调节，每天摇晃藻种瓶4 次6 次，培养用的消毒水应在5 天7 天用完。6.1.3 二级培养 二级培养室保持采光良好，自然光照或人工光源，用遮光帘或遮阳布等设施，避免太阳光直射，充气量微沸、封口，定期用漂白水培养场所进行消毒。6.1.4 三级培养 控温，用遮光帘或遮阳布等设施，调节光照，充气微沸。6.2 记录和补充培养液 根据藻类的生长状态和对藻类的需求量收获一部分浓藻液，并补充等量的新培养液继续培养。对每次接种、培养液添加进行记录。7 收获和保存 7.1 收获 单胞藻经各培养阶段，最终达到苗种及养殖生产单位所要求的藻种浓度和质量，投喂的单胞藻以处于指数生长期收获。7.2 保存 培养的单胞藻利用500目尼龙筛网富集、暗沉淀、加0.5 g/L1.0 g/L明矾或氢氧化钙收集藻类，冷藏或冷冻保存，以备随时投喂使用。8 技术模式图 单胞藻规模化培养技术模式图见附录E。DB33/T 23002020 4 A A 附 录 A（资料性）单胞藻培养常用消毒方法 单胞藻培养常用消毒方法见表A.1 表A.1 单胞藻培养常用消毒方法 项目名称项目名称 煮沸煮沸 烘箱干燥烘箱干燥 高压灭菌高压灭菌 高锰酸钾高锰酸钾 漂白粉或漂白粉或漂白片漂白片 盐酸盐酸 玻璃容器 5 分钟10 分钟 120 恒温 2 小时 121，维持 20 分钟 浓度 10 mg/L20 mg/L 浸泡 5 分钟10 分钟 浓度 10 mg/L100 mg/L 浸泡 12 小时 盐酸：水 1：11：5 金属工具 5 分钟10 分钟 120 恒温 2 小时 121，维持 20 分钟/塑料容器/浓度 10 mg/L20 mg/L 浸泡 5 分钟10 分钟 浓度 10 mg/L100 mg/L 浸泡 12 小时 盐酸：水 1：11：5 充气管 散气石 5 分钟10 分钟/浓度 10 mg/L20 mg/L 浸泡 5 分钟10 分钟 浓度 10 mg/L100 mg/L 浸泡 12 小时/水泥池 玻璃缸/浓度 10 mg/L20 mg/L 浸泡 5 分钟10 分钟 浓度 10 mg/L100 mg/L 浸泡 12 小时 盐酸：水 1：11：5 光生物反应器、管道/浓度 10 mg/L20 mg/L 浸泡 5 分钟10 分钟 浓度 10 mg/L100 mg/L 浸泡 12 小时 盐酸：水 1：11：5 DB33/T 23002020 5 B B 附 录 B（资料性）水产养殖常用微藻种类生态条件参数 水产养殖常用微藻种类生态条件参数见表B.1。表B.1 水产养殖常用微藻种类生态条件参数 品种 隶属 PH 适温范围（）盐度范围（）光照强度（）三角褐指藻 硅藻门 7.010.0 525 1535 10008000 小新月菱形藻 7.010.0 528 2035 10008000 纤细角毛藻 6.59.5 1040 1030 500015000 牟氏角毛藻 6.59.5 1040 1030 500015000 假微型海连藻 7.010.0 2030 1535 100010000 威氏海连藻 7.010.0 2030 1535 300010000 中肋骨条藻 7.010.0 1025 1040 30007000 等鞭金藻 金藻门 7.09.5 1535 1050 30009000 球等鞭金藻 7.010.0 1035 1050 300010000 叉鞭金藻 7.09.5 935 1050 300015000 绿色巴夫藻 7.09.5 1035 580 300015000 亚心形扁藻 绿藻门 7.010.0 730 1040 100020000 青岛大扁藻 7.010.0 1035 1040 100010000 塔胞藻 7.010.0 730 1040 100020000 小球藻 6.08.5 1036 045 100020000 微绿球藻 7.09.5 1036 436 300020000 栅藻 5.0-7.5 1035 0 1000-10000 DB33/T 23002020 6 C C 附 录 C（资料性）常用海洋微藻培养液配方 常用海洋微藻培养液配方见表C.1。表C.1 常用海洋微藻培养液配方 隶属 培养液配方 成分 一级培养 mg 二级培养 mg 三级培养 mg 金藻门 硝酸钠或硝酸钾 100.00 50.00 20.00 磷酸二氢钾 15.00 10.00 3.00 硫酸亚铁或柠檬酸铁 2.50 2.50 1.5 硫酸锰 0.25 0.25/EDTA 20.00 10.00/尿素/10.00 10.00 维生素 B1 0.1 0.05/维生素 B2 0.0005 0.0005/碳酸氢钠 1.00/消毒水 1 L 1 L 1 L 硅藻门 硝酸钠或硝酸钾 90.00 50.00 20.00 磷酸二氢钾 20.00 4.00 3.00 硫酸亚铁或柠檬酸铁 2.50 2.50 1.5 硫酸锰 0.25 0.25/EDTA 20.00 10.00/尿素/10.00 10.00 维生素 B1 0.1 0.001/维生素 B2 0.0005 0.000008/碳酸氢钠 1.00/硅酸钠 10.00 10.00 10.00 消毒水 1 L 1 L 1 L 绿藻门 硝酸钠或硝酸钾 100.00 20.00 20.00 磷酸二氢钾 20.00 4.00 3.00 硫酸亚铁或柠檬酸铁 2.50 2.50 1.0 硫酸锰 0.25 0.25/EDTA 20.00 10.00/尿素/20.00 20.00 维生素 B1 0.1 0.001/维生素 B2 0.0005 0.000008/碳酸氢钠 1.00/消毒水 1 L 1 L 1 L DB33/T 23002020 7 D 附 录 D（资料性）常用淡水藻类水生 4 号培养液配方 常用淡水藻类水生4号培养液配方见表D.1。表D.1 常用淡水藻类水生4号培养液配方 成分 硫酸铵 mg/L 磷酸氢二钾 mg/L 过磷酸钙 mg/L 硫酸镁 mg/L 氯化钾 mg/L 碳酸氢钠 mg/L 三氯化铁 1%水溶液 土壤浸出液 ml 用量 200 10 30 80 25 100 1滴 0.5 注：土壤浸出液配制：（菜园土1份+2份水）混合摇匀，静止，取上清液。DB33/T 23002020 1 D E 附 录 E（资料性）单胞藻规模化培养技术模式图 单胞藻规模化培养技术模式见图E.1。图 E.1 单胞藻规模化培养技术模式图 一级培养 二级培养 三级培养 将保种室中培养的藻种扩种到0.3 L5 L 的玻璃瓶，用水需经过脱脂棉过滤煮沸，培养液高压灭菌或煮沸。将经过滤培养水烧开注入桶内密封，冷却后加培养液，接种培养。充气管、气石煮沸消毒，培养液煮沸。将经过滤培养水注入桶内，加漂白片有效氯浓度 20 mg/L50 mg/L,充气-停气-密封，12 小时24 小时后充气加硫代硫酸钠中和，加培养液，接种培养。充气管、气石煮沸消毒或漂白精消毒，培养液煮沸。将经过滤水加有效氯浓度 50 mg/L100 mg/L,用水泵注入管道，12 小时24 小时后充气加硫代硫酸钠中和，加培养液和 30 mg/L 碳酸氢钠接种培养。将池子冲洗干净，加经过滤的水到水位 80 cm120 cm,充气泼洒经80 目过滤的漂白粉使水体有效氯浓度达 15 mg/L30 mg/L，用漂白水将池壁和过道淋洗，充气 30 小时60 小时后停气，12 小时24 小时后泼洒硫代硫酸钠，充气 1 小时左右施肥接种。